曹鈺晗，李紫騰，張靜怡，張靜娜，胡同樂，王樹桐，王亞南，曹克強(qiáng)

我國蘋果斑點(diǎn)落葉病菌攜帶dsRNA分析及一種dsRNA病毒的鑒定

曹鈺晗，李紫騰，張靜怡，張靜娜，胡同樂，王樹桐，王亞南，曹克強(qiáng)

河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，河北保定 071001

【目的】蘋果斑點(diǎn)落葉病在我國各蘋果主產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，給蘋果產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。蘋果斑點(diǎn)落葉病是由鏈格孢蘋果?；停╢. sp.）侵染引起的一種氣傳病害。本研究旨在探明我國蘋果斑點(diǎn)落葉病菌攜帶dsRNA的情況，為田間防治斑點(diǎn)落葉病提供新的生防資源，并為病毒的多樣性以及進(jìn)化研究提供新的認(rèn)識?！痉椒ā繌娜珖?個省份采集有典型癥狀的組織樣本，通過組織分離和單孢分離法獲得純培養(yǎng)；通過dsRNA的提取及凝膠電泳明確我國蘋果斑點(diǎn)落葉病菌攜帶dsRNA的情況；通過菌株培養(yǎng)特性、菌絲生長速率、在果實(shí)及葉片上的致病力測定揭示攜帶dsRNA病原菌的生物學(xué)性狀；通過高通量測序技術(shù)、分子克隆技術(shù)對QY-2菌株攜帶的dsRNA病毒進(jìn)行全基因組序列、基因組結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)進(jìn)化分析?！窘Y(jié)果】自我國蘋果產(chǎn)區(qū)獲得102株蘋果斑點(diǎn)落葉病菌菌株的純培養(yǎng)，通過dsRNA的提取及凝膠電泳明確了5個菌株帶有明顯的dsRNA條帶，攜帶的dsRNA分為4種類型，類型I（菌株YT-3-7）dsRNA在8、2.5和1.5 kb左右；類型II（菌株SJZ-4）dsRNA在8 kb左右；類型III（菌株QY-2）dsRNA在3和0.8 kb左右；類型IV（菌株CL-2-6和SQ-1-1）dsRNA在2.5和1.5 kb左右。含有dsRNA的菌株培養(yǎng)性狀多樣，菌落特征、生長速率與dsRNA攜帶與否及類型沒有明顯的關(guān)系，含有dsRNA的菌株大多屬于弱致病力菌株。QY-2在葉片和果實(shí)上的致病力均最弱，確定其攜帶的dsRNA病毒基因組包括5個dsRNA片段，分別為dsRNA1—dsRNA5，片段大小依次為3 665、3 054、2 824、2 819、831 nt，提交至GenBank，登錄號分別為MK672910、MK672913、MK672912、MK672911、MK836314。編碼蛋白的分子量依次為124、83、84、83、13 kD。經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析，與chrysovirus 1遺傳關(guān)系最近，確定其為產(chǎn)黃青霉病毒科（）、產(chǎn)黃青霉病毒屬（）的chrysovirus，暫定命名為chrysovirus 2（AaCV2）。【結(jié)論】我國蘋果斑點(diǎn)落葉病菌攜帶dsRNA群體多樣，dsRNA的有無及類型與寄主病原菌培養(yǎng)性狀沒有明顯相關(guān)性，攜帶dsRNA的菌株多為弱致病力菌株，致病力最低的QY-2菌株攜帶AaCV2。該菌株的弱致病力可能具有潛在的應(yīng)用價值，可為蘋果斑點(diǎn)落葉病提供新的生防資源。

蘋果斑點(diǎn)落葉??；鏈格孢蘋果?；停籨sRNA；生物學(xué)性狀；致病力；生物防治

0 引言

【研究意義】蘋果斑點(diǎn)落葉病（apple Alternaria blotch）又稱褐紋病，是由鏈格孢蘋果?；停╢. sp.）侵染而引起的一種世界性分布?xì)鈧鞑『Γ摬∥：μO果葉片、新梢和果實(shí)，嚴(yán)重影響蘋果生產(chǎn)[1-2]，現(xiàn)已成為亞洲國家蘋果產(chǎn)區(qū)的主要病害[3-4]。目前，蘋果斑點(diǎn)落葉病的防治途徑主要包括種植抗性品種、化學(xué)防治和生物防治，生產(chǎn)上一直以使用化學(xué)藥劑防治為主[5-7]，但隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們開始關(guān)注食品安全和環(huán)境問題，一些化學(xué)殺菌劑的使用已在發(fā)達(dá)國家和地區(qū)受到了嚴(yán)重限制[8-9]，生物防治日益受到人們的關(guān)注，利用攜帶病毒的弱毒株引起病原菌群體致病力衰退，將成為真菌病害生物防治的新途徑[10-11]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】真菌病毒是指能夠侵染真菌并在其中完成自我復(fù)制的病毒。真菌病毒的分類依據(jù)主要有兩個，首先依據(jù)真菌病毒的核酸類型將其分為DNA病毒和RNA病毒，就目前所發(fā)現(xiàn)的真菌病毒而言，大多數(shù)為RNA病毒，包括雙鏈RNA（dsRNA）和單鏈RNA（ssRNA）[12-13]。從具有弱毒特性的病毒入手尋求新的生防因子，對深入了解病毒及其對寄主真菌的影響具有重要意義。鏈格孢屬真菌中也發(fā)現(xiàn)了很多真菌病毒，1988年，Shepherd[14]從棉花種子中分離出鏈格孢菌株共21個，其中6株攜帶真菌病毒，且這6株均不產(chǎn)生色素；1997年，ZABALGOGEAZCOA等[15]從茄鏈格孢（）中檢測到未經(jīng)包被的兩條大小分別為8.3和5.5 kb的dsRNA；1988年，Hayashi等[16]研究的12個鏈格孢日本梨致病型（Japanese pear pathotype）菌株中，有7個菌株含有dsRNA；2009年，Aoki等[17]從鏈格孢菌株EGS 35-193中分離到virus 1（AaV1），該病毒使菌株的菌絲生長變得異常，并且出現(xiàn)大量的囊泡結(jié)構(gòu)；2015年，LIN等[18]從長柄鏈格孢（）HN28中發(fā)現(xiàn)dsRNA virus 1（AlRV1），其分類地位尚未明確；2016年，Komatsu等[19]從喬木鏈格孢（）中發(fā)現(xiàn)一個新的維多利亞病毒victorivirus 1（AaVV1）；ZHONG等[20]從蕓薹生鏈格孢（）中發(fā)現(xiàn)病毒fusarivirus 1（AbFV1）；2017年，向均[21]從鏈格孢日本梨致病型中分離出病毒virus 1（ABRV1）；2018年，日本學(xué)者OKADA等[22]從鏈格孢日本梨致病型中分離出病毒chrysovirus 1（AaCV1）。AaCV1損害宿主真菌的生長，同時影響宿主AK毒素的產(chǎn)生?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，已報(bào)道了多種作物鏈格孢屬真菌病毒，但關(guān)于蘋果斑點(diǎn)落葉病菌真菌病毒還未見報(bào)道，有待進(jìn)一步解析。【擬解決的關(guān)鍵問題】在我國蘋果產(chǎn)區(qū)8個省份采集蘋果斑點(diǎn)落葉病樣本，通過dsRNA提取，明確我國蘋果斑點(diǎn)落葉病菌攜帶dsRNA的多樣性；通過生物學(xué)測定揭示攜帶dsRNA菌株的生物學(xué)特征，分析dsRNA多樣性與寄主病原菌生物學(xué)性狀的關(guān)系；最后，鑒定弱毒力菌株攜帶dsRNA病毒的種類。為尋找對蘋果斑點(diǎn)落葉病具有生防潛力的弱毒菌株打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

102株蘋果斑點(diǎn)落葉病菌菌株：2018年5—8月自我國河北、河南、山東、甘肅、遼寧、黑龍江、陜西及云南8個省份采集有典型斑點(diǎn)落葉癥狀的葉片樣本，采用組織分離法和單孢子稀釋法進(jìn)行病原菌的分離純化[23]。在葉片和果實(shí)上利用柯赫氏法則進(jìn)行驗(yàn)證。具體樣本信息見表1。

表1 本研究中蘋果斑點(diǎn)落葉病樣本信息

1.2 主要試劑、儀器和引物

1.2.1 主要試劑和儀器 氯仿，北京酷萊博科技有限公司；纖維素粉，阿拉丁試劑（上海）有限公司；3M乙酸鈉、氨芐，北京索萊寶科技有限公司；Taq Mix、載體PMD18-T，寶生物工程有限公司；感受態(tài)細(xì)胞Tans1-T、TRlzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒，北京全式金生物科技有限公司；DNA膠回收試劑盒，生工生物工程（上海）股份有限公司；RNeasy Mini Kit總RNA提取試劑盒，杭州沃森生物技術(shù)有限公司。組織研磨破碎儀，德國QIAGEN公司；臺式冷凍高速離心機(jī)，默克生命科學(xué)（上海）有限公司；超低溫冰箱、PCR儀，賽默飛世爾科技；DYY-12型電泳儀、DYY-31DN型瓊脂糖水平電泳槽，北京六一儀器廠；BioRad凝膠成像系統(tǒng)，美國SYNGENE公司；超凈工作臺，江蘇蘇凈集團(tuán)公司。

1.2.2 引物 本研究所用引物具體信息見表2。

表2 本試驗(yàn)所用引物

1.3 dsRNA的提取

參考李波[24]的報(bào)道，采用纖維素粉的方法對102株蘋果斑點(diǎn)落葉病菌純化菌株進(jìn)行dsRNA提取，最后加入無水乙醇和乙酸鈉（3 mol·L-1）在-80℃沉淀，12 000 r/min離心后，用1 mL的70%乙醇洗滌沉淀，20 μL DEPC H2O溶解，取8 μL在1%（W/V）的瓊脂糖凝膠電泳中檢測（電壓80 V，50 min），紫外燈下觀察dsRNA電泳條帶。

1.4 蘋果斑點(diǎn)落葉病菌帶毒菌株的生物學(xué)特性

1.4.1 培養(yǎng)特性及菌絲生長速率的測定 將5株帶毒菌株及隨機(jī)選取的20株不帶毒菌株同時擴(kuò)繁，25℃PDA培養(yǎng)7 d后，觀察菌落的形狀、顏色，每個菌株設(shè)置3個重復(fù)。用十字交叉法測菌落直徑，計(jì)算生長速率。

1.4.2 在蘋果葉片和果實(shí)上致病力的測定 采集海棠幼嫩無病葉片，清水洗凈，放于鋪有兩層浸濕濾紙的瓷盤中，使用接種針將葉片的葉脈一側(cè)刺傷；從25個蘋果斑點(diǎn)落葉病菌菌株的PDA平板相同位置的邊緣打取菌餅，將菌絲塊倒置于葉片的傷口處，每個菌株設(shè)置3個重復(fù)；用保鮮膜將瓷盤包裹嚴(yán)實(shí)，置于25℃條件下培養(yǎng)7 d后，測量病斑大小。

取表觀相近的同一批次健康富士蘋果，先清水沖洗，再用75%的酒精擦洗干凈，75%酒精淋濕，放于超凈工作臺中吹干。用接種針將果實(shí)表面刺一個針孔，從25個蘋果斑點(diǎn)落葉病菌菌株的PDA平板相同位置邊緣打取菌餅，有菌絲的一面貼于傷口處，保鮮膜包裹保濕，每個菌株至少3個重復(fù)。25℃培養(yǎng)7 d后測量病斑大小。

1.4.3 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 17.0單因素分析法中的均值比較法進(jìn)行分析。

1.5 菌株QY-2攜帶病毒的高通量測序

1.5.1 RNA的抽提與質(zhì)檢 采用RNeasy Mini Kit進(jìn)行菌株QY-2的total RNA抽提，然后通過Agilent Bioanalyzer 2100電泳分析儀進(jìn)行RNA質(zhì)量檢測，合格后純化total RNA。

1.5.2 文庫構(gòu)建與測序 委托上海伯豪生物技術(shù)有限公司采用宏轉(zhuǎn)錄組測序的方法，對純化后的total RNA進(jìn)行rRNA去除、片段化、第一鏈cDNA合成、第二鏈cDNA合成、末端修復(fù)、3′末端加A、連接接頭、富集等步驟，完成測序樣本文庫構(gòu)建，采用paired-end程序，進(jìn)行雙端測序。測序過程由Illumina提供的data collection software進(jìn)行實(shí)時數(shù)據(jù)分析。

1.5.3 QY-2攜帶病毒種類分析及基因組序列分析 通過高通量測序結(jié)果分析QY-2菌株攜帶的病毒種類及占比。將樣本測序獲得的reads進(jìn)行reference mapping，獲得病毒reads覆蓋度，用RPKM（reads per kilo bases per million reads）量化標(biāo)準(zhǔn)對reads覆蓋度進(jìn)行表達(dá)量計(jì)算，計(jì)算公式：transcription reads /（transcription length×total assembly reads in run）其中，transcription reads為覆蓋病毒整個UniGene的reads數(shù)目，transcription length為UniGene長度，total assembly reads in run為該樣本所有參與拼接的總reads數(shù)目。通過Vector NTI 11.0軟件去除載體序列和序列比對；NCBI上預(yù)測開放閱讀框（ORF）；運(yùn)用MEGA 7.0中的鄰接法進(jìn)行序列系統(tǒng)發(fā)育分析，重復(fù)1 000次。

1.6 菌株QY-2攜帶病毒的RT-PCR鑒定

1.6.1 病毒特異性引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)已報(bào)道的病毒序列，使用Premier5.0設(shè)計(jì)該病毒的特異性引物，委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行合成。引物具體信息見表2。

1.6.2 總RNA的提取 取適量純化好的新鮮菌絲，液氮研磨成粉末狀，轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中，加入1 mL的Trizol試劑，顛倒混勻，室溫下放置5 min；繼續(xù)加入200 μL的氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫下放置3 min；4℃，14 000 r/min離心15 min；取上清700 μL到1.5 mL的離心管中，加入700 μL的異丙醇，顛倒混勻，室溫下放置10 min；4℃，14 000 r/min離心10 min，棄上清，吸除殘留；加入1 mL 75%的乙醇洗滌沉淀；4℃，9 000 r/min離心5 min，棄上清，短暫離心后吸除殘留的乙醇；室溫干燥5—10 min，加入50 μL的DEPC-H2O。

1.6.3 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 使用全式金反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，操作方法參考說明書。具體步驟如下：dsRNA樣品2 μL；Random Primer（N9）（0.1 μg·μL-1）1 μL；2×ES Reaction Mix 10 μL；Easy Script RT Mix 1 μL；DEPC-H2O 6 μL。25℃反應(yīng)10 min，42℃反應(yīng)30 min，然后85℃反應(yīng)5 min，即為cDNA。

PCR反應(yīng)體系：cDNA樣品，1 μL；2×taq mix，10 μL；引物F 1 μL；引物R 1 μL；DEPC-H2O 7 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，35個循環(huán)后，72℃完全延伸7 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的片段。

1.6.4 目的片段的克隆測序 采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收DNA，按試劑盒說明書進(jìn)行操作。按照pMD18-T載體試劑盒說明書進(jìn)行載體連接，利用感受態(tài)細(xì)胞Tans1-T進(jìn)行轉(zhuǎn)化，挑取單菌落到含有氨芐抗生素的液體LB中，37℃，200 r/min振蕩至液體渾濁。以菌液為模板，菌落PCR鑒定陽性克隆，陽性克隆委托華大基因測序公司進(jìn)行測序。

2 結(jié)果

2.1 蘋果斑點(diǎn)落葉病菌的dsRNA多態(tài)性分析

對102株蘋果斑點(diǎn)落葉病菌菌株進(jìn)行dsRNA的提取，使用DNase I及S1核酸酶消解，在102個菌株中有5個菌株攜帶dsRNA，如圖1所示，菌株名稱分別為CL-2-6、QY-2、SQ-1-1、SJZ-4、YT-3-7。dsRNA分為4種類型：菌株YT-3-7攜帶的dsRNA條帶大小在8、2.5和1.5 kb左右；菌株SJZ-4攜帶的dsRNA條帶在8 kb左右；菌株QY-2攜帶的dsRNA條帶在3和0.8 kb左右；菌株CL-2-6和SQ-1-1攜帶的dsRNA條帶在2.5和1.5 kb左右。

2.2 蘋果斑點(diǎn)落葉病菌帶毒菌株的培養(yǎng)性狀

將蘋果斑點(diǎn)落葉病菌帶毒菌株和不帶毒菌株在PDA培養(yǎng)基上25℃黑暗培養(yǎng)7 d，觀察菌落顏色、氣生菌絲形態(tài)等特征，將5個帶毒菌株劃分為兩類。

A：酶處理前dsRNA Untreated dsRNA；B：酶處理后dsRNA Enzyme-treated dsRNA

第1類（圖2）：菌絲灰白色或灰綠色，個別菌落后期有黑色素產(chǎn)生。菌絲分布均勻，多數(shù)菌株的菌絲層較薄，個別菌株的氣生菌絲發(fā)達(dá)呈棉絮狀。具有這一類特征的菌株有12個，包括兩個帶毒菌株SJZ-4和CL-2-6以及10個不帶毒菌株，分別為HLJ-2-1、HLJ-2-3、CL-4-1、QY-5、QY-4、YT-3-9、YT-4-3、HLJ-1-6、HLJ-2-9、SQ-1-2。

第2類（圖3）：菌絲前期白色，后期呈綠色，多數(shù)菌株內(nèi)部的綠色菌絲和外圍的白色菌絲間形成明顯的環(huán)狀界限。具有這一類特征的菌株有13個，包括3個帶毒菌株，分別為QY-2、YT-3-7、SQ-1-1，以及10個不帶毒菌株，分別為SQ-3-14、QY-8、CL-4-2、SQ-3-6、CL-2-9、CL-4-9、SMX-1-3、SQ-1-6、YA、LN-9。

2.3 蘋果斑點(diǎn)落葉病菌帶毒菌株菌絲的生長速率

蘋果斑點(diǎn)落葉病菌不同菌株的菌絲生長速率測定結(jié)果如圖4所示，帶毒菌株與非帶毒菌株相關(guān)性差異不明顯，各菌株間生長速度的快慢因菌株而異。

2.4 蘋果斑點(diǎn)落葉病菌帶毒菌株的致病力

將帶毒菌株和20個不帶毒菌株接種海棠葉片，測定各菌株的致病力。測量接種第7天的病斑大?。▓D5），發(fā)現(xiàn)在5個帶毒菌株中QY-2和YT-3-7的致病力較弱，其余菌株致病力中等。在20個不帶毒的菌株中LN-9和CL-2-9的致病力較強(qiáng)，其他菌株的致病力中等（圖6）。

將帶毒菌株和20個不帶毒菌株接種富士蘋果，測量第7天的病斑大小，發(fā)現(xiàn)在5個帶毒菌株中QY-2為弱致病力菌株，SJZ-4的致病力較強(qiáng)，其余菌株致病力中等。在20個不帶毒的菌株中LN-9、CL-2-9、CL-4-9、YA、YT-3-9、HLJ-2-9、HLJ-1-6、SQ-3-14的致病力較強(qiáng)，其他菌株致病力中等（圖7）。

帶毒菌株QY-2在葉片和果實(shí)上的致病力均較弱，從尋找具有弱毒特性的菌株方面考慮，該菌株可能具有潛在的應(yīng)用價值，選為進(jìn)一步研究的對象。

2.5 蘋果斑點(diǎn)落葉病菌菌株QY-2中dsRNA病毒的鑒定

2.5.1 病毒的全基因組序列 通過分析QY-2菌株中dsRNA高通量測序結(jié)果，獲得了4條與真菌病毒相關(guān)的序列，經(jīng)過Blast表明4個contig均與來源于鏈格孢日本梨致病型的AaCV1序列有較高的相似性，以AaCV1的4個dsRNA片段序列為參考序列，有1 451 570、2 331 542、1 167 609、1 268 863個reads與AaCV1 dsRNA片段序列相符，經(jīng)比對和拼接獲得了Contig 10、Contig 41、Contig 38、Contig 24，對reads覆蓋度進(jìn)行表達(dá)量計(jì)算，4個Contig的RPKM值在所有基因中是最高的，達(dá)到了4 820—9 292。E-value數(shù)值很小，說明了結(jié)果的可靠性（表3）。

A、B：帶毒菌株The strains taking virus (SJZ-4, CL-2-6)；C—L：未帶毒菌株The strains without virus (HLJ-2-1, HLJ-2-3, CL-4-1, QY-5, QY-4, YT-3-9, YT-4-3, HLJ-1-6, HLJ-2-9, SQ-1-2)

A—C：帶毒菌株The strains taking virus (QY-2, YT-3-7, SQ-1-1)；D—M：未帶毒菌株The strains without virus (SQ-3-14, QY-8, CL-4-2, SQ-3-6, CL-2-9, CL-4-9, SMX-1-3, SQ-1-6, YA, LN-9)

圖4 蘋果斑點(diǎn)落葉病菌不同菌株的菌絲生長速率

A：CK；B—F：接種帶毒菌株Inoculation of strains taking virus (YT-3-7, SJZ-4, QY-2, SQ-1-1, CL-2-6)；G—Z：接種不帶毒菌株Inoculation of strains without virus (LN-9, SQ-1-2, SQ-1-6, CL-2-9, CL-4-1, CL-4-2, CL-4-9, QY-5, QY-4, QY-8, SMX-1-3, YA, YT-3-9, YT-4-3, HLJ-2-3, HLJ-2-1, HLJ-2-9, HLJ-1-6, SQ-3-6, SQ-3-14)

圖6 蘋果斑點(diǎn)落葉病菌不同菌株在海棠葉片上的致病力

圖7 蘋果斑點(diǎn)落葉病菌不同菌株在蘋果果實(shí)上的致病力

表3 高通量測序蘋果斑點(diǎn)落葉病菌菌株QY-2攜帶病毒信息

E-value描述同源性的可靠性，值越小結(jié)果越可靠。E-value低于1.0E-5認(rèn)為序列顯著性同源

E-value describes the reliability of homology. The smaller the value, the more reliable the result is. E-value lower than 1.0E-5 is considered as significant homology

已報(bào)道的AaCV1基因組具有5條dsRNA片段，而高通量測序結(jié)果只獲得了病毒的4條dsRNA序列，QY-2 dsRNA瓊脂糖凝膠電泳（圖1）顯示在800 bp左右處也存在一條dsRNA，根據(jù)已報(bào)道的AaCV1設(shè)計(jì)其第5個片段的特異性引物CRV1-5進(jìn)行分子克隆測序，最終獲得了菌株QY-2 dsRNA病毒的第5個片段序列。綜上，菌株QY-2 dsRNA病毒包括5個dsRNA片段，分別為dsRNA1—dsRNA5，片段大小依次為3 665、3 054、2 824、2 819、831 nt。5條dsRNA序列已全部提交到GenBank，登錄號分別為MK672910、MK672913、MK672912、MK672911、MK836314。

2.5.2 病毒的基因組結(jié)構(gòu)分析 將dsRNA1—dsRNA5的序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行ORF分析，結(jié)果顯示dsRNA1—dsRNA5分別編碼一個推定的ORF，依次為ORF1—ORF5。 ORF1—ORF5依次含有1 117、774、774、769、115 aa，編碼蛋白的分子量依次為124、83、84、83、13 kD。dsRNA1—dsRNA5的5′端非翻譯區(qū)（UTR）大小分別為205、573、357、401、102 nt；3′ UTR大小分別為107、157、133、109、382 nt（圖8）。

2.5.3 病毒開放閱讀框序列相似性分析 將QY-2菌株dsRNA病毒ORF1—ORF5編碼的氨基酸序列在NCBI上進(jìn)行blastp搜索，結(jié)果顯示與其相似性相對較高的病毒有4個，分別是AaCV1、chrysovirus1（BdCV1）、chrysovirus 1（AtCV1）、chrysovirus 2（PjCV2）（表4）。與QY-2菌株dsRNA病毒ORF1（RdRP）氨基酸序列相似性分別為93%、56%、55%、52%，核苷酸序列相似性為77%、59%、57%、54%；ORF2氨基酸序列相似性為91%、47%、44%、40%，核苷酸序列相似性為75%、54%、50%、49%；ORF3氨基酸序列相似性為80%、35%、32%、32%，核苷酸序列相似性為70%、40%、42%、42%；ORF4氨基酸序列相似性為90%、47%、43%、43%，核苷酸序列相似性為76%、51%、50%、56%；與ORF5氨基酸序列相似性較高的只有AaCV1編碼的假定蛋白，相似性為87%，核苷酸序列相似性為95%。根據(jù)國際病毒分類委員會（ICTV）2020年發(fā)布的內(nèi)種的分類標(biāo)準(zhǔn)（https://talk.ictvonline.org/taxonomy/），從寄主種類、RdRP、CP氨基酸序列相似性（≤70%、≤53%）、dsRNA片段數(shù)目、5′-UTR長度幾個方面分析，確定菌株QY-2所攜帶的dsRNA病毒為產(chǎn)黃青霉病毒科（）、產(chǎn)黃青霉病毒屬（）的chrysovirus。

圖8 蘋果斑點(diǎn)落葉病菌菌株QY-2 dsRNA病毒基因組模式圖

表4 蘋果斑點(diǎn)落葉病菌菌株QY-2的dsRNA與其他病毒的核苷酸及氨基酸序列的相似性

2.5.4 病毒系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析 為分析病毒系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，將蘋果斑點(diǎn)落葉病菌菌株QY-2攜帶的AaCV2 RdRP氨基酸序列與、以及一些未分類病毒的RdRP氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，菌株QY-2攜帶的病毒與的聚在一個分支，并且與病毒AaCV1遺傳關(guān)系最近，其自展支撐值為100（圖9）。因此將QY-2菌株攜帶的病毒暫定命名為chrysovirus 2（AaCV2）。

2.6 菌株QY-2攜帶病毒的RT-PCR鑒定

根據(jù)獲得的QY-2 dsRNA病毒基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物CRV1-1對其進(jìn)行RT-PCR檢測。瓊脂糖凝膠電泳顯示，菌株QY-2出現(xiàn)了453 bp的病毒特異性目的條帶，對照菌株及清水對照均沒有條帶出現(xiàn)，進(jìn)一步說明了菌株QY-2中AaCV2的存在（圖10）。

3 討論

目前，蘋果斑點(diǎn)落葉病防治的主要方式為化學(xué)防治。為避免化學(xué)防治對人體和環(huán)境產(chǎn)生的不利影響，尋求安全有效的綠色生防措施頗為重要。部分真菌病毒可導(dǎo)致真菌致病力的衰退，因此可作為一種生防因子用于真菌病害的防治[25-26]。

圖9 以真菌病毒的RdRP氨基酸序列為基礎(chǔ)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

M：DL2000；1：QY-2；2：對照菌株Control strain；3：清水對照Water control

本研究對采自我國8個省份蘋果主產(chǎn)區(qū)的102株蘋果斑點(diǎn)落葉病菌菌株進(jìn)行dsRNA檢測，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，明確了其中5個菌株具有明顯的dsRNA條帶，可能攜帶真菌病毒，約占5%的菌比例，在蘋果斑點(diǎn)落葉病菌中dsRNA具有一定的普遍性，且根據(jù)條帶大小來看，病毒種類具有多樣性。據(jù)報(bào)道鏈格孢屬真菌目前發(fā)現(xiàn)的病毒包括：從棉花種子中分離出6個攜帶真菌病毒的鏈格孢菌株，dsRNA片段在1.0—5.1 kb[14]；從茄鏈格孢中檢測到兩條dsRNA大小分別為8.3和5.5 kb[15]；另外還有真菌病毒AaV1（dsRNA片段：3 617、2 794、2 576、1 420 bp）[17]、AlRV1（dsRNA片段：3 145 bp）[18]、AaVV1（dsRNA片段：5 203 bp）[19]、AbFV1（ssRNA片段：6 639 bp）[20]、ABRV1（dsRNA片段：6 188、5 903 bp）[21]、AaCV1（dsRNA片段：3 647、2 857、2 785、2 772、836 bp）[22]。不同的鏈格孢菌株攜帶dsRNA條帶差異較大，且與本研究所分離到的dsRNA病毒條帶有較大差異。因此，本研究發(fā)現(xiàn)的蘋果斑點(diǎn)落葉病菌真菌病毒有可能是未揭示的新病毒。

隨著真菌病毒種類及數(shù)量不斷增多，人們開始研究病毒對真菌生物學(xué)功能方面的影響，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)病毒在菌株中能夠穩(wěn)定遺傳[27-28]，但因病毒種類不同，對真菌致病力及其他方面會有不同的影響。真菌病毒與寄主間的相互作用成為現(xiàn)代病毒學(xué)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。本研究主要針對攜帶dsRNA病毒的5個菌株進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察、生長速率測定及致病力鑒定，同時與不攜帶dsRNA病毒的其他菌株進(jìn)行比較，以明確攜帶病毒是否引起了菌株的特異性或其是否具有生防意義。通過測定發(fā)現(xiàn)，帶毒菌株間菌落形態(tài)、菌絲的生長速率和菌株的致病能力存在顯著差異，不帶毒菌株間這3個方面同樣也存在顯著差異。菌株的菌落特征、生長速率與dsRNA攜帶與否及類型沒有明顯的關(guān)系，致病力測定表明含有dsRNA病毒的供試菌株大多屬于低毒力類型，其中的線性關(guān)系或多因素關(guān)系，還有待進(jìn)一步研究。

在含有dsRNA病毒的低致病力菌株中，QY-2致病力最低，與清水對照無顯著性差異。經(jīng)鑒定該菌株中攜帶大量的產(chǎn)黃青霉病毒科、產(chǎn)黃青霉病毒屬的chrysovirus，這是蘋果斑點(diǎn)落葉病菌中該病毒的首次報(bào)道。王利華等[29]明確了產(chǎn)黃青霉病毒科成員Chrysovirus 1（BdCV1）對梨輪紋病菌（）的菌落形態(tài)、生長速度有明顯抑制作用，是引起梨輪紋病菌致病力衰退的主要因子；Ma等[30]報(bào)道細(xì)鏈格孢（）攜帶AaCV1-AT1，AaCV1-AT1的感染降低了宿主真菌的菌落生長速度和產(chǎn)孢能力；Okada等[22]報(bào)道了AaCV1對鏈格孢日本梨致病型具有兩個方面的作用，一是影響真菌宿主的生長速度，二是影響真菌宿主毒素的產(chǎn)生。因此，AaCV2也可能是引起QY-2菌株致病力衰退的主要原因。下一步將對QY-2攜帶的AaCV2進(jìn)行深入研究，以開發(fā)對蘋果斑點(diǎn)落葉病具有生防潛力的dsRNA病毒。

4 結(jié)論

我國蘋果斑點(diǎn)落葉病菌菌株攜帶dsRNA的概率在5%左右，dsRNA群體多樣，有4種類型：類型I的dsRNA在8、2.5和1.5 kb左右；類型II的dsRNA在8 kb左右；類型III的dsRNA在3和0.8 kb左右；類型IV的dsRNA在2.5和1.5 kb左右。dsRNA的有無及類型與寄主病原菌培養(yǎng)性狀沒有明顯相關(guān)性，攜帶dsRNA的菌株多為弱致病力，致病力最低的QY-2菌株攜帶產(chǎn)黃青霉病毒科、產(chǎn)黃青霉病毒屬的chrysovirus 2。

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Analysis of dsRNA carried byf. sp.in China and identification of a dsRNA virus

Cao YuHan, Li ZiTeng, Zhang JingYi, Zhang JingNa, Hu TongLe, Wang ShuTong, Wang YaNan, Cao KeQiang

College of Plant Protection, Hebei Agricultural University, Baoding 071001, Hebei

【Objective】Apple Alternaria blotch occurs in all major apple producing areas in China, causing serious economic loss. Apple Alternaria blotch is a worldwide airborne disease caused byf. sp. The objective of this study is to investigate the diversity of dsRNA off. spin China, and to provide new biological control resources for the disease and new understanding of virus diversity and evolutionary.【Method】Tissue samples with typical symptom were collected from eight provinces in China. Pure culture was obtained by tissue isolation and single spore separation. The diversity of dsRNA carried byf. spin China was determined by dsRNA extraction and gel electrophoresis. The biological characteristics of dsRNA-carrying pathogens were determined by evaluation of culture characteristics, mycelial growth rate, and pathogenicity on fruits and leaves. By high throughput sequencing and molecular cloning techniques, the whole genome sequence, genome structure and phylogenetic for the mycovirus carried by QY-2 strain were analyzed.【Result】The pure culture of 102 strains off. spwas obtained and five strains with obvious dsRNA bands were found. The dsRNA virus off. spin China could be divided into four types, there were about 8, 2.5 and 1.5 kb dsRNA in type I (strain yt-3-7), about 8 kb dsRNA in type II (strain sjz-4), about 3 and 0.8 kb dsRNA in type III (strain qy-2), and about 2.5 and 1.5 kb dsRNA in type IV (strains cl-2-6 and sq-1-1). The strains carrying dsRNA had diverse culture characteristics, and there was no significant relationship between the colony characteristics, growth rate and whether dsRNA carrying or not and its type. The strains carrying dsRNA were mostly of low pathogenicity type. It was found that QY-2 strain showed weak pathogenicity on leaves and fruits, so QY-2 was selected for virus identification. The genome of the dsRNA virus carried by the strain QY-2 consists of five dsRNA fragments, dsRNA1-dsRNA5, with the sequence sizes of 3 665, 3 054, 2 824, 2 819 and 831 nt, which were submitted to GenBank. The accession numbers are MK672910, MK672913, MK672912, MK672911, and MK836314. The molecular weights of coding proteins are 124, 83, 84, 83 and 13 kD, respectively. Phylogenetic analysis showed that it was closely related to AaCV1, so it was identified aschrysovirus belonging toe ands. The tentative designation ischrysovirus 2 (AaCV2). 【Conclusion】There are diverse dsRNAs inf. spin China, and there is no significant correlation between dsRNA diversity and host pathogen culture traits. Most of the strains carrying dsRNA showed low pathogenicity. QY-2 strain with the least pathogenicity carries AaCV2. The low pathogenicity characteristic of this strain may have potential application value, which provides a new resource for biological control of apple Alternaria blotch.

apple Alternaria blotch;f. sp; dsRNA; biological characteristic; pathogenicity; biological control

2021-04-06；

2021-05-10

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-27）、河北省自然科學(xué)基金（C2019204327）、河北省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（21326506D，19226508D，20327405D）、河北省引進(jìn)留學(xué)人員資助項(xiàng)目（C201839）

曹鈺晗，E-mail：c897836047@163.com。李紫騰，E-mail：lzt304838566@163.com。曹鈺晗和李紫騰為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者王亞南，E-mail：wyn3215347@163.com。通信作者曹克強(qiáng)，E-mail：cao_keqiang@163.com

（責(zé)任編輯 岳梅）