陳桂花，盧彤巖，趙景壯，林婧楠，任廣明，徐黎明

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306）

傳染性造血器官壞死?。↖nfectious hematopoietic necrosis,IHN）是由傳染性造血器官壞死病毒（infectious hematopoietic necrosis virus,IHNV）引起的一種導(dǎo)致鮭科幼魚高死亡率的病毒病[1,2]，死亡率可高達(dá)100%。世界動物衛(wèi)生組織（Office International Des Epizooties，OIE）將此病列為必須申報的動物疫病，我國將此病列為二類疫病[3]。IHNV 屬彈狀病毒科Rhabdoviridae，諾拉彈狀病毒屬Novirhabdovirus，基因組為單股負(fù)鏈RNA，全長約11 kb，依次編碼六種蛋白，分別為核衣殼蛋白（Nucleocapsid protein，N）、磷酸蛋白（Phosphoprotein，P）、基質(zhì)蛋白（Matrix protein，M）、糖蛋白（Glycoprotein，G）、非結(jié)構(gòu)蛋白（Nonvirion protein，NV）和RNA 聚合酶蛋白（RNAdependent RNA polymerase protein，L）[4]。該病首次于20 世紀(jì)50 年代在美國暴發(fā)，80 年代傳入中國，現(xiàn)已廣泛分布于全球許多國家，對鮭鱒養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失和威脅[5]。目前僅加拿大有IHN 疫苗上市，其他國家仍無疫苗可用。因此研發(fā)一種安全、高效的疫苗對預(yù)防該病尤為重要。

迄今為止，已報道的IHN 疫苗主要有滅活疫苗[6]、減毒活疫苗[7]和重組疫苗，其中重組疫苗包括亞單位疫苗[8]、合成肽疫苗[9]及核酸疫苗[10]。本文通過概述不同類型IHN 疫苗的研究現(xiàn)狀，以期為水產(chǎn)動物疾病疫苗研發(fā)提供參考。

1 滅活疫苗

IHN 滅活疫苗是指將細(xì)胞培養(yǎng)獲得的IHNV，經(jīng)物理或化學(xué)方法滅活制成的疫苗。目前，已研究的IHNV 物理滅活方法為高溫加熱法。Anderson等[6]將100℃和50℃下滅活的IHNV 注射免疫虹鱒Oncorhynchus mykiss 后，能引起虹鱒產(chǎn)生免疫應(yīng)答，但攻毒后免疫保護(hù)力低。IHNV 化學(xué)滅活方法常用甲醛、β-丙內(nèi)酯（C3H4O2，BPL）和二元乙烯亞胺（BEI）等滅活劑滅活。甲醛價格低廉易獲得，是最早用于滅活I(lǐng)HNV 的滅活劑。甲醛在滅活病毒時不僅能與含氨基的核苷酸結(jié)合破壞病毒核酸結(jié)構(gòu)，還能與病毒蛋白質(zhì)的氨基結(jié)合使其變性[11]。滅活溫度對甲醛滅活I(lǐng)HNV 的滅活時間和免疫保護(hù)效果均有影響，隨著滅活溫度的升高，滅活時間縮短，免疫保護(hù)效果更有效。如Nishimura 等[12]以0.2%甲醛在4℃滅活I(lǐng)HNV 6 d，免疫虹鱒后保護(hù)率為20%～30%；Tang 等[13]和高欣等[14]用0.2%的甲醛分別在25℃和37℃滅活24 h，免疫虹鱒后相對保護(hù)率分別為79.1%和85%。相對于甲醛，BPL 和BEI 在滅活病毒時主要作用于病毒的核酸堿基，故病毒蛋白質(zhì)不被破壞，不損壞病毒的免疫原性[15]。近年來，BPL 被廣泛應(yīng)用于IHN 滅活疫苗的研制中。BPL 濃度影響B(tài)PL 滅活I(lǐng)HNV 的免疫效果。魏文燕等[16]分別用0.08%BPL、0.09%BPL 和0.1%BPL 滅活I(lǐng)HNV 免疫虹鱒后，BPL 終濃度為0.1%時相對保護(hù)率為68%，免疫效果最佳。Anderson 等[6]和Tang 等[13]分別用2.7 mmol/L 和0.01%BPL 滅活I(lǐng)HNV 24 h 后免疫虹鱒，相對保護(hù)率均高于90%，且免疫保護(hù)性可持續(xù)56 d。迄今為止，關(guān)于BEI 滅活I(lǐng)HNV 的研究較少，僅有Anderson 等[6]和Tang 等[13]分別在0.02%BEI 32℃48 h 和1.5 mmol/LBEI 37℃48 h 的滅活條件下滅活I(lǐng)HNV，免疫虹鱒后相對保護(hù)率為83.33%和80%。綜上可見，這三種滅活劑滅活I(lǐng)HNV 時，BPL滅活苗的免疫效果較好，免疫保護(hù)率較高。

2 減毒活疫苗

IHN 減毒活疫苗指用IHNV 毒力減弱的毒株制成的一類可誘導(dǎo)魚體產(chǎn)生細(xì)胞免疫抵抗外源IHNV感染的疫苗[17]。目前，IHNV 減毒株主要通過細(xì)胞連續(xù)傳代培養(yǎng)、應(yīng)用單克隆抗體篩選和基因重組構(gòu)建等方法獲得。如Tebbit 等[7]、Sandra 等[18]和Ristow等[19]通過連續(xù)細(xì)胞傳代分離純化獲得IHNV 弱毒株，用其免疫虹鱒均能抵抗IHNV 的感染，免疫后120 d 仍對魚體具有保護(hù)作用，且血清中和抗體效價最大值可達(dá)1280。Roberti 等[20]利用IHNV 的中和性單克隆抗體分離篩選出兩株弱毒突變體RB-1 和193-110-4，免疫虹鱒14 d 后用同源野生毒株攻毒，相對保護(hù)率為12%～65%。隨著分子免疫學(xué)與基因工程技術(shù)的迅猛發(fā)展，利用基因重組技術(shù)研發(fā)出了新型減毒活疫苗[21]。Romero 等[22]應(yīng)用反向遺傳學(xué)方法獲得重組減毒株rIHNV-Gvhsv-GFP，可同時誘導(dǎo)產(chǎn)生抗IHNV 和病毒性出血性敗血癥病毒（Viral hemorrhagic septicemia virus,VHSV）的保護(hù)性反應(yīng)。Rouxel 等[23]通過調(diào)整IHNV N 基因和G 基因在整個基因組的次序構(gòu)建了8 個重組減毒株，僅有N2G3、N2G4、N3G4 和N4G1 的毒力明顯減弱，其中用N2G3 免疫虹鱒后可誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平抗體，相對保護(hù)率可達(dá)86%。吳洋等[24]應(yīng)用反向遺傳學(xué)技術(shù)對IHNV NV 蛋白的第32～35 位氨基酸進(jìn)行重組，拯救出兩種減毒株rIHNV-NVQ32-35 和rIHNV-NVT32-35，其復(fù)制能力均低于野生型毒株，免疫虹鱒后，累計死亡率分別為60%和55%。Chen 等[25,26]利用IHNV G 基因和載體（pBlueScript II-IHNV-HLJ-09）成功構(gòu)建了重組二價IHNV 減毒株（rIHNV-N438AΔNV-VP2），免疫虹鱒后能抵抗同源IHNV 毒株和sp 血清型IPNV 毒株的感染，相對保護(hù)率分別為84.6%和88.9%。

傳統(tǒng)IHN 減毒疫苗和新型IHN 疫苗均具有減毒活疫苗的特點，即擁有較好的免疫原性、免疫周期長和恢復(fù)原始毒力的潛在可能[27]。相較于傳統(tǒng)IHN 減毒疫苗，新型減毒疫苗制備周期短且在自然條件下毒力穩(wěn)定，故近年來，隨著對IHN 預(yù)防的不斷深入，發(fā)現(xiàn)了一個新的研究熱點：應(yīng)用反向遺傳學(xué)的方法重組構(gòu)建IHNV 減毒株，促進(jìn)了減毒疫苗向多價減毒疫苗發(fā)展。

3 重組疫苗

3.1 亞單位疫苗

IHN 亞單位疫苗指將IHNV 的抗原基因在不同表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)所獲得的特定蛋白質(zhì)制成的疫苗[28]。Engelking 等[29]用一種野生型IHNV 毒株RB1 的G蛋白免疫虹鱒，可抵抗同源性或異源性IHNV 毒株的感染。Oberg 等[30]利用大腸桿菌E.coli 表達(dá)含有IHNV N 蛋白的trpE 融合蛋白免疫虹鱒后，無法誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫保護(hù)反應(yīng)。將該融合蛋白與含G 蛋白的細(xì)菌裂解液共同免疫虹鱒時，免疫保護(hù)反應(yīng)明顯增強，證明了IHNV G 蛋白可誘導(dǎo)魚體產(chǎn)生免疫保護(hù)反應(yīng)。此后，關(guān)于IHN 亞單位疫苗的研究多以表達(dá)G 蛋白為基礎(chǔ)，利用不同的表達(dá)載體制備IHN亞單位疫苗。Cain 等[31]利用昆蟲細(xì)胞SF9 表達(dá)的重組IHNV G 蛋白，可誘導(dǎo)虹鱒產(chǎn)生低水平的中和抗體，在一段時間內(nèi)保護(hù)虹鱒免受IHNV 的感染。Simon 等[8]用新月柄桿菌Caulobacter crescentus 表達(dá)的含IHNV 截短G 蛋白的融合蛋白，免疫虹鱒后相對免疫保護(hù)率可達(dá)26%～34%。Verjan 等[32]利用大腸桿菌表達(dá)獲得了可溶性重組IHNV G 蛋白，該蛋白可誘導(dǎo)虹鱒產(chǎn)生以IFNs 介導(dǎo)的先天性免疫反應(yīng)，相對保護(hù)率為70%。Zhao[33]等利用酵母表面展示技術(shù)成功地將IHNV G 蛋白展示在釀酒細(xì)胞表面制成口服疫苗，誘導(dǎo)魚體產(chǎn)生粘膜免疫反應(yīng)，相關(guān)免疫因子表達(dá)上調(diào)，相對保護(hù)率為45.8%。代靜等[34]成功獲得了一種攜帶有IHNV G 基因的轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii，灌胃免疫小鼠后，可刺激小鼠體內(nèi)的CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞增加，以期通過后期進(jìn)一步研究制成一種安全、有效的口服疫苗。

目前，已報道的用于IHN 亞單位疫苗生產(chǎn)的表達(dá)系統(tǒng)有大腸桿菌、昆蟲細(xì)胞SF9、新月柄桿菌、釀酒酵母細(xì)胞等。用它們表達(dá)的重組G 蛋白免疫后，均能誘導(dǎo)虹鱒產(chǎn)生免疫保護(hù)性反應(yīng)，但保護(hù)效果偏低。未來可通過添加適當(dāng)?shù)淖魟﹣碓鰪娖涿庖咴裕赃_(dá)到更優(yōu)的免疫效果。

3.2 合成肽疫苗

合成肽疫苗指將具有免疫保護(hù)力的人工合成肽與適當(dāng)?shù)妮d體結(jié)合后，加入佐劑制成的疫苗[21]。目前，關(guān)于IHN 合成肽疫苗的研究較少。Emmenegger 等[9]根據(jù)IHNV G 基因的核苷酸序列合成了三種肽（P27、P226 和P268），將其分別與BSA 和MAP8載體偶聯(lián)制成六種合成肽疫苗，免疫虹鱒后，均能識別IHNV，但識別率低，僅用P286+MAP8 免疫后血清具有中和IHNV 的作用。研究表明：肽段與IHNV 的重新編碼率較低，僅有少量的抗體結(jié)合。迄今為止，IHN 合成肽疫苗仍處于實驗研究階段，需進(jìn)一步探討其免疫機制和構(gòu)建機理。

3.3 DNA 疫苗

G 基因是IHNV 的主要抗原表位基因，能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體，刺激細(xì)胞免疫應(yīng)答，能有效免疫保護(hù)鮭鱒魚[35,36]。目前IHN DNA 疫苗主要通過將IHNV G 基因?qū)氩煌d體構(gòu)建成重組質(zhì)粒。根據(jù)具有的抗原基因種類，IHN DNA 疫苗可分為單價DNA 疫苗和多價DNA 疫苗。

3.3.1 單價DNA 疫苗

近些年，IHNV DNA 疫苗研究已取得了突破性的進(jìn)展，根據(jù)其免疫接種方式可分為注射疫苗和口服疫苗。

注射疫苗：1996 年，Anderson 等[37]首次構(gòu)建了以CMV 為啟動子的IHNV DNA 疫苗。Corbeil 等[35]利用IHNV WRAC 株的G 基因構(gòu)建了pIHNVw-G疫苗。從1999 年開始，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了大量研究。LaPatra 等[38]和Purcell 等[39]研究發(fā)現(xiàn)，用低劑量的DNA 疫苗可保護(hù)體質(zhì)量2～160 g 的虹鱒免受IHNV 的危害。Kurath 等[40]研究發(fā)現(xiàn)，用該疫苗免疫虹鱒3 個月仍能在血清中檢測到中和性抗體，且免疫保護(hù)率高達(dá)100%。Corbeil 等[41]發(fā)現(xiàn)，肌肉注射和皮內(nèi)基因槍注射免疫虹鱒的保護(hù)效果明顯優(yōu)于浸泡和口服等免疫方式。2005 年加拿大批準(zhǔn)該疫苗商品化，成為第一個上市的IHN DNA 疫苗[42]。2011 年P(guān)e?aranda 等[43]分別用U、M基因型IHNV 毒株的G基因構(gòu)建成DNA 疫苗（PM、PU），免疫虹鱒后均能抵抗這兩種基因型毒株的交叉感染和單獨感染。隨著對IHN DNA 疫苗的廣泛研究，其引發(fā)的潛在安全性問題也備受關(guān)注，并進(jìn)行了相應(yīng)改良的研究。Alonso 等[44]于2003 年首次構(gòu)建了含虹鱒自身干擾素調(diào)節(jié)因子1A（IRF1A）啟動子的特殊表達(dá)載體（pIRF1A-G），用其免疫虹鱒后較pCMV-G 更安全。隨后，Alonso 等[45]將可誘導(dǎo)宿主細(xì)胞程序性死亡的M 基因[43,44]分別克隆到pIRF1A-G 和pCMV-G 質(zhì)粒上構(gòu)建成新型自殺性DNA 疫苗。該類疫苗的獨特性是具有IRF1A 和MT 2 個啟動子，其中MT 可誘導(dǎo)M基因的表達(dá)，使含DNA 疫苗的細(xì)胞調(diào)亡，消除殘留的疫苗。這些研究消除了消費者對使用疫苗后的魚體的擔(dān)憂，同時開啟了核酸疫苗的安全性的新思路。

近年來，我國對IHN DNA 疫苗也進(jìn)行了大量研究。徐黎明等[10]于2017 年將中國流行株的G 基因連接到優(yōu)化后的pcDNA3.1 真核表達(dá)載體構(gòu)建成DNA 疫苗（pIHNch-G）[46]，免疫60 d 后仍能產(chǎn)生保護(hù)反應(yīng)，相對保護(hù)率可達(dá)90%以上。李淵等[47,48]在此基礎(chǔ)上對該疫苗免疫的虹鱒和養(yǎng)殖水環(huán)境進(jìn)行長期監(jiān)測，結(jié)果表明：該疫苗對魚體和養(yǎng)殖環(huán)境安全。何琦瑤等[49]于2019 年在真核表達(dá)載體pVAX1 上構(gòu)建了IHN 核酸疫苗（pVAX1-G）。用該疫苗注射免疫虹鱒21 d 后谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和堿性磷酸酶（ALP）活性等血清生化指標(biāo)與對照組明顯不同，表明該疫苗可減輕IHNV 對虹鱒的肝臟、腎臟和肌肉組織的損壞程度，免疫保護(hù)率可達(dá)78%。

口服疫苗：口服免疫方便、不受魚體大小的限制且免疫后魚體應(yīng)激反應(yīng)小[50]，近年來，IHN 口服疫苗越來越熱門。目前，已報道的IHN 口服疫苗的來源有PLGA、藻酸鹽微球。Adomako 等[51]將質(zhì)粒pCDNA-G 和PLGA 混合制成納米顆粒（PLGA-PCDNA-G），投喂虹鱒后，第96 h 時即可在魚后腸上皮細(xì)胞中檢測到這種納米顆粒，相對保護(hù)率為11%～22%。Ballesteros[52]等將pIRF1A-G DNA 質(zhì)粒包埋于藻酸鹽微球中制成口服疫苗，高劑量投喂虹鱒，在免疫30 d 后的相對保護(hù)率為56%。

3.3.2 多價DNA 疫苗

Einer-Jensen 等[53]研究發(fā)現(xiàn)：對虹鱒同時注射免疫VHSV 和IHNV DNA 疫苗，接種后可抵抗單一病毒感染和兩種病毒聯(lián)合感染，這一發(fā)現(xiàn)開啟了IHN 多價DNA 疫苗研究的新章程。隨著生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，Xu 等[54]于2017 年成功構(gòu)建了抗IHN 和傳染性胰臟壞死?。╥nfectious pancreatic necrosis,IPN）的二價核酸疫苗（pCh-IHN/IPN）。用1.0 μg 該疫苗肌肉注射免疫虹鱒可抵抗高毒力IHNV 毒株的感染（RPS＞90%），明顯降低頭腎中IPNV 的病毒載重。最重要的是，該疫苗對IHNV 和IPNV 交叉感染具有顯著的保護(hù)作用，累積死亡率低于6.67%。IHN 多價DNA 疫苗經(jīng)一次注射免疫后可同時抵抗兩種或兩種以上病毒的感染，減少了多次注射免疫對魚體的傷害，并便捷用于生產(chǎn)實踐。IHNV、VHSV 和IPNV三種病毒的聯(lián)合感染使全球鮭鱒養(yǎng)殖業(yè)遭受了巨大損失，研發(fā)多價DNA 疫苗對鮭鱒養(yǎng)殖業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展極為重要。

目前，用于構(gòu)建IHN DNA 疫苗的啟動子有CMV 和IRF1A，表達(dá)載體有pcDNA3.1 和pVAX1。其中最常見的是用CMV 和pcDNA3.1 構(gòu)建IHN DNA 疫苗，但含IRF1A 啟動子的疫苗更為安全。對比發(fā)現(xiàn)：注射性疫苗的保護(hù)效果明顯優(yōu)于口服疫苗，但口服疫苗對虹鱒幼魚更有實際意義。綜上所述，IHN DNA 疫苗具有安全、高效、成本低廉、易于批量生產(chǎn)及免疫劑量少等優(yōu)點，但DNA 疫苗在生產(chǎn)實踐中推廣仍存在爭議。

3.4 活載體疫苗

IHN 活載體疫苗是將IHNV G 基因重組到無毒力的細(xì)菌或病毒基因上，再接種到魚體表達(dá)重組蛋白，誘發(fā)機體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)。Noonan Brian等[55]將含有VHSV 及IHNV 的抗原表位基因G 穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)入殺鮭氣單胞菌Aeromonas salraonicida的無毒株A440 中，用活菌苗免疫虹鱒后，可增強其對VHSV 及IHNV 免疫保護(hù)作用。李守湖等[56,57]成功構(gòu)建了含IHNV G 基因的重組腺病毒質(zhì)粒，與牛奶-海藻糖凍干保護(hù)劑1∶1 混合凍干后制成活載體疫苗。研究發(fā)現(xiàn)該疫苗安全，浸泡免疫虹鱒后，魚體內(nèi)的免疫因子明顯上調(diào)，保護(hù)率可達(dá)100%，免疫期可持續(xù)6 個月。

綜上所述，用殺鮭氣單胞菌和腺病毒構(gòu)建的IHN 活載體疫苗免疫虹鱒后均可同時誘導(dǎo)魚體產(chǎn)生體液免疫、細(xì)胞免疫和粘膜免疫。未來，針對IHN活載體疫苗，可圍繞應(yīng)用不同的無毒或弱毒載體構(gòu)建活載體疫苗及其免疫效果和安全性評價進(jìn)行研究。

4 展望

近年來，IHN 的暴發(fā)嚴(yán)重制約了鮭鱒養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。為了有效防控IHN 的暴發(fā)，進(jìn)行了大量關(guān)于IHN 疫苗的研究。盡管如此，大多數(shù)IHN 疫苗研究目前仍停留在實驗室水平，并沒有商業(yè)化投入市場，僅有IHN DNA 疫苗（Apex-IHN）在加拿大被批準(zhǔn)上市。徐黎明等[5]構(gòu)建的IHN DNA 疫苗（pIHNch-G）在黑龍江省已完成中間試驗，提交了環(huán)境釋放申報材料。IHN 核酸疫苗的注射免疫方式的可操作性較低，特別是對小魚的免疫，費時費力。因此，應(yīng)加強魚用口服疫苗的研究，解決魚用疫苗免疫難的問題。為了保證免疫效果，開發(fā)不同疫苗產(chǎn)品，采用兩種及兩種以上的疫苗來聯(lián)合應(yīng)用，如在早期進(jìn)行口服疫苗，然后再進(jìn)行注射免疫，實現(xiàn)IHN 的全面防控，為鮭鱒養(yǎng)殖業(yè)綠色生態(tài)、健康可持續(xù)發(fā)展提供保障。