李朝蕊，韓馨蕊，范鑫，黃峻榕，曹云剛，熊幼翎

超聲對(duì)豌豆分離蛋白結(jié)構(gòu)及乳化性能的調(diào)控效應(yīng)

李朝蕊1，韓馨蕊1，范鑫1，黃峻榕1，曹云剛1，熊幼翎2

1陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，中國西安 710021；2肯塔基大學(xué)動(dòng)物與食品科學(xué)系，美國肯塔基州列克星頓 40546

【目的】考察超聲波處理對(duì)豌豆分離蛋白（pea protein isolate，PPI）結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)的影響，揭示超聲處理對(duì)PPI乳化特性的調(diào)控機(jī)制，為豌豆蛋白作為天然乳劑及其相關(guān)產(chǎn)品在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用提供理論依據(jù)?！痉椒ā窟x用頻率為20 kHz、功率為600 W的超聲波經(jīng)不同時(shí)長（0、20、30、40和60 min）的預(yù)處理后制備改性豌豆蛋白（ultrasonic-pea protein isolate，U-PPI），再經(jīng)高壓均質(zhì)制備U-PPI乳液。通過自由氨基、總巰基、粒徑、溶解度及SDS-PAGE探究超聲波處理對(duì)豌豆蛋白理化性質(zhì)的影響；借助圓二色譜儀分析U-PPI二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化；通過內(nèi)源性色氨酸熒光測定分析U-PPI三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化；通過乳化活性指數(shù)、粒徑、乳液界面蛋白分布、Zeta電位和表觀黏度表征U-PPI的乳化能力和乳液穩(wěn)定性；借助激光共聚焦熒光顯微鏡觀察乳狀液的微觀結(jié)構(gòu)?！窘Y(jié)果】超聲波處理對(duì)PPI結(jié)構(gòu)具有顯著修飾作用，30—40 min的短時(shí)間超聲處理能夠顯著降低-螺旋并提高-折疊含量，使PPI的結(jié)構(gòu)更加舒展柔韌，更多的疏水基團(tuán)暴露在界面上，同時(shí)超聲波的解聚效應(yīng)還引起PPI的平均粒徑減小、溶解度顯著增大；因而在此條件下超聲處理對(duì)PPI結(jié)構(gòu)的修飾有利于其在油/水界面形成致密而穩(wěn)定的蛋白膜，有效地提高了PPI的乳化活性和乳狀液的穩(wěn)定性，微觀結(jié)構(gòu)也顯示其乳液粒徑更小、分布更加均勻。然而，60 min的長時(shí)間超聲處理會(huì)導(dǎo)致PPI的疏水重聚，溶解度降低，不利于其在油/水界面的吸附重排，降低了其乳化活性和乳液穩(wěn)定性。【結(jié)論】30和40 min超聲處理產(chǎn)生的空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)等對(duì)PPI具有顯著的解聚作用，促使蛋白分子結(jié)構(gòu)舒展，有利于其在油/水界面的吸附重排，從而顯著改善了豌豆蛋白的乳化性能。

超聲波改性；豌豆分離蛋白；結(jié)構(gòu)修飾；乳液穩(wěn)定性

0 引言

【研究意義】近些年有研究表明過多食用動(dòng)物蛋白可能會(huì)增加糖尿病和心血管疾病的患病幾率，因此，人們更傾向于攝入低脂、低熱量的植物源蛋白。豌豆蛋白作為一種新興的優(yōu)質(zhì)蛋白，因其豐富而均衡的營養(yǎng)價(jià)值和相對(duì)較低的成本，在食品工業(yè)中作為潛在的成分被給予更多的考慮[1-2]。但天然的豌豆蛋白溶解性并不理想，功能特性不夠突出，應(yīng)用范圍受到一定限制。因此，對(duì)豌豆蛋白進(jìn)行適當(dāng)改性，擴(kuò)展其應(yīng)用范圍，具有重要的商業(yè)意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物蛋白乳狀液及其相關(guān)產(chǎn)品的穩(wěn)定性在很大程度上取決于其加工或制備方法。通過對(duì)天然植物蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾可以改善其加工性能，現(xiàn)有的蛋白改性方法主要包括物理法、化學(xué)法和酶法[3]。相對(duì)于化學(xué)和酶法改性，物理修飾在食品研究與加工中的應(yīng)用更為廣泛，且具有用時(shí)短、安全性好以及對(duì)產(chǎn)品營養(yǎng)成分影響較小等優(yōu)點(diǎn)，物理法主要包括熱、高壓、超聲波、微波和擠壓處理等[4]。如PENG等[5]通過熱處理修飾豌豆蛋白（95℃，30 min），發(fā)現(xiàn)經(jīng)熱處理后的豌豆蛋白形成的乳狀液具有更高的蛋白質(zhì)吸附率和乳液穩(wěn)定性，這主要?dú)w因于熱處理對(duì)豌豆蛋白分子結(jié)構(gòu)的修飾。Yin等[6]在高壓（200和400 MPa）處理紅蕓豆分離蛋白時(shí)，發(fā)現(xiàn)高壓處理導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)展開，溶解度顯著提高，乳化活性和乳液穩(wěn)定性增強(qiáng)，表明高壓處理對(duì)蛋白質(zhì)的功能特性具有調(diào)控作用[7]。SHEN等[8]采用熱處理和微射流聯(lián)合處理來改善大豆蛋白的表面性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)微射流處理能以預(yù)熱溫度依賴的方式促使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)重排，進(jìn)而提高大豆蛋白的溶解性和乳化性。李燕燕[9]研究發(fā)現(xiàn)微波能夠通過使蛋白分子高速震動(dòng)，降低二硫鍵含量，調(diào)節(jié)二級(jí)結(jié)構(gòu)，提高大米蛋白溶解度。超聲波處理是一項(xiàng)具有成本效益的新興技術(shù)，在食品工業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用。超聲波修飾的潛在機(jī)制很大程度上歸因于蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象變化[4]：超聲波產(chǎn)生的高頻振蕩，作用于液體對(duì)蛋白質(zhì)大分子產(chǎn)生空化作用，能在瞬間產(chǎn)生較強(qiáng)的湍流和高能量剪切波，使蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的性質(zhì)與功能[10]。超聲處理對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)及性能的影響取決于超聲強(qiáng)度（超聲時(shí)間、溫度、功率等）。如O′SULLIVAN等[11]發(fā)現(xiàn)，采用一定強(qiáng)度的超聲預(yù)處理（20 kHz，～34 W·cm-2，2 min）小麥蛋白和大豆分離蛋白，會(huì)改善二者的溶解度和乳化性能，且較低強(qiáng)度聲能不足以破壞蛋白肽鏈內(nèi)的共價(jià)相互作用。李笑笑[12]對(duì)比200—800 W的高場強(qiáng)超聲波處理商用大豆分離蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)，200 W和400 W的功率促使蛋白分子聚合體被打散，平均粒徑變小；而600 W和800 W的功率使蛋白分子部分聚合，疏水相互作用增強(qiáng)，溶解度降低。CHANDRAPALA等[13]在處理10%葵花籽油水體系時(shí)，20 kHz頻率超聲處理形成的乳液效果最好，當(dāng)頻率升高為211 kHz 時(shí)，乳液無法形成。謝為峰等[14]采用不同的超聲功率對(duì)杏仁粕蛋白進(jìn)行處理，結(jié)果表明當(dāng)?shù)鞍诐舛葹?4 g?mL-1時(shí)，在超聲功率 500 W、超聲時(shí)間15 min的條件下，杏仁蛋白的溶解度最優(yōu)，達(dá)160 mg?g-1。因此，推測不同強(qiáng)度的超聲波處理，會(huì)對(duì)豌豆蛋白結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不同程度的修飾，進(jìn)而可以調(diào)控其乳化特性?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】雖然超聲對(duì)植物蛋白結(jié)構(gòu)及功能特性的調(diào)控已有一些研究，但超聲波處理對(duì)豌豆蛋白結(jié)構(gòu)及乳化性能的影響尚缺乏系統(tǒng)研究，其內(nèi)在調(diào)控機(jī)制也尚待明晰?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究系統(tǒng)探究不同時(shí)間超聲處理對(duì)豌豆蛋白結(jié)構(gòu)、粒徑、溶解度、乳化活性、乳化穩(wěn)定性等的影響，分析超聲誘導(dǎo)的蛋白結(jié)構(gòu)變化與其乳化性能改變之間的內(nèi)在關(guān)系，揭示超聲處理對(duì)豌豆蛋白結(jié)構(gòu)和乳化活性的調(diào)控機(jī)制，為改善豌豆蛋白的加工性能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2020年5月至2021年3月在陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)樓進(jìn)行。

1.1 主要材料與試劑

中豌八號(hào)青豌豆購置于沭陽唱亮園林綠化有限公司，真空包裝后保存。金龍魚大豆油購置于西安市未央?yún)^(qū)潤家超市。

DTNB（二硫代雙（2-硝基苯甲酸））購于麥克林公司，水溶性維生素E（Trolox）購于Sigma-Aldrich公司，TNBS購于美國Ark Pharm公司，其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

HR/T20MM立式高速冷凍離心機(jī)，湖南赫西儀器裝備有限公司；高速多功能粉碎機(jī)，武義海納電器有限公司；超聲波細(xì)胞破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；UV2900紫外可見分光光度計(jì)，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；高剪切分散乳化機(jī)，上海FLUKO公司；AH-BASIC I高壓均質(zhì)機(jī)，ATS納米技術(shù)（蘇州）有限公司；Mini-PROTEAN 3 Cell電泳儀，美國 Bio-Rad 公司；Haake-Mars 60流變儀，德國Thermo Fisher Scientific公司；安東帕Litesizer? 500納米粒度及Zeta電位分析儀，奧地利Anton Paar公司；熒光光譜儀Fs5，英國Edingburgh Instruments公司；圓二色譜儀，英國Applied Photophysics公司；Mastersizer 2000激光粒度分析儀，英國Malvern Instruments有限公司；LSM800激光共聚焦熒光顯微鏡，德國Carl Zeiss公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 豌豆分離蛋白（PPI）的制備 參考JIANG等[15]的方法，稱取5 kg豌豆種子，于40℃烘箱烘干后用高速多功能粉碎機(jī)破碎去皮（2 s左右），去皮后粉碎成30—200目的粗粉，用氣流磨粉機(jī)處理20 min得到豌豆細(xì)粉。用正己烷-乙醇混合溶劑（10﹕1，v/v）在抽濾裝置中對(duì)豌豆粉脫脂處理。將脫脂豆粉按一定比例與超純水混合，調(diào)節(jié)pH到8.0并攪拌2小時(shí)，在4℃下以10 000×離心30 min。調(diào)節(jié)上清液的pH至4.5，在4℃下以3 300×離心20 min。用超純水洗滌兩次，6 000×離心10 min。最終將沉淀分散在5倍的超純水中，調(diào)節(jié)pH至7.0。樣品經(jīng)過冷凍干燥后于4℃保存，取少量PPI測定其主要成分（水分、蛋白質(zhì)、灰分、脂肪含量）。

1.3.2 超聲改性處理 稱取樣品，配制成質(zhì)量濃度為30 mg?mL-1的豌豆分離蛋白溶液，pH調(diào)至7.0后攪拌2 h至充分溶解，取80 mL上述溶液于燒杯中冰浴超聲（溫度不高于20℃）。通過預(yù)試驗(yàn)對(duì)比了3組不同超聲功率（200、400和600 W）以及不同超聲時(shí)間（0—60 min）處理后PPI的溶解特性變化，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果及前人研究報(bào)道[16]，設(shè)定超聲細(xì)胞破碎機(jī)工作參數(shù)：工作4 s、間歇2 s，超聲頻率為20 kHz，超聲功率為600 W，超聲時(shí)間為0、20、30、40和60 min。超聲處理結(jié)束后，取部分豌豆蛋白溶液使用蒸餾水稀釋至4 mg?mL-1測定其溶解度；另一部分豌豆蛋白溶液經(jīng)冷凍干燥用于結(jié)構(gòu)等的測定。

1.3.3 自由氨基含量測定 參考LERTITTIKUL等[17]的方法并做修改，取200 μL 4 mg?mL-1的蛋白溶液于10 mL棕色離心管，加入2.0 mL 1% SDS（0.2 mol?L-1磷酸緩沖液（pH 8.2））、1.0 mL 0.01%的TNBS充分混合后，置于50℃水浴中避光反應(yīng)30 min，用2.0 mL 0.1 mol?L-1Na2SO3終止反應(yīng)后，室溫下放置 15 min?？瞻资窃谙嗤瑮l件下用蒸餾水代替反應(yīng)液。在420 nm波長處測定吸光值，每組樣品測定3次。自由氨基含量根據(jù)L-亮氨酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定。

1.3.4 總巰基含量測定 使用0.1 mol?L-1磷酸緩沖液（pH 7.4）將處理后的樣品稀釋為蛋白濃度2 mg?mL-1；以0.5 mL磷酸鈉緩沖液（0.1 mol?L-1、pH 7.4）代替蛋白液作為試劑空白，用于紫外分光調(diào)零。取0.5 mL于玻璃試管中，加入2.0 mL尿素-SDS溶液、50 μL DTNB（10 mmol?L-1）。渦旋混勻后，室溫下避光反應(yīng)15 min，于412 nm處測定吸光度值[18]。總巰基含量通過下式計(jì)算：

式中，：吸光度；ε =13 600 M-1?cm-1；D：稀釋倍數(shù)6；：蛋白濃度（mg?mL-1）。

1.3.5 圓二色譜測定 使用10 mmol?L-1磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）將U-PPI樣品稀釋至0.2 mg?mL-1，采用圓二色譜儀分析超聲改性豌豆蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。試驗(yàn)溫度：25℃，樣品池光程：2 mm，靈敏度：100 mdeg?cm-1，在180—260 nm掃描蛋白樣品的圓二色譜，累計(jì)掃描3次取其平均值并扣除緩沖液背景，使用CDNN軟件計(jì)算蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量。

1.3.6 內(nèi)源性色氨酸熒光測定 使用10 mmol?L-1磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）將U-PPI樣品稀釋為0.4 mg?mL-1，設(shè)置激發(fā)波長為290 nm，利用熒光光譜儀掃描樣品在300—400 nm的發(fā)射光譜。激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫寬均為5 nm，掃描3次。相同條件下記錄樣品緩沖液發(fā)射光譜，并從樣品發(fā)射光譜中扣除，以排除干擾[5]。

1.3.7 粒度測定 配制4 mg?mL-1豌豆蛋白溶液，磁力攪拌2 h使蛋白充分溶解，顆粒分散均勻。采用激光納米粒徑分布儀對(duì)蛋白顆粒大小進(jìn)行測定。參數(shù)如下：分散劑為10 mmol?L-1PBS（pH 7.0）；分散劑折射率：1.3318；得粒徑體積分布圖。

1.3.8 SDS-PAGE 在還原（+DTT）和非還原（-DTT）條件下，使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）對(duì)超聲改性豌豆蛋白的分子量分布情況進(jìn)行分析。參考LIU等[19]、JIANG等[20]的方法并適當(dāng)修改，濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為12%。將樣品稀釋為4 mg?mL-1，與樣品緩沖液等體積混合，于沸水浴加熱3 min后立即冷卻，每孔上樣量為15 μL，染色脫色后拍照，對(duì)電泳條帶進(jìn)行分析。

1.3.9 溶解度測定將制備的樣品稀釋為質(zhì)量濃度為4 mg?mL-1溶液，9 000 r/min離心20 min，采用雙縮脲法測定上清液中可溶性蛋白質(zhì)含量。溶解度計(jì)算公式如下：

。

1.3.10 U-PPI乳狀液的制備 使用10 mmol?L-1磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）稀釋制備質(zhì)量濃度為10 mg?mL-1的U-PPI溶液，加入10%（v/v）純大豆油并混合，13 000 r/min剪切2 min后，30 MPa高壓均質(zhì)循環(huán)2次，于4℃貯藏[16]。

1.3.11 乳化活性的測定 將均質(zhì)得到的乳液快速地轉(zhuǎn)移到100 mL燒杯中，分別在放置0和10 min時(shí)，從底部取樣5 μL，加入5 mL 0.1% SDS，渦旋振蕩10 s，以SDS溶液為空白并測定500 nm處的吸光度[14]。乳化活性（EAI）用下式計(jì)算：

式中，：稀釋倍數(shù)，：初始蛋白濃度（g?mL-1），：乳液中油的體積分?jǐn)?shù)（v?v-1）。

1.3.12 乳液粒徑的測定 在25℃下采用Mastersizer 2 000激光粒度分析儀測定乳液的平均粒徑大小，分別將各組乳液分散于800 mL蒸餾水中，添加樣品使遮光度達(dá)到10%—13%，重復(fù)測定3次取其平均值。

1.3.13 界面蛋白分布 參考JIANG等[20]的方法，將乳狀液在15 000×離心30 min，得到乳化層和乳清層。取下部乳清層在15 000×再次離心30 min，小心吸取下層清液，并通過0.22 μm濾膜。將得到的濾液稀釋到一定濃度，用雙縮脲法測定蛋白含量。PPI在兩相中分配系數(shù)（partition coefficient，PC）的計(jì)算：

式中，V：水相體積（mL）；l：油相體積（mL）；W：總蛋白含量（mg?mL-1）；W：水相中蛋白含量（mg?mL-1）。油的密度按0.922 g?mL-1計(jì)算。水相中PPI占總PPI的比例計(jì)算公式為（Ww/Wt）×100%；界面上PPI所占比例通過總PPI和水相中PPI的含量之差計(jì)算。

1.3.14 ζ電位的測定 用0.01 mol?L-1的磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）將乳狀液稀釋至質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5 mg?mL-1，使用激光納米粒度儀測定。

1.3.15 剪切黏度的測定 根據(jù)文獻(xiàn)[21]的方法并稍作修改后，采用Haake-Mars 60流變儀測定乳液的黏度隨剪切速率的變化。測定選用直徑為35 mm的不銹鋼平行板轉(zhuǎn)子，設(shè)定間距為1 mm，測定溫度25℃，平衡時(shí)間3 min，剪切速率從0.1到100 s-1。

1.3.16 乳液微觀結(jié)構(gòu)的測定 為了評(píng)估油滴的大小和分布，采用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察乳液的微觀結(jié)構(gòu)。參照LI等[22]的方法并略作修改，取1 mL乳液與40 μL混合染液（0.01%尼羅紅和0.01%尼羅藍(lán)）充分混合均勻，取8 μL染色乳液放在顯微鏡載玻片上，蓋上蓋玻片后避光反應(yīng)0.5 h。在顯微鏡下觀察時(shí)，使用488 nm（氬激光）和633 nm（氦氖激光）的激發(fā)波長觀察油滴的分布，用63×油浸物鏡采集圖像。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

使用Statistix 9.0分析軟件通用線性模型程序（Analytical Software，Tallahassee，F(xiàn)L，USA）對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。采用LSD全配對(duì)多重比較方法進(jìn)行顯著性分析，值設(shè)置為0.05。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示，并使用Origin 8.5軟件繪圖。

2 結(jié)果

2.1 超聲波處理對(duì)PPI結(jié)構(gòu)的影響

2.1.1 對(duì)PPI側(cè)鏈氨基酸功能基團(tuán)的修飾 如圖1所示，未超聲處理的PPI中總巰基含量約為18.68 nmol?mg-1，隨著超聲處理時(shí)間的延長，總巰基含量總體呈顯著下降趨勢。當(dāng)超聲時(shí)間為60 min時(shí)，總巰基含量最低，為12.87 nmol?mg-1，相比未超聲處理下降了31%（<0.05）。未超聲處理的PPI中自由氨基含量為85.3 nmol?mg-1，20 min超聲后其自由氨基含量降低了12.9%（<0.05）。超聲時(shí)間30、40 min時(shí)，自由氨基含量又有所提高，在超聲處理60 min時(shí)，PPI的自由氨基含量最低，為68.4 nmol?mg-1，相比未超聲處理下降了19.81%（<0.05）。

2.1.2 對(duì)PPI二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響 蛋白質(zhì)分子內(nèi)多肽鏈由-螺旋、-折疊、-轉(zhuǎn)角以及無規(guī)則卷曲等特定的立體結(jié)構(gòu)構(gòu)成，這些結(jié)構(gòu)的變化可反映蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。由圖2可以看出，超聲處理對(duì)PPI二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響比較顯著，引起了二級(jí)結(jié)構(gòu)之間的相互轉(zhuǎn)化。在超聲處理0—40 min時(shí)，PPI的-螺旋結(jié)構(gòu)比例隨超聲時(shí)間延長而降低，同時(shí)-折疊結(jié)構(gòu)比例隨超聲時(shí)間延長而增加。在超聲處理40 min時(shí)，-螺旋結(jié)構(gòu)比例最低，為8.80%，而-折疊結(jié)構(gòu)比例達(dá)到最高，為38.18%，表明適度超聲處理誘導(dǎo)蛋白質(zhì)分子更加舒展、柔性增強(qiáng)。然而當(dāng)超聲時(shí)間繼續(xù)延長至60 min時(shí)，-螺旋比例又有所上升，同時(shí)-折疊比例有所下降。

2.1.3 對(duì)PPI三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響 蛋白質(zhì)色氨酸殘基的熒光特性對(duì)其微環(huán)境非常敏感，其變化可以反映蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化[8]。如圖3所示，未經(jīng)處理的PPI處于折疊狀態(tài)，色氨酸殘基處在蛋白內(nèi)部的疏水性環(huán)境中，具有較大的熒光強(qiáng)度；經(jīng)超聲處理20—40 min后，PPI的內(nèi)源熒光強(qiáng)度隨超聲時(shí)間延長而顯著降低，這是由于適度超聲處理導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開（圖2），色氨酸殘基暴露于親水性溶劑中所致[8]；當(dāng)超聲時(shí)間繼續(xù)延長至60 min時(shí)，PPI的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，再一次說明PPI發(fā)生了重聚。

2.2 超聲處理對(duì)PPI解聚、交聯(lián)情況及溶解度的影響

2.2.1 對(duì)PPI粒徑分布和溶解度的影響 圖4為不同超聲時(shí)間處理?xiàng)l件下PPI的平均粒徑和溶解度。相對(duì)于未處理的PPI，超聲波處理的PPI平均粒徑顯著降低了70%以上（<0.05），在超聲時(shí)間20—60 min時(shí)，PPI粒徑隨超聲處理時(shí)間延長而逐漸降低，60 min時(shí)最低，為95.47 nm。這可能是由于超聲波的空穴效應(yīng)使溶液形成湍流，產(chǎn)生的機(jī)械剪切力將PPI聚集體打散[23]。

Con：未超聲處理。不同小寫字母和不同大寫字母分別代表同一指標(biāo)在不同處理間差異顯著（P<0.05）。下同

圖2 不同超聲處理時(shí)間對(duì)PPI二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

圖3 不同超聲處理時(shí)間對(duì)PPI內(nèi)源性色氨酸熒光的影響

溶解度是蛋白重要的功能特性之一，可以間接反映蛋白分子間以及蛋白與水分子間的相互作用力。超聲處理對(duì)PPI溶解性的影響如圖4所示。在20—40 min時(shí)，超聲處理能顯著提高豌豆分離蛋白的溶解度，在超聲條件為40 min時(shí)，溶解度達(dá)到最大，為85.27%，相比于未處理的PPI，溶解度上升了10.97%，存在顯著性差異（<0.05）。謝為峰[14]也研究發(fā)現(xiàn)，在一定范圍內(nèi)，超聲處理時(shí)間越久，杏仁粕蛋白的溶解度越大。然而超聲處理60 min使PPI的溶解度降低為75.95%，與未處理PPI的溶解度相當(dāng)，差異不顯著（＞0.05）。

圖4 不同超聲時(shí)間處理對(duì)PPI粒徑和溶解度的影響

2.2.2 超聲處理對(duì)PPI亞基的影響 PPI主要包含豆球蛋白（legumin，11S）、豌豆球蛋白（vicilin，7S）以及伴豌豆球蛋白（convicilin）[24]。11S球蛋白由六對(duì)非共價(jià)亞基組成，每對(duì)亞基由一個(gè)酸性亞基（leg A）和一個(gè)堿性亞基（leg B）通過一個(gè)二硫鍵連接而成。7S球蛋白是三聚體，其亞基通過疏水作用而非二硫鍵結(jié)合在一起。Convicilin相對(duì)分子質(zhì)量為71—75 kD，它含有含硫氨基酸和一個(gè)高電荷的N-端延伸。20—40 min超聲波處理對(duì)PPI的亞基條帶無顯著影響（圖5），但60 min超聲波處理時(shí)，部分11S、7S球蛋白亞基條帶變淺（圖5），同時(shí)在11—14.4 kD，小分子蛋白質(zhì)條帶加深（圖5-A），這說明高強(qiáng)度超聲處理導(dǎo)致PPI的部分11S和7S球蛋白亞基斷裂形成了小分子物質(zhì)。這一研究結(jié)果與包中宇[25]等利用超聲波改性大豆蛋白的研究結(jié)果類似。由于11S和7S兩種蛋白均以-折疊結(jié)構(gòu)為主，過度超聲引起的11S和7S球蛋白亞基減少可能是其導(dǎo)致PPI中-折疊結(jié)構(gòu)降低（圖2）的重要原因。還原性條件下，在11—14.4 kD附近的小分子條帶基本消失，說明這些小分子之間存在二硫鍵，高強(qiáng)度超聲處理導(dǎo)致PPI巰基含量顯著降低（圖1）也從側(cè)面印證了這一推測。

圖5 不同超聲時(shí)間處理對(duì)PPI亞基的影響

2.3 超聲處理對(duì)PPI乳化性能的影響

2.3.1 對(duì)PPI乳化活性的影響 如圖6所示，PPI的乳化活性隨著超聲時(shí)間（0—30 min）的延長而逐漸增加，當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到30 min時(shí)，蛋白質(zhì)的乳化性達(dá)到最大，為18.45 m2?g-1；相比未處理的蛋白，乳化活性提高了20.1%（<0.05）。超聲處理40 min時(shí)，PPI的乳化活性與30 min處理無顯著差異（＞0.05）。當(dāng)超聲處理時(shí)間為60 min時(shí)，PPI的乳化活性明顯降低，但仍略高于未處理PPI的乳化活性。因此，適度的超聲處理對(duì)于PPI乳化活性的提高具有積極的影響。

2.3.2 對(duì)PPI乳液粒徑分布和Zeta電位的影響 液滴直徑是評(píng)估乳液乳化穩(wěn)定性的重要參數(shù)[26]。由圖7-A可以看出，未改性豌豆蛋白乳狀液的粒徑分布曲線含有3個(gè)峰，其平均粒徑為15.11 μm。與未改性PPI乳液相比，超聲波處理過的PPI（U-PPI）制備的乳狀液，其乳液的粒徑分布更加集中，平均粒徑明顯降低（<0.05）。經(jīng)超聲處理20、30和40 min的U-PPI所制備的乳液，其粒徑分布曲線含有2個(gè)峰；經(jīng)60 min改性處理過的PPI制備的乳液，其粒徑分布曲線為單峰。與此相對(duì)應(yīng)，隨著超聲處理時(shí)間延長，U-PPI所制備的乳液，其粒徑大小呈下降趨勢。60 min改性處理過的U-PPI制備的乳液，平均粒徑為2.78 μm，相比未改性PPI乳液的平均粒徑減小了81.6%（<0.05）。

圖6 不同超聲時(shí)間處理對(duì)PPI乳化活性的影響

Zeta電位可以反映物質(zhì)表面電位的變化，是衡量食品乳液中液滴之間靜電相互作用水平和乳液體系穩(wěn)定性的關(guān)鍵參數(shù)。如圖7-B所示，與未處理的PPI乳液相比，U-PPI制備的乳液，其Zeta電位絕對(duì)值明顯升高（<0.05）。超聲處理20和30 min的U-PPI制備的乳液，其Zeta電位值無顯著差異，此后隨超聲處

圖7 不同超聲時(shí)間處理對(duì)PPI乳液粒徑分布和Zeta電位的影響

理時(shí)間延長，U-PPI所制備乳液的電位絕對(duì)值逐漸升高，在60 min時(shí)，Zeta電位的絕對(duì)值達(dá)到最高，相比于未處理PPI提高了48.2%（<0.05）。這可能是由于超聲能夠促使一些帶電荷的氨基酸殘基暴露，覆蓋在油滴上提高了界面電荷并改變了界面的電雙層。Zeta電位絕對(duì)值的增加表明乳液液滴之間的靜電斥力增加，預(yù)示著乳液體系穩(wěn)定性的提高。

2.3.3 對(duì)PPI乳液界面蛋白分布的影響 未處理的PPI乳液的水相蛋白含量最高，而兩相界面蛋白含量最低。超聲處理可以顯著提高PPI在油水兩相界面上的分布：當(dāng)超聲時(shí)間為20—30 min時(shí)，超聲波處理過的U-PPI制備乳液的界面蛋白含量隨超聲時(shí)間延長而增加，且超聲處理30 min時(shí)，其界面蛋白含量最高，為72.67%，相比未處理組提高了17.2%（<0.05）。但當(dāng)超聲時(shí)間為40—60 min時(shí)，界面蛋白含量隨超聲時(shí)間延長呈現(xiàn)減少趨勢（表1）。

表1 不同超聲時(shí)間處理對(duì)PPI乳液界面蛋白分布的影響

2.4 對(duì)PPI乳液剪切黏度的影響

超聲處理會(huì)影響PPI乳液的表觀黏度，不同乳液的表觀黏度隨著剪切速率的變化曲線如圖8所示。未超聲處理PPI的乳液初始黏度為0.06 Pa·s，隨著剪切速率的增加，乳液的表觀黏度呈現(xiàn)下降趨勢，表現(xiàn)出剪切變稀的特性。超聲處理可以顯著提高PPI乳液的表觀黏度，但不會(huì)改變?nèi)橐旱募羟凶兿√匦訹27]。其中超聲處理40 min時(shí)，U-PPI制備乳液的表觀黏度值最大，相比未處理的PPI乳液，其初始黏度提高了33.3%。超聲處理20、30和60 min時(shí)，U-PPI制備的乳液表觀黏度相差不大，但均顯著高于未改性PPI乳液。超聲對(duì)乳液表黏度的影響可能與其對(duì)蛋白質(zhì)在界面膜上的吸附重構(gòu)調(diào)控有關(guān)[28]。

圖8 不同超聲時(shí)間處理對(duì)PPI乳液表觀粘度的影響

2.5 對(duì)PPI乳液微觀結(jié)構(gòu)的影響

通過觀察PPI乳液的微觀結(jié)構(gòu)（圖9）可以反映乳液中油滴和蛋白質(zhì)間相互作用和分布情況，進(jìn)一步揭示超聲處理對(duì)PPI乳化性能的影響[22,29]。本研究采用488 nm（氬激光）和633 nm（氦氖激光）的激發(fā)波長分別觀察油滴（紅色）和水相蛋白質(zhì)（藍(lán)色）的分布情況。未超聲處理的PPI乳液，其油滴尺寸較大，分布不均勻，有一些油滴共用蛋白發(fā)生了聚集。而20—40 min超聲處理U-PPI制備的乳狀液，其油滴呈現(xiàn)顆粒分明的球狀，分布更加均勻；且隨著超聲處理時(shí)間的延長，乳液粒徑變小，分散也更加均勻。而60 min超聲處理過的U-PPI制備的乳狀液，其乳液顆粒體積增大，呈不規(guī)則球狀或串珠狀，液滴形態(tài)多樣且分布不均一，說明過長時(shí)間的超聲作用不利于PPI形成穩(wěn)定的乳液。

3 討論

3.1 超聲處理改變了PPI的結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與其乳化性等加工性能密切相關(guān)，超聲誘導(dǎo)的PPI結(jié)構(gòu)改變表現(xiàn)為氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)修飾、CD圖譜及內(nèi)源性色氨酸熒光光譜的變化。總巰基和自由氨基含量可以反映超聲誘導(dǎo)的PPI一級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。本研究發(fā)現(xiàn)隨著超聲時(shí)間的延長，PPI的總巰基含量顯著下降，推測是超聲波作用產(chǎn)生大量具有高能量和高熱量的空穴氣泡，促進(jìn)了體系中自由基的形成，誘發(fā)了蛋白的氧化，導(dǎo)致巰基轉(zhuǎn)化為二硫鍵。與之類似，GüLSEREN[30]在研究超聲處理BSA時(shí)，發(fā)現(xiàn)隨著超聲時(shí)間的延長，BSA的巰基含量逐漸降低。謝為峰[14]研究發(fā)現(xiàn)低強(qiáng)度的超聲處理可誘導(dǎo)杏仁粕蛋白分子內(nèi)巰基含量減少，二硫鍵含量增加。但HU等[31]發(fā)現(xiàn)超聲處理（15或30 min）后大豆分離蛋白的游離巰基含量顯著升高，作者認(rèn)為超聲導(dǎo)致蛋白中原有的二硫鍵斷裂、巰基含量升高。因此，超聲對(duì)于蛋白巰基含量的影響可能與不同超聲條件、蛋白種類和蛋白分子的原始空間結(jié)構(gòu)等不同有關(guān)。同樣，超聲處理也引起了PPI中自由氨基含量的降低，可能是由于超聲波的熱效應(yīng)和空穴效應(yīng)促使體系產(chǎn)生自由基，攻擊PPI中賴氨酸側(cè)鏈的-NH2基團(tuán)，經(jīng)脫氨基反應(yīng)生成羰基，生成的羰基可以進(jìn)一步與NH2發(fā)生羰氨反應(yīng)或與組氨酸（His）、賴氨酸（Lys）生成Schiff堿，使自由氨基含量進(jìn)一步降低（圖1）[32-33]。

尼羅紅和尼羅藍(lán)分別用來染油滴（紅色）和水相蛋白質(zhì)（藍(lán)色），上圖為單獨(dú)油滴分布，下圖為油滴在水相中的分布情況

圓二圖譜可以提供蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的信息，反映蛋白質(zhì)中-螺旋、-折疊、-轉(zhuǎn)角以及無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的變化。20—40 min超聲處理會(huì)破壞蛋白質(zhì)分子的完整性（圖2）。推測是超聲的空化作用引起PPI肽鏈氨基酸上羰基和酰胺基團(tuán)之間的氫鍵斷裂，-超螺旋結(jié)構(gòu)解旋，促使維系蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的剛性部分減弱，使PPI的構(gòu)象向柔性部分轉(zhuǎn)變，蛋白結(jié)構(gòu)更加舒展。這與報(bào)道的超聲誘導(dǎo)大豆蛋白[34-35]、米糠蛋白[36]等的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量變化類似。當(dāng)超聲處理60 min時(shí)，PPI的二級(jí)結(jié)構(gòu)改變出現(xiàn)相反變化：-螺旋含量上升、-折疊含量下降，這說明過度超聲處理會(huì)使蛋白質(zhì)展開的二級(jí)結(jié)構(gòu)通過分子間相互作用重新聚集。

超聲處理顯著地影響了PPI的三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖3），超聲波的空穴作用使埋藏于分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露，被包圍在PPI內(nèi)部疏水性核心的色氨酸殘基暴露到溶劑中，表現(xiàn)為PPI的熒光強(qiáng)度降低。與CD結(jié)果相對(duì)應(yīng)：在超聲時(shí)間0—40 min，PPI在最大發(fā)射峰處的熒光強(qiáng)度隨著超聲時(shí)間延長而降低，說明超聲后PPI的三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，局部蛋白結(jié)構(gòu)展開。在大豆蛋白[25]、牡蠣蛋白[37]和辣木種子蛋白[38]的超聲改性研究中，也發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性色氨酸熒光強(qiáng)度下降的現(xiàn)象。然而過長時(shí)間（60 min）的超聲處理導(dǎo)致PPI內(nèi)源熒光強(qiáng)度顯著上升，這可能是由于過度超聲導(dǎo)致結(jié)構(gòu)展開的蛋白分子間疏水相互作用及共價(jià)相互作用加劇，從而形成了新的聚集物。

3.2 適度超聲處理能夠降低PPI的粒徑，提高其溶解性

PPI結(jié)構(gòu)上的改變可以引起其他理化性質(zhì)方面的變化。超聲處理可能會(huì)對(duì)PPI分子間氫鍵和分子間疏水相互作用造成破壞，從整體上降低蛋白分子之間的化學(xué)相互作用力[39-40]，進(jìn)而對(duì)PPI的平均粒徑及溶解度造成影響。本研究中，超聲波誘導(dǎo)的蛋白解聚作用使PPI粒徑顯著變小，且粒徑大小隨超聲處理時(shí)間（0–60 min）的延長而逐漸降低（圖4）。ARZENI等[26]在研究超聲波處理卵清蛋白、大豆蛋白和蛋清蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)超聲處理能夠降低團(tuán)聚體的粒徑，推測是由于超聲波的空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)等作用，使大顆粒的蛋白聚集體解聚成較小顆粒的蛋白分子。蛋白質(zhì)的溶解度受到很多因素的影響，如蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、粒度、蛋白分子大小等。試驗(yàn)結(jié)果顯示（圖4），較短時(shí)間（0— 40 min）超聲后，蛋白質(zhì)的溶解性隨超聲時(shí)間的延長而顯著增加，這個(gè)結(jié)果和國內(nèi)外的相關(guān)研究一致[8,35]。這是因?yàn)椋海?）適度超聲處理能夠修飾PPI結(jié)構(gòu)，促使更多的親水基團(tuán)暴露，強(qiáng)化蛋白質(zhì)-水以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用，形成了更多可溶解的蛋白；（2）適度超聲處理減小了PPI粒度，使其與水接觸的表面積增大，蛋白更容易發(fā)生水化作用。但隨改性處理的持續(xù)進(jìn)行（60 min），高強(qiáng)度超聲作用會(huì)導(dǎo)致PPI的溶解度降低。與本研究結(jié)果基本一致，SUI等發(fā)現(xiàn)[41]短時(shí)間（450 W、12 min）超聲有利于提高大豆分離蛋白的溶解度，但處理時(shí)間的增加（24 min）會(huì)導(dǎo)致溶解度的降低。這可能是高強(qiáng)度超聲作用會(huì)誘發(fā)蛋白空間結(jié)構(gòu)的過度修飾，暴露的親水基團(tuán)被重新包埋，疏水相互作用及共價(jià)作用促使蛋白重新聚集，溶解度降低。

3.3 適度超聲處理提高了PPI的乳化活性和乳液穩(wěn)定性

超聲波處理通過影響PPI的氨基酸側(cè)鏈活性基團(tuán)和空間構(gòu)象，進(jìn)而調(diào)控其理化和功能特性。乳化性是蛋白質(zhì)的一項(xiàng)重要的功能性質(zhì)，主要包括乳化活性和乳化穩(wěn)定性兩方面。PPI的乳化性受到蛋白的結(jié)構(gòu)柔韌性、表面性質(zhì)、蛋白粒徑和溶解度等重要因素的影響[12,16,42]。在本研究中，適度超聲處理（20—40 min）能夠顯著提高PPI的乳化活性，尤其是40 min超聲處理效果最好。這主要是因?yàn)槌暱栈?yīng)可誘導(dǎo)PPI解聚分散為粒徑小且均一、可溶性高（圖4）、擴(kuò)散速度快的球蛋白，并促使蛋白質(zhì)分子鏈的快速運(yùn)動(dòng)和去折疊（圖2），暴露出更多的疏水基團(tuán)（圖3），增強(qiáng)了蛋白分子在油水界面吸附及定向重排（使疏水性基團(tuán)位于油相中，親水基團(tuán)處于水相中）的能力，進(jìn)而在油水界面形成一層結(jié)構(gòu)致密的粘彈性膜（表1）[4,21,43]、提高了PPI的乳化活性（圖6）和乳液穩(wěn)定性（圖7—9）。與之類似，TAHA等[44]在超聲改性大豆蛋白中也發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)顆粒越小，更容易快速擴(kuò)散到油滴表面，通過重新排列成膜降低了界面張力，避免了油滴聚集。O'SULLIVAN等[11,27]發(fā)現(xiàn)用超聲波處理過的SPI制備的乳劑具有增強(qiáng)的界面層和更大的靜電斥力。CHEN等[35]研究發(fā)現(xiàn)超聲與酶解復(fù)合改性可以改善大豆蛋白的分子柔性、提高其溶解度和蛋白質(zhì)在油水界面的吸附分?jǐn)?shù)，顯著提高了其乳化活性和乳化穩(wěn)定性。

然而過長時(shí)間（60 min）的超聲處理會(huì)加劇PPI的氧化程度（圖1），增強(qiáng)蛋白分子之間疏水相互作用，促進(jìn)蛋白分子之間二硫鍵和其他共價(jià)鍵的形成，導(dǎo)致PPI重新聚集、溶解度及分子柔性降低，在界面膜上的吸附和重排效率變低，降低了PPI的乳化性能。綜上所述，通過合理控制超聲改性強(qiáng)度可以有效調(diào)控PPI的結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)，進(jìn)而改善其乳化性能。

4 結(jié)論

不同時(shí)間超聲處理顯著修飾了PPI的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而改變了其乳化性能。其中30—40 min的超聲處理能最大程度地增加PPI的-折疊含量，提高蛋白分子柔性，明顯降低了PPI的粒徑大小，提高了其溶解度，促進(jìn)PPI在油水界面的吸附和重排，顯著提高了PPI的乳化活性和乳液穩(wěn)定性。因此，適度超聲改性是提高豌豆分離蛋白乳化性能的有效方法，對(duì)擴(kuò)大豌豆蛋白作為一種重要功能成分在食品和飲料工業(yè)中的應(yīng)用具有重要的價(jià)值。

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Regulation Effects of Ultrasound on the Structure and Emulsification Properties of Pea Protein Isolate

LI ZhaoRui1, HAN XinRui1, FAN Xin1, HUANG JunRong1, CAO YunGang1, XIONG YouLing2

1School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi’an 710021, China;2Department of Animal and Food Sciences, University of Kentucky,Lexington 40546, KY, United States

【Objective】This study was designed to investigate the effects of ultrasonic treatment on the structure and physicochemical properties of pea protein isolate (PPI), and to explore the regulation mechanism of ultrasonic treatment on the emulsifying characteristics of PPI, so as to provide the theoretical basis for the application of PPI as natural emulsions or related products in the food field. 【Method】 The ultrasonic-pea protein isolate (U-PPI) was prepared by ultrasonic wave with frequency of 20 kHz and power of 600 W under different times (0, 20, 30, 40 and 60 min), and then U-PPI emulsions were prepared by high pressure homogenization. The effects of ultrasonic treatment on the physicochemical properties of PPI were investigated by the tests of free amino group, total sulfhydryl group, particle size, solubility and SDS-PAGE. The changes in secondary and tertiary structure of U-PPI were analyzed by circular dichroism and intrinsic tryptophan fluorescence, respectively. The emulsifying ability and emulsion stability of U-PPI were characterized by emulsion activity index, particle size, protein distribution at the interface of emulsion, Zeta potential and apparent viscosity. The microstructure of the emulsions was observed by using laser confocal fluorescence microscopy. 【Result】Ultrasonic treatment significantly modified the structure of PPI, i.e., a short time (30 to 40 min) ultrasonic treatment significantly reduced the-helix content and improved the-sheet content of PPI, which made the structure of the PPI more flexible and more hydrophobic groups exposed to the interface. Simultaneously, the depolymerization effect of ultrasonic also caused the decrease of the average particle size and the significant increase of the solubility of PPI. Therefore, the modification of PPI by a short time ultrasonic treatmentwas conducive to the formation of a dense and stable protein film at the oil/water interface, which effectively improved the emulsifying activity of PPI and the stability of the emulsions, and the microstructure of the emulsions also showed that the particle sizes of emulsions stabilized with U-PPI were smaller, and the droplet distribution was more uniform. However, a long time (60 min) ultrasonic treatment caused the hydrophobic repolymerization and insolubility of PPI, which was not conducive to the adsorption and rearrangement of PPI in the oil/water interface and thus reduced the emulsifying activity and emulsion stability. 【Conclusion】The cavitation effect and mechanical effect produced by a short time (30, 40 min) ultrasonic treatment had significant depolymerization effect on PPI, which promoted the protein structure more flexible and was beneficial to the adsorption and rearrangement of PPI at the oil/water interface, and thus significantly improved the emulsifying properties of PPI.

ultrasonic modification; pea protein isolate; structural modification; emulsion stability

2021-04-11；

2021-07-27

國家自然科學(xué)基金青年基金（32001762，31801480）、陜西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃一般項(xiàng)目（2021NY-146）、陜西省科技廳自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（2019JQ-397）

李朝蕊，E-mail：1762903310@qq.com。通信作者曹云剛，E-mail：caoyungang@sust.edu.cn。通信作者熊幼翎，E-mail：ylxiong@uky.edu

（責(zé)任編輯 趙伶俐）