王潔，吳曉宇，楊柳，段巧紅，黃家保

大白菜ACA基因家族的全基因組鑒定與表達(dá)分析

王潔，吳曉宇，楊柳，段巧紅，黃家保

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院/作物生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安 271018

【目的】通過對(duì)大白菜ACA（Ca2+-ATPase）基因家族鑒定與表達(dá)分析，研究其家族基因間的共性與特性，為進(jìn)一步揭示ACA家族進(jìn)化關(guān)系提供數(shù)據(jù)支撐，為深入解析在低溫脅迫、鹽脅迫以及自交不親和方面的功能研究奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā扛鶕?jù)已報(bào)道的擬南芥ACA基因家族，同源比對(duì)出大白菜ACA基因家族，利用在線軟件Expasy預(yù)測其分子量、理論等電點(diǎn)等理化性質(zhì)；采用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；運(yùn)用在線軟件GSDS 2.0繪制基因結(jié)構(gòu)圖譜；TBtools對(duì)其染色體定位；McscanX軟件進(jìn)行擬南芥與大白菜ACA家族基因共線性分析；利用在線軟件PlantCARE預(yù)測大白菜ACA基因家族啟動(dòng)子元件；通過在線工具Pfam和MEME進(jìn)行蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析；利用qRT-PCR技術(shù)檢測在不同組織、非生物脅迫和自交異交授粉后的表達(dá)量?！窘Y(jié)果】大白菜ACA基因家族有18個(gè)基因成員，分布在大白菜10條染色體上；根據(jù)進(jìn)化樹關(guān)系分成4組，分別包含3、4、4和7個(gè)成員；蛋白結(jié)構(gòu)域分析顯示，有13個(gè)成員包含N端自抑結(jié)構(gòu)域。qRT-PCR結(jié)果表明，主要在花與果莢中高表達(dá)；低溫脅迫下，與表達(dá)量總體上調(diào)；鹽脅迫下，表達(dá)量顯著上調(diào)；自交和異交授粉中，和差異性表達(dá)。對(duì)、和亞細(xì)胞定位分析，發(fā)現(xiàn)這些基因均定位在細(xì)胞質(zhì)膜上?！窘Y(jié)論】大白菜ACA家族基因蛋白結(jié)構(gòu)均含有4個(gè)ACA基因特有的高度保守結(jié)構(gòu)域。該家族在大白菜不同組織中表達(dá)模式不同，5個(gè)ACA家族基因成員編碼蛋白定位于細(xì)胞膜上，其中、與低溫和鹽脅迫響應(yīng)有關(guān)；和與自交不親和性相關(guān)。

ACA家族；Ca2+-ATPase；低溫脅迫；鹽脅迫；自交不親和；大白菜

0 引言

【研究意義】大白菜（L. ssp. pekinensis）為十字花科蕓薹屬作物，屬于孢子體自交不親和型植物，在育種生產(chǎn)中常噴施2%—3%食鹽水來克服大白菜自交不親和以進(jìn)行親本留種[1]。鹽害和冷害也常影響大白菜的生長和產(chǎn)量。鈣離子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是植物響應(yīng)各種環(huán)境因子的重要機(jī)制，逆境條件下細(xì)胞質(zhì)鈣離子濃度升高，引發(fā)一系列鈣依賴的下游信號(hào)傳遞。Ca2+-ATPase（ACA）作為調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的重要蛋白質(zhì)之一，維持細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的平衡[2-3]。ACA是Ca2+-ATPase最重要的亞家族成員之一，在維持細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的平衡方面發(fā)揮著重要作用?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】鈣離子作為第二信使，在動(dòng)植物一生中都具有重要作用。Puteney[4]在1986年首次報(bào)道了細(xì)胞內(nèi)鈣離子內(nèi)流的相關(guān)信息。鈣離子ATP泵（又稱P型ATP酶）[5]最早可以追溯到英國科學(xué)家Ringer在1885年發(fā)現(xiàn)鈣離子對(duì)動(dòng)物肌肉收縮有影響[6]，10年后科學(xué)家們獲得肌漿網(wǎng)鈣泵氨基酸序列[7]。近些年擬南芥[8-9]、番茄[10-11]、水稻[12-13]、甘藍(lán)[14]、大豆[15]和苜蓿[16]等植物陸續(xù)有鈣泵的編碼序列被報(bào)道。ACA蛋白屬于P型ATP酶超級(jí)組基因家族的鈣離子泵，典型的ACA基因家族蛋白，具有Haloacid dehalogenase- like hydrolase功能域、C端Cation transporting ATPase功能域、E1-E2 ATPase功能域和N端Cation transporter/ ATPase功能域4個(gè)高度保守的功能結(jié)構(gòu)域[17]。根據(jù)其蛋白序列N端有無自抑結(jié)構(gòu)域，分為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜型鈣離子泵和自抑制型鈣離子泵[18-20]。目前在擬南芥、水稻、大豆和苜蓿的ACA基因家族已經(jīng)作了比較全面地分析。擬南芥ACA基因家族有13個(gè)成員，其中、和為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜型鈣離子泵；、、、、、、、、和屬于自抑制型鈣離子泵[21-23]。有數(shù)據(jù)顯示定位于質(zhì)膜上的在擬南芥的所有器官中均有表達(dá)，同樣在擬南芥所有器官表達(dá)的還有與其高度同源的，擬南芥幼苗期外施植物激素脫落酸使和表達(dá)量顯著升高[24]。已有研究表明與野生型相比，擬南芥突變體在冷害和高溫脅迫下，抗逆性增強(qiáng)[8]。還有研究表明，、和3在擬南芥有性生殖方面扮演著重要角色[24]，對(duì)提高鹽離子毒害的耐受性有至關(guān)重要的作用[25]。水稻ACA基因家族由15個(gè)成員組成，其中有3個(gè)屬于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜型鈣離子泵，12個(gè)屬于自抑制型鈣離子泵。水稻在煙草中表達(dá)會(huì)積累大量的脯氨酸，從而增強(qiáng)煙草的抗鹽和抗旱能力[26]。大豆的ACA基因家族有29個(gè)基因成員，其中有5個(gè)屬于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜型鈣離子泵，24個(gè)屬于自抑制型鈣離子泵。大豆中，Sun等[15]研究證實(shí)，野生大豆Ca2+-ATPase（）在調(diào)節(jié)植物對(duì)碳酸鹽堿性和中性鹽脅迫的耐受性方面有積極效果。苜蓿Ca2+-ATPase家族由16個(gè)成員組成，其中3個(gè)屬于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜型鈣離子泵，13個(gè)屬于自抑制型鈣離子泵。研究發(fā)現(xiàn)苜蓿ACA基因家族的蛋白序列具有高度保守性，其中和在響應(yīng)低溫脅迫過程中可能發(fā)揮著重要作用[19]。大白菜中同屬于Ca2+-ATP亞家族且具有鈣運(yùn)輸功能的ECA基因家族在生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[27]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】大白菜作為人們?nèi)粘２妥郎系闹匾卟?，ACA蛋白可能在其育種和生產(chǎn)過程中的自交不親和、鹽脅迫和冷脅迫等諸多方面發(fā)揮作用，而相關(guān)的鑒定和功能解析還未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究擬通過生物信息學(xué)手段鑒定出大白菜ACA基因家族成員，并進(jìn)行特征分析和表達(dá)分析，為研究大白菜ACA家族基因的功能、基因編輯育種和開發(fā)分子標(biāo)記進(jìn)行輔助育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2020年在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和南校實(shí)驗(yàn)站進(jìn)行。

1.1 大白菜ACA基因家族成員鑒定及基本理化性質(zhì)分析

在TAIR（https://www.arabidopsis.org/）網(wǎng)站下載擬南芥ACA基因家族蛋白序列，同時(shí)在植物信息數(shù)據(jù)庫（http://www.plantgdb.org/）中下載大白菜（版本V1.5）全基因組蛋白序列文件和gff3文件構(gòu)建本地BLAST數(shù)據(jù)庫，將擬南芥ACA基因家族的蛋白序列通過本地BLAST比對(duì)出大白菜候選基因（參數(shù)為E＜1e-10，Identity＞40%）；同時(shí)利用Pfam數(shù)據(jù)庫、NCBI保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih. gov/structure/cdd/wrpsb.cgi/）和SMART9.0（http://smart. embl-heidelberg.de/）建立大白菜全基因組蛋白結(jié)構(gòu)域模型，篩選含有ACA典型結(jié)構(gòu)域（Haloacid dehalogenase- like hydrolase功能域、C端Cation transporting ATPase功能域、E1-E2 ATPase功能域和N端Cation transporter/ATPase功能域）的蛋白序列[28-29]。上述結(jié)果合并，剔除重復(fù)基因和不含ACA典型結(jié)構(gòu)域的基因，并人工矯正刪除無完整讀碼框的序列。利用在線工具Expasy（http://web.expasy.org/）預(yù)測大白菜ACA基因家族的分子量、理論等電點(diǎn)等物理化學(xué)特性以及WoLF PSORT（http://wolfpsort.org/）和DETAIBIO（http://www.detaibio.com/tools/transmembrane.html/）預(yù)測大白菜ACA家族蛋白定位和跨膜結(jié)構(gòu)[29-30]，參數(shù)默認(rèn)。

1.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建與繪制基因結(jié)構(gòu)圖

運(yùn)用MEGA 5.0軟件對(duì)大白菜ACA基因家族蛋白按照鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，校驗(yàn)參數(shù)步值（bootstrap）設(shè)置為1 000，其余參數(shù)均為默認(rèn)值，通過GSDS（http://gsds.gao-lab.org/）繪制內(nèi)含子-外顯子基因結(jié)構(gòu)圖[31-32]。

1.3 染色體定位和啟動(dòng)子元件分析

利用TBtools對(duì)家族基因進(jìn)行染色體位置分析，并同擬南芥家族基因在McscanX進(jìn)行共線性分析[33-34]，參數(shù)默認(rèn)。選擇BraACA家族基因上游2 000 bp的序列，利用在線工具plantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對(duì)其元件進(jìn)行分析，參數(shù)默認(rèn)[35]。

1.4 蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析與序列比對(duì)

利用在線軟件Pfam（https://pfam.xfam.org/）[28]和MEME（http://meme-suite.org）[36]對(duì)大白菜蛋白序列的保守基序與功能結(jié)構(gòu)域分析，其中MEME的參數(shù)設(shè)置Maxi-mum number of motifs為10，Occurrences of a single motif為zero or one per sequence。運(yùn)用DNAMAN 9對(duì)大白菜部分ACA家族基因與擬南芥AtACAs的蛋白序列進(jìn)行同源比對(duì)。

1.5 大白菜總RNA的提取和qRT-PCR分析

材料取自植物培養(yǎng)室。組織特異性表達(dá)研究分別取‘848蛋黃白’植株定植2個(gè)月后的根、莖、葉、當(dāng)天開放的花、果莢以及冷脅迫（4℃處理0、2、4、6和12 h）與鹽脅迫（150 mmol?L-1NaCl處理0、2、4、6和12 h）處理一定時(shí)間后的幼苗。均取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

采用Universal RNA Extraction Kit試劑盒（Bioteke Corporation）提取總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳評(píng)估RNA的完整性，分光光度計(jì)（Thermo Nano Drop One）測量RNA濃度和純度。利用HiScript? II Q RT SuperMix for qPCR Sample試劑盒（諾唯贊）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得cDNA，稀釋十倍后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

qRT-PCR的反應(yīng)體系：2×SYBR qPCR Master Mix 10.0 μL，上、下游引物（10 μmol?L-1）各0.4 μL，cDNA模板1.0 μL，ddH2O 8.2 μL，總反應(yīng)體系20 μL。反應(yīng)程序：95℃，30 s；95℃，10 s，60℃，22 s，40個(gè)循環(huán)；95℃，25 s，60℃，60 s，95℃，7 s。內(nèi)參使用。3個(gè)技術(shù)重復(fù)。采用2-??CT法[37]對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，使用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)匯總，TBtools作圖。引物序列見表1，使用qPrimerDB-qPCR Primer Database（http://biodb.swu.edu.cn/qprimerdb/）和NCBI Primer BLAST網(wǎng)址設(shè)計(jì)完成，由青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。

1.6 亞細(xì)胞定位

根據(jù)的CDS序列，用CE Design V1.04（諾維贊）軟件設(shè)計(jì)攜帶同源臂的PCR擴(kuò)增引物（表2）。以大白菜cDNA作為模板，對(duì)其基因片段進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸3 min，34個(gè)循環(huán)；72℃徹底延伸5 min。片段回收后與載體通過同源重組的方法進(jìn)行連接。構(gòu)建好的融合載體熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，涂抗性板。第2天長出單菌落后挑單克隆小量培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，測序鑒定。鑒定正確后轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)，PCR鑒定。最后挑單菌落搖菌，注射煙草葉片，2—3 d后在熒光顯微鏡（Nikon DS-Ri2，Japan）下觀察GFP表達(dá)情況并拍照、分析。

表1 qRT-PCR引物

表2 部分克隆基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 大白菜ACA基因家族成員信息

運(yùn)用生物信息學(xué)手段鑒定出18個(gè)家族成員，并對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行分析（表3）。家族成員分子量在110 370.20 Da（）—119 249.50 Da（），平均分子量114 171.00 Da；CDS平均長度為3 142 bp；蛋白的平均長度約1 047 aa；理論等電點(diǎn)在5.06（）—8.75（），平均理論等電點(diǎn)為6.28；BraACAs基因家族蛋白均定位在細(xì)胞質(zhì)膜，除跨膜結(jié)構(gòu)數(shù)量為10，其余BraACAs蛋白跨膜結(jié)構(gòu)數(shù)量為7和8。同時(shí)利用模式植物擬南芥對(duì)BraACAs基因家族進(jìn)行同源比對(duì)分析，得到比對(duì)結(jié)果最高相似度的基因（表3）。

表3 大白菜ACA基因家族成員信息

2.2 大白菜ACA家族系統(tǒng)進(jìn)化與基因結(jié)構(gòu)分析

利用大白菜ACA家族蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1-A）。大白菜18個(gè)BraACA家族成員根據(jù)親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近可分為4類，命名為Group Ⅰ、Group Ⅱ、Group Ⅲ和Group Ⅳ，各組中分別含有3、4、4和7個(gè)，其中在Group Ⅰ、Group Ⅱ、Group Ⅲ步長值高達(dá)99%的分別為/，/和/，GroupⅢ和GroupⅣ步長值為98%的分別為/和/，進(jìn)一步說明構(gòu)建的BraACAs蛋白間進(jìn)化關(guān)系比較可靠（圖1-A）。同時(shí)利用在線軟件GSDS繪制大白菜ACA家族基因結(jié)構(gòu)圖（圖1-B），結(jié)果表明大白菜ACA基因家族成員之間的內(nèi)含子數(shù)量差異較大（0—33個(gè)），5個(gè)內(nèi)含子以下的Bra有3個(gè)，5—20個(gè)內(nèi)含子的有7個(gè)，20個(gè)以上內(nèi)含子的有8個(gè)。其中20個(gè)以上的主要集中在Group Ⅳ，除外，其他均具有相同的內(nèi)含子-外顯子組成模式，即33-34（33個(gè)內(nèi)含子，34個(gè)外顯子）。Group Ⅱ直觀上觀察可以分為2種組成模式，即/和/。結(jié)果顯示大白菜ACA蛋白家族成員間基因結(jié)構(gòu)存在差異。

圖1 大白菜ACA基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹與基因結(jié)構(gòu)圖

2.3 大白菜ACA家族基因染色體定位及與擬南芥基因的共線性分析

根據(jù)基因位置文件對(duì)18個(gè)家族基因染色體定位進(jìn)行分析（圖2），結(jié)果顯示其不均勻分布在大白菜10條染色體上，其中9號(hào)染色體上的基因最多，含有4個(gè)成員；其次是1號(hào)染色體上有3個(gè)基因成員；3號(hào)、5號(hào)和8號(hào)分別各有2個(gè)基因成員；2號(hào)、4號(hào)、6號(hào)、7號(hào)和10號(hào)染色體分別僅有1個(gè)基因成員（圖2-A），進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)、/存在基因重復(fù)現(xiàn)象（圖2-B），同時(shí)還存在片段復(fù)制情況，發(fā)現(xiàn)了6對(duì)片段復(fù)制基因，分別為和和、和、和、和、和，表明BraACAs基因家族某些成員之間的基因功能具有相似性。

為了更好地了解大白菜ACA家族基因所具備的功能，參照已詳細(xì)報(bào)道過的擬南芥AtACAs進(jìn)行直接同源基因比對(duì)，預(yù)測大白菜ACA家族所具有的生物學(xué)功能。通過對(duì)擬南芥和大白菜ACA基因家族進(jìn)行共線性分析，結(jié)果顯示16對(duì)處于共線性區(qū)域，分別是/、/、/、/、/、/、/、/、/、/、/、/、/、/、/、/（圖2-B）。

2.4 大白菜ACA基因家族啟動(dòng)子元件分析

啟動(dòng)子元件分析發(fā)現(xiàn)，大白菜ACA基因家族均含有較多的光響應(yīng)元件，50%以上的含有低溫和干旱響應(yīng)元件，80%以上含有厭氧誘導(dǎo)應(yīng)答元件，40%以上有茉莉酸甲酯、脫落酸、赤霉素與脫落酸響應(yīng)元件，其中和包含水楊酸響應(yīng)元件，還有部分基因有分生組織、根特異性、生物鐘等響應(yīng)元件，暗示大白菜ACA基因家族參與光合作用、生長發(fā)育等過程，同時(shí)在大白菜應(yīng)對(duì)逆境脅迫方面也發(fā)揮著重要作用（圖3）。

圖2 大白菜與擬南芥ACA基因在染色體上的位置及基因重復(fù)事件

圖3 大白菜ACA家族基因啟動(dòng)子元件分析

2.5 大白菜ACA家族成員蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

利用在線工具Pfam和MEME分別對(duì)大白菜ACA家族蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析（圖4），獲得了10個(gè)保守基序，分別命名為Motif 1—Motif 10，大白菜ACA家族均含有Motif 1、Motif 3、Motif 6和Motif 10保守基序（圖4）。通過進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)Motif 1末端含有連續(xù)高度保守的天冬氨酸（D）-賴氨酸（K）-蘇氨酸（T）-甘氨酸（G）-蘇氨酸（T）-亮氨酸（L）-蘇氨酸（T）等7個(gè)氨基酸，Motif 3前端含有連續(xù)高度保守的亮氨酸（L）-亮氨酸（L）-色氨酸（W）-纈氨酸（V）-天冬氨酸（N）等5個(gè)氨基酸，Motif 6含有4個(gè)不連續(xù)高度保守的甘氨酸（G）（圖4）。對(duì)蛋白的保守功能域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)大白菜ACA基因家族蛋白的4個(gè)保守功能域分別對(duì)應(yīng)著4個(gè)保守基序（圖4和圖5），即Haloacid dehalogenase-like hydrolase功能域?qū)?yīng)Motif 1，C端Cation transporting ATPase功能域?qū)?yīng)Motif 3，E1-E2 ATPase功能域?qū)?yīng)Motif 6以及N端Cation transporter/ATPase功能域?qū)?yīng)Motif 10。除此之外，發(fā)現(xiàn)大白菜ACA基因家族蛋白的N端自抑制功能域存在于13個(gè)家族成員中，即、、、、、、、、、、、和。

圖4 大白菜ACA家族基因成員蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

圖5 大白菜ACA家族保守結(jié)構(gòu)域蛋白序列比對(duì)

2.6 BraACAs家族基因表達(dá)分析

2.6.1 組織特異性表達(dá)分析 利用qRT-PCR技術(shù)鑒定BraACA基因家族各成員在大白菜不同器官中的表達(dá)，以根的表達(dá)量作為對(duì)照，顯示大多數(shù)在大白菜果莢中高表達(dá)，其次是花，而在根、莖和葉片中的表達(dá)量普遍偏低（圖6）。其中在果莢和花中的表達(dá)量都最高，除此之外，在果莢中表達(dá)量由高到低依次是、和，在花中表達(dá)量由高到低依次是和；在大白菜莖和葉片中表達(dá)最高，其余基因在莖和葉片中的表達(dá)都略低。

2.6.2 冷脅迫下的表達(dá) 大白菜生產(chǎn)過程中經(jīng)常面臨冷害威脅。對(duì)BraACA家族在冷脅迫不同時(shí)間后的表達(dá)情況進(jìn)行分析（圖7），發(fā)現(xiàn)除、和外，其余基因的表達(dá)量隨冷脅迫時(shí)間的延長呈“降-升-降”的趨勢；的表達(dá)量隨冷脅迫時(shí)間的延長呈“降-升-降-升”的趨勢；而和這2個(gè)基因最值得關(guān)注，在受到冷脅迫的前6 h內(nèi)呈現(xiàn)遞增上升的趨勢，最具規(guī)律性。前期在對(duì)這2個(gè)基因上游2 000 bp啟動(dòng)子序列的元件分析發(fā)現(xiàn)分別含有2和1個(gè)低溫響應(yīng)元件（圖3），同時(shí)發(fā)現(xiàn)、與（）相似性較高（表3），對(duì)這3個(gè)基因蛋白序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)其相似性為94.21%（圖8），前期有研究表明在擬南芥抵抗冷脅迫發(fā)揮重要作用，本研究qRT-PCR表明和在低溫環(huán)境下表達(dá)量上調(diào)，這與擬南芥研究結(jié)果類似[8]。

圖7 BraACAs冷脅迫處理不同時(shí)間下基因表達(dá)情況

2.6.3 鹽害處理下的表達(dá)和在受到鹽脅迫后表達(dá)量變化最為顯著，相比對(duì)照，分別上調(diào)了4倍和3倍（圖9）。大多數(shù)ACA基因成員表達(dá)量在受到鹽脅迫后呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，、、和在受到鹽脅迫12 h內(nèi)，基因表達(dá)量趨于穩(wěn)定。其中在受到鹽脅迫后表達(dá)量呈現(xiàn)明顯上升的趨勢，前期對(duì)啟動(dòng)子元件分析發(fā)現(xiàn)其含有2個(gè)茉莉酸甲酯響應(yīng)元件（圖3），大量試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示茉莉酸甲酯可以有效地緩解鹽脅迫對(duì)植物的危害[38-39]。與擬南芥同源比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與（）相似性較高（表3），蛋白比對(duì)結(jié)果顯示其相似性為85.70%（圖10），已有文章報(bào)道在緩解鹽害方面有顯著作用[25]，這與定量結(jié)果相吻合。

圖9 BraACAs鹽脅迫處理不同時(shí)間下基因表達(dá)情況

2.6.4 在大白菜中不親和/親和反應(yīng)中的表達(dá) 提取大白菜初花期的柱頭總RNA，進(jìn)行RNA-seq測序，獲取柱頭中基因的表達(dá)量信息。結(jié)果表明，18個(gè)成員中大約一半的基因?qū)儆诘捅磉_(dá)基因（FPKM≤10），中表達(dá)基因（1040）較少[40]，表達(dá)水平最高（圖11）。以大白菜未授粉、自交授粉（發(fā)生不親和反應(yīng)）和異交授粉（發(fā)生親和反應(yīng)）柱頭為模板，選取大白菜ACA家族中部分花期高表達(dá)量基因進(jìn)行定量PCR檢測，發(fā)現(xiàn)及無論是自交還是異交授粉后的基因表達(dá)量與未授粉時(shí)基因表達(dá)量差異較小，有的甚至普遍較低（圖12）。對(duì)較為關(guān)注的花期FPKM值最高的定量分析發(fā)現(xiàn)，在授粉15 min和30 min，自交授粉后的基因表達(dá)量明顯高于異交授粉的基因表達(dá)量，表明其在自交不親和過程中可能發(fā)揮重要作用。其中花期FPKM值次高的在自交授粉后的表達(dá)量也具有這一特性。

2.7 部分大白菜ACA基因克隆和亞細(xì)胞定位分析

對(duì)已經(jīng)初步了解生物學(xué)功能的和設(shè)計(jì)引物，從大白菜‘848蛋黃白’柱頭cDNA中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆基因。電泳顯示目標(biāo)條帶大小以及測序結(jié)果正確（圖13）。將5個(gè)的CDS連接載體，轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，進(jìn)行煙草葉片瞬時(shí)表達(dá)。結(jié)果顯示這5個(gè)均定位在細(xì)胞膜上（圖14）。

圖10 Bra031701和AT1G10130蛋白序列比對(duì)

在柱頭RNA-seq數(shù)據(jù)中提取BraACAs的FPKM值作圖

圖12 BraACAs基因在柱頭未授粉（UP）、自交（SI）和異交（SC）下表達(dá)情況

圖13 BraACAs的瓊脂糖凝膠電泳

3 討論

鈣離子在植物生長、發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用[41-42]，維持體內(nèi)鈣離子濃度平衡顯得尤其重要，鈣離子泵是調(diào)節(jié)鈣離子濃度的重要蛋白之一。鈣離子泵在擬南芥、水稻等模式植物中已經(jīng)研究得相對(duì)較清楚，尤其是ACA家族基因研究得比較透徹[43-45]。本研究鑒定得出18個(gè)大白菜ACA基因家族成員，其中有13個(gè)帶有N端的自抑結(jié)構(gòu)域。有研究表明N端的自抑結(jié)構(gòu)域能有效抑制ATPase結(jié)構(gòu)域的活性，從而保持鈣泵較低的活性[46]。大白菜經(jīng)歷三倍化復(fù)制事件，而后可能因?yàn)锽raACA在進(jìn)化過程中發(fā)生基因丟失，使大白菜與擬南芥在ACA基因數(shù)目上沒有太大差異。對(duì)功能結(jié)構(gòu)域深入分析發(fā)現(xiàn)，Haloacid dehalogenase-like hydrolase功能域含有高度保守的D-K-T-G-T-L-T基序，C端Cation transporting ATPase功能域含有高度保守的L-L-W-V-N基序，E1-E2 ATPase功能域含有4個(gè)不連續(xù)高度保守的G基序，表明大白菜ACA基因家族進(jìn)化具有固定的模式，進(jìn)化關(guān)系具有保守性。

研究表明，鈣離子在果實(shí)發(fā)育過程中起著重要的調(diào)控作用[47]。ACA基因家族蛋白作為調(diào)節(jié)鈣離子濃度的重要成員，其家族中某些基因的表達(dá)會(huì)影響果實(shí)發(fā)育。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，ACA基因主要集中在大白菜的果莢中表達(dá)，說明ACA基因可能在果莢發(fā)育過程中發(fā)揮主要作用。還有研究顯示，鈣離子在緩解非生物脅迫和生殖生長方面發(fā)揮重要作用[48-50]。在受到冷脅迫時(shí)，與的表達(dá)量比較有規(guī)律，均表現(xiàn)出上調(diào)趨勢，且都在4—12 h內(nèi)達(dá)到最高峰，在冷脅迫2—4 h出現(xiàn)急劇上升的趨勢，而在冷脅迫6 h內(nèi)上升趨勢較為緩和，這說明對(duì)低溫的感應(yīng)要比強(qiáng)。在鹽脅迫處理下，大部分ACA基因表達(dá)量呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，其中表達(dá)量呈現(xiàn)上升的趨勢，且在4—6 h內(nèi)出現(xiàn)急劇上升，說明對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)需要時(shí)間差。和具有潛在抵御冷害的作用，具有抵御鹽害的潛在生物學(xué)功能。這3個(gè)基因具體如何抵御非生物脅迫還需深入研究。轉(zhuǎn)錄組測序中花期表達(dá)量高的和，在自交授粉和異交授粉的差異性表達(dá)數(shù)據(jù)，可為后續(xù)進(jìn)一步研究大白菜有性生殖提供基礎(chǔ)。

CK：無載體注射煙草葉片；GFP：35s-GFP/pCAMBIA1300空載體在煙草葉片表達(dá)情況。標(biāo)尺=10 μm

4 結(jié)論

本研究篩選出18個(gè)大白菜ACA基因家族成員，可分為4組，不均勻分布在大白菜10條染色體上。低溫脅迫條件下，和被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，可能與大白菜低溫脅迫有關(guān)；鹽脅迫條件下，顯著上調(diào)，可能與大白菜抗鹽性有關(guān)；在自交/異交授粉中，和表達(dá)表現(xiàn)出相反的表達(dá)模式，其可能通過調(diào)控鈣離子參與大白菜有性生殖過程。

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Genome-Wide Identification and Expression Analysis of ACA Gene Family in

WANG Jie, WU XiaoYu, YANG Liu, DUAN QiaoHong, HUANG JiaBao

College of Horticulture Science and Engineering, Shandong Agricultural University/State Key Laboratory of Crop Biology, Tai’an 270108, Shandong

【Objective】The aim of this study was to identify ACA genes family from, and to analyze the commonness and characteristics of those genes, which provided data support for further revealing the evolutionary relationship of ACA family. At the same time, the expression ofafter self-pollination under abiotic stress was investigated, which laid the foundation for further exploring howas regulate calcium to perform some biological functions. 【Method】Based on Arabidopsis genome database, the ACA gene family ofwas identified by homologous alignment. The molecular weight, theoretical isoelectric point and other physicochemical properties were predicted by online software Expasy. The MEGA 5.0 software was used to construct phylogenetic tree, and the online software GSDS 2.0 was employed to draw gene structure map. According to the family gene location information, chromosome mapping was carried out in TBtools. Then, McscanX software was used to carry out the collinearity analysis of ACA family genes inand, and the online software PlantCARE was used to predict and analyze the promoter elements of. The protein conserved domains were analyzed by online tools Pfam and MEME. The expression ofgene in different tissues, abiotic stress and self-pollination were detected by qRT-PCR. 【aResult】A total of 18 ACA genes were systematically identified from, which were distributed on 10 chromosomes. According to the phylogenetic tree, four groups were classified, including 3, 4, 4 and 7 members. According to promoter element analysis, there were many light, abiotic stress and hormone response elements in the promoter of ACA family genes in, which indicated that ACA family genes had potential biological function of resisting stress. According to the analysis of protein domains, most of the ACA gene family proteins inhad four functional domains unique to the ACA family, 13 of which had N-terminal autoinhibitory domains. The results of qRT-PCR showed thatwere mainly expressed in flowers and pods, and the expression ofandgenes were up-regulated under chill stress, suggesting thatandhad potential biological functions in response to chill stress; the expression ofgene was up-regulated under salt stress, suggesting thathad potential biological functions in response to salt stress. There were significant differences in the expression ofandgenes between self-pollination and cross-pollination, suggesting thatandresponded to the self-incompatibility of. The subcellular localizations of these five genes were all located in the plasma membrane to verify their function of balancing ion concentration on the membrane. 【Conclusion】BraACAs protein structures contained four highly conserved domains. The expression ofwas specific in tissues, and five ACA family gene members encoded proteins located on the cell membrane, of which,,were associated with chilling and salt stress response, whileandwere associated with self-incompatibility reaction.

ACA gene family;Ca2+-ATPase; chilling stress; salt stress; self-incompatibility;

2021-01-25；

2021-06-01

山東省“雙頂”計(jì)劃（SYL2017YSTD06）、山東省農(nóng)業(yè)良種工程項(xiàng)目（2019LZGC006）

王潔，E-mail：17835423101@163.com。通信作者段巧紅，E-mail：duanqh@sdau.edu.cn。通信作者黃家保，E-mail：jbhuang2018@outlook.com

（責(zé)任編輯 趙伶俐）