孟鑫，花鎮(zhèn)東，賈薇，劉翠梅，劉杉，陳月猛

1.公安部禁毒情報(bào)技術(shù)中心 毒品監(jiān)測(cè)管控與禁毒關(guān)鍵技術(shù)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.貴陽市公安局禁毒支隊(duì)，貴州 貴陽 550081

近年來，新精神活性物質(zhì)（new psychoactive sub?stance，NPS）問題呈高速發(fā)展蔓延態(tài)勢(shì)，新品種層出不窮，濫用形勢(shì)日趨嚴(yán)峻[1-3]。合成大麻素是NPS中包含種類最多、更新?lián)Q代最快的類別。截至2020年8月，聯(lián)合國(guó)毒品和犯罪問題辦公室（United Nations Office on Drugs and Crime，UNODC）統(tǒng)計(jì)各國(guó)發(fā)現(xiàn)的NPS已達(dá)1 004種，其中包含合成大麻素300余種[1-2]。截至2020 年，國(guó)家毒品實(shí)驗(yàn)室累計(jì)發(fā)現(xiàn)的NPS 達(dá)317 種，其中合成大麻素為101種，占31.9%[4]。

合成大麻素是人工合成的大麻素受體（cannabi?noid receptor，CB）的激動(dòng)劑，從結(jié)構(gòu)上可分為苯甲?；胚犷?、苯乙?；胚犷悺⑤良柞；胚犷?、萘甲基吲哚類、萘甲?；量╊悺⒍讲⑦拎?、苯己基酚類、吲哚酰胺類、吲唑酰胺類等。合成大麻素作用于人體中樞型受體CB1和末梢型受體CB2，效果與天然大麻素類似，但致幻效果更強(qiáng)，導(dǎo)致吸食者自殘、自殺的案例時(shí)有發(fā)生。根據(jù)歐洲毒品和毒癮監(jiān)測(cè)中心（European Monitoring Centre for Drugs and Drug Ad?diction，EMCDDA）報(bào)告顯示，2014 年，合成大麻素N-（1-甲氧基羰基-2，2-二甲基丙基）-1-（4-氟芐基）吲唑-3-甲酰胺（MDMB-FUBINACA）在俄羅斯造成了超過600 人中毒，15 人死亡；2016 年，合成大麻素N-（1-甲氧基羰基-2，2-二甲基丙基）-1-（環(huán)己基甲基）吲哚-3-甲酰胺（MDMB-CHMICA）在歐洲造成25人重度中毒，28 人死亡[5]。近年來，含有合成大麻素類物質(zhì)的“小樹枝”“煙葉”“煙絲”“娜塔莎”“電子煙油”等新型毒品在國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上不斷涌現(xiàn)[6-10]，其主要濫用方式是噴涂于煙絲、花瓣等植物表面或溶于電子煙油吸食。截至2020年3月底，新疆公安機(jī)關(guān)共破獲含合成大麻素的“娜塔莎”案件上百起，相關(guān)犯罪案件急劇上升[9]。

近年來，合成大麻素制品在國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上不斷涌現(xiàn)，由于其含量相對(duì)較低，新結(jié)構(gòu)化合物不斷出現(xiàn)且對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品難以及時(shí)獲得，給化合物的定性分析工作帶來了很大的挑戰(zhàn)[6-8]。近期，本實(shí)驗(yàn)室收到地方公安部門送檢的1 份植物樣品，經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析，推測(cè)其可能含有合成大麻素成分，但與NIST 譜庫(kù)及實(shí)驗(yàn)室自建NPS 譜庫(kù)檢索比對(duì)無匹配結(jié)果。由于缺乏標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)，僅依靠質(zhì)譜圖無法確定其準(zhǔn)確結(jié)構(gòu)。對(duì)于未知化合物的結(jié)構(gòu)確證，一般需要得到一定量的純度較高的樣品，并綜合利用質(zhì)譜、核磁共振波譜、紅外光譜等進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析[11-13]。為了得到高純度未知物樣品，本研究建立了采用制備液相從低純度植物制品中分離、純化合成大麻素的方法，并采用GC-MS、超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-quad?rupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-QTOFMS）、核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）對(duì)制備樣品進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，擬為植物制品中低含量未知合成大麻素的定性分析提供解決方案。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

GCMS-QP2010 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本島津公司）；ACQUITY UPLC I-Class 系統(tǒng)（美國(guó)Waters 公司）；TripleTOFTM5600 高分辨四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（美國(guó)AB Sciex 公司），配備電噴霧離子源（electro?spray ionization，ESI）；AVANCE Ⅲ400 MHz 核磁共振波譜儀（德國(guó)Bruker 公司）；1200 制備液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；RV 10 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)IKA 公司）；KQ-600DE 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

甲醇、乙腈、甲酸（色譜純，德國(guó)Merck 公司），氘化三氯甲烷（CDCl3，99.8%；美國(guó)劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室），Milli-Q Advantage A10 超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 儀器條件

1.2.1 制備液相分析條件

使用ZORBAX SB-C18色譜柱（250 mm×21.2 mm，7 μm；美國(guó)Agilent 公司），柱溫為室溫，流動(dòng)相采用V水∶V甲醇=15∶85的甲醇水溶液，分析時(shí)間為7 min，流速為20 mL/min，進(jìn)樣體積為200 μL，采樣波長(zhǎng)為210 nm。根據(jù)出峰時(shí)間，收集4.8～5.5 min時(shí)間段的洗脫液。

1.2.2 GC-MS分析條件

使用DB-5MS 石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm；美國(guó)Agilent 公司）。升溫程序：140 ℃保持3 min，以20 ℃/min 升至320 ℃，保持13 min。載氣為氦氣，流速為1 mL/min，分流比為40∶1，溶劑延遲3 min，進(jìn)樣口溫度280 ℃，電子轟擊（electron impact，EI）離子源，電子能量為70 eV，離子源溫度為230 ℃，傳輸線溫度為250 ℃，質(zhì)量掃描范圍為m/z35～500。

1.2.3 UPLC-QTOF-MS分析條件

使用Kinetex Biphenyl 色譜柱（100 mm×3.0 mm，2.6 μm；美國(guó)Phenomenex 公司），柱溫40 ℃，流動(dòng)相A為V甲酸∶V水=1∶1 000 的甲酸水溶液，流動(dòng)相B 為乙腈。梯度洗脫程序：初始為0% B；0～12.0 min，0%～100%B；12.0～13.0 min，100% B；13.0～13.1 min，100%～0%B；13.1～15.0 min，0% B。流速為0.8 mL/min；進(jìn)樣量為1 μL；電噴霧離子化-碰撞誘導(dǎo)解離（electrospray ionization-collision induced dissociation，ESI-CID），正離子全掃描及二級(jí)質(zhì)譜掃描；電離噴霧電壓5.5 kV，去簇電壓80 V；噴霧溫度為600 ℃；霧化氣（N2）50 psi，脫溶劑氣（N2）30 psi，氣簾氣（N2）30 psi；一級(jí)質(zhì)譜碰撞能量為10 V，質(zhì)量掃描范圍為m/z100～1 000；二級(jí)質(zhì)譜碰撞能量為（35±15）V，質(zhì)量掃描范圍為m/z50～1 000。

1.2.4 NMR分析條件

利用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)?zāi)０?，分別采集樣品的一維和二維NMR譜圖，分別為1H-NMR、13C-NMR、13C-無畸變極化轉(zhuǎn)移增強(qiáng)（13C-distortionless enhancement by polariza?tion transfer，13C-DEPT）、二維核磁共振譜（two-dimen?sional nuclear magnetic resonance spectrum，2D NMR）、氫/氫相關(guān)譜（1H/1H-correlation spectroscopy，1H/1HCOSY）、碳/氫異核單量子相關(guān)譜（1H/13C-heteronuclear single quantum correlation spectroscopy，1H/13C-HSQC）和異核多鍵碳?xì)湎嚓P(guān)譜（1H/13C heteronuclear multi?ple bond correlation spectroscopy，1H/13C-HMBC）。1HNMR、13C-NMR 譜的化學(xué)位移參考四甲基硅烷（tetra?methylsilane，TMS）。

1.3 樣品處理

稱取50 mg 棕黃色植物狀樣品（圖1），加入1 mL甲醇，超聲5 min，以5 000×g離心5 min，取上清液供GC-MS分析。

圖1 草本混合物樣品照片F(xiàn)ig.1 Photo of the herbal blend sample

稱取棕黃色植物狀樣品約2 g，加入10 mL 甲醇，超聲10 min，以5 000×g離心5 min，取上清液。再重復(fù)3 次，將4 次的上清液合并，旋蒸至剩余約2 mL，得到1 g/mL 的植物提取濃縮液，過0.45 μm 濾膜，供制備液相分析。采用制備液相對(duì)1 g/mL 的植物提取濃縮液進(jìn)行分離，收集目標(biāo)組分的洗脫液。累計(jì)進(jìn)樣，合并洗脫液，將其轉(zhuǎn)移至玻璃茄形瓶中，80 ℃水浴旋蒸至干，再進(jìn)一步真空干燥箱中干燥48 h，得到制備樣品。

稱取制備樣品約1 mg，溶于1 mL 甲醇，供GC-MS分析。將配制的1 mg/mL 制備樣品甲醇溶液，用0.1%甲酸水溶液稀釋，配制成1 μg/mL 溶液，供UPLCQTOF-MS分析。

稱取制備樣品約5 mg，溶解于1 mL 氘化三氯甲烷中，供NMR分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 GC-MS檢測(cè)

采用GC-MS 分析植物樣品提取液，樣品總離子流色譜圖（圖2）中保留時(shí)間為12.77 min 的峰為主峰，其EI 質(zhì)譜圖（圖3）中存在氟戊基吲哚酰胺類合成大麻素的典型特征離子m/z232 和144，但與NIST 譜庫(kù)及實(shí)驗(yàn)室自建NPS 譜庫(kù)檢索比對(duì)無匹配結(jié)果。進(jìn)一步結(jié)合《新精神活性物質(zhì)分析手冊(cè)：質(zhì)譜分冊(cè)》[4]中吲哚酰胺類合成大麻素的質(zhì)譜特征推測(cè)，該物質(zhì)可能為2-[1-（5-氟戊基）-1H-吲哚-3-甲酰氨基]-3，3-二甲基丁酸甲酯（5F-MDMB-PICA）的乙酯衍生物2-[1-（5-氟戊基）-1H-吲哚-3-甲酰氨基]-3，3-二甲基丁酸乙酯（5F-EDMB-PICA，圖4），其可能的EI 裂解途徑見圖5。EI 質(zhì)譜圖中的基峰m/z232 可能是由化合物酰胺基的C-N 鍵斷裂形成，碎片離子m/z232 的C-N 鍵進(jìn)一步斷裂形成碎片離子m/z144，碎片離子m/z144 進(jìn)一步丟失CO 生成了吲哚環(huán)m/z116；碎片離子m/z334 可能是由于分子離子丟失C4H8+形成，碎片離子m/z334丟失乙氧基形成碎片離子m/z288，碎片離子m/z288進(jìn)一步丟失CO生成碎片離子m/z260。

圖2 樣品的總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatograms of the sample

圖3 樣品總離子流色譜圖中12.77 min組分的EⅠ質(zhì)譜圖Fig.3 EⅠmass spectra of the 12.77 min component in total ion chromatogram of the sample

圖4 5F-EDMB-PⅠCA、5F-MDMB-PⅠCA的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.4 Chemical structures of 5F-EDMB-PⅠCA and 5F-MDMB-PⅠCA

圖5 5F-EDMB-PⅠCA在EⅠ模式下可能的裂解途徑Fig.5 Proposed fragmentation pathways of 5F-EDMB-PⅠCA in EⅠmode

2.2 未知化合物的制備

NMR 波譜法是確證物質(zhì)結(jié)構(gòu)的金標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)室曾鑒定大量未知固體繳獲物，最終結(jié)構(gòu)的確證均是通過化合物一維和二維NMR 譜圖的解析完成[11-12]。但是對(duì)于含量較低的植物制品，NMR 譜圖干擾嚴(yán)重，難以直接進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，因此，先使用制備液相法對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行純化。在進(jìn)行未知合成大麻素純化制備前，先對(duì)制備液相法的流動(dòng)相組成和進(jìn)樣體積這兩個(gè)條件進(jìn)行優(yōu)化。

收集洗脫液，進(jìn)GC-MS 分析，從而確定其中所包含的成分。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)采用V水∶V甲醇=10∶90、V水∶V甲醇=15∶85、V水∶V甲醇=20∶80 3 種流動(dòng)相進(jìn)行分離時(shí)，目標(biāo)合成大麻素的出峰時(shí)間分別為3.65、5.08和7.43 min（圖6）。綜合考慮分離度和分析時(shí)間，最終選取的流動(dòng)相為V水∶V甲醇=15∶85。

圖6 不同流動(dòng)相條件下獲得的色譜圖Fig.6 Chromatograms acquired using different mobile phases

質(zhì)量濃度為1 g/mL 的植物提取液在進(jìn)樣體積為50、100、200 μL 時(shí)的液相色譜圖見圖7。結(jié)果表明，選用3 種進(jìn)樣體積均可以實(shí)現(xiàn)有效分離，為節(jié)省分析時(shí)間，最終選取的進(jìn)樣體積為200 μL。

圖7 不同進(jìn)樣體積條件下獲得的色譜圖Fig.7 Chromatogram acquired using different injection volumes

在最優(yōu)化的條件下，采用制備液相對(duì)1 g/mL的植物提取濃縮液進(jìn)行分離，收集5.08 min 的洗脫液。累計(jì)進(jìn)樣10次，合并得到約200 mL洗脫液，將其轉(zhuǎn)移至玻璃茄形瓶中，80 ℃水浴旋蒸至干，再進(jìn)一步真空干燥箱中干燥48 h，得到淺黃色油狀物約10 mg。

2.3 未知化合物的結(jié)構(gòu)解析

采用GC-MS 分析制備樣品，樣品的總離子流色譜圖見圖2B。制備樣品的EI 質(zhì)譜圖（圖3B）與植物樣品提取液的EI質(zhì)譜圖（圖3A）高度一致。

采用UPLC-QTOF-MS 分析制備樣品，化合物的出峰時(shí)間為10.07 min。在ESI 正離子模式下，化合物的一級(jí)質(zhì)譜圖（圖8A）中顯示其準(zhǔn)分子離子[M+H]+為m/z391.239 1，預(yù)測(cè)分子式為C22H31FN2O3，與5FEDMB-PICA 的分子式吻合。ESI-CID 模式下的二級(jí)質(zhì)譜圖（圖8B）中有兩個(gè)碎片離子，m/z232.113 2（C14H15FNO+）和m/z144.044 3（C9H6NO+），這兩個(gè)碎片離子是氟戊基吲哚酰胺類合成大麻素的典型特征離子[4]，其中232.113 2 是由酰胺基的C-N 鍵斷裂形成，該碎片離子的C-N 鍵進(jìn)一步斷裂形成碎片離子144.044 3。

圖8 UPLC-QTOF-MS分析5F-EDMB-PⅠCA的質(zhì)譜圖及可能的質(zhì)譜裂解途徑Fig.8 Mass spectra obtained by UPLC-QTOF-MS for 5F-EDMB-PⅠCA and proposed fragmentation pathways

采用NMR 分析制備樣品，其1H-NMR、13C-NMR譜圖見圖9。根據(jù)制備樣品的EI 質(zhì)譜圖和ESI 質(zhì)譜圖，大致推斷未知物是5F-MDMB-PICA 的乙酯衍生物5F-EDMB-PICA。5F-EDMB-PICA 與5F-MDMBPICA 的結(jié)構(gòu)差異僅為1 個(gè)CH2，將兩者碳譜中譜峰的化學(xué)位移進(jìn)行比較（表1），結(jié)果顯示，兩者C-2 至C-23 之間所有碳的化學(xué)位移幾乎一致，證實(shí)了兩個(gè)化合物具有相同的2-[1-（5-氟戊基）-1H-吲哚-3-甲酰氨基]-3，3-二甲基丁酸結(jié)構(gòu)。5F-EDMB-PICA 的H-26（δ=4.23）氫的個(gè)數(shù)為2，H-27（δ=1.32）氫的個(gè)數(shù)為3；H-26（δ=4.23）與C-23（δ=172.3）、C-27（δ=14.4）存在1H/13C-HMBC 耦合，H-27（δ=1.32）與C-26（δ=61.2）存在1H/13C-HMBC耦合，證實(shí)了5F-EDMB-PICA中的丁酸乙酯結(jié)構(gòu)。

圖9 5F-EDMB-PICA 的1H-NMR和13C-NMR譜圖Fig.9 1H-NMR and13C-NMR spectra of 5F-EDMB-PⅠCA

綜合GC-MS、UPLC-QTOF-MS 和NMR 的檢驗(yàn)結(jié)果，確定未知物合成大麻素為5F-EDMB-PICA。5FEDMB-PICA 的1H-NMR、13C-NMR 譜中各譜峰的詳細(xì)歸屬見表1。5F-EDMB-PICA 是已知化合物5FMDMB-PICA 的乙酯衍生物，兩個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)僅差一個(gè)甲基，同屬于氟戊基吲哚酰胺-丁酸酯結(jié)構(gòu)的合成大麻素。5F-MDMB-PICA 是2019—2020年本實(shí)驗(yàn)室檢出頻率最高的合成大麻素類物質(zhì)，于2021年7月1 日起被列入《非藥用類麻醉藥品和精神藥品管制品種增補(bǔ)目錄》。

表1 5F-EDMB-PⅠCA的1H-NMR、13C-NMR數(shù)據(jù)Tab.1 1H-NMR and13C-NMR data of 5F-EDMB-PICA

續(xù)表1Continued Tab.1

3 結(jié)論

本研究以一份送檢合成大麻素植物制品檢材為例，詳細(xì)介紹了無標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)植物制品中未知合成大麻素的定性分析策略。采用制備液相法從植物制品提取液中分離、純化合成大麻素，并綜合利用GC-MS、UPLC-QTOF-MS、NMR 實(shí)現(xiàn)對(duì)未知合成大麻素結(jié)構(gòu)的解析，同時(shí)還對(duì)5F-EDMB-PICA 在EI 和ESI-CID兩種模式下生成的碎片離子進(jìn)行了裂解途徑的推導(dǎo)，對(duì)5F-EDMB-PICA 的1H-NMR、13C-NMR 譜的譜峰進(jìn)行了解析和歸屬，這些信息將有助于法庭科學(xué)實(shí)驗(yàn)室在案件中鑒定該物質(zhì)或其他具有類似結(jié)構(gòu)的化合物。對(duì)于已知的合成大麻素，傳統(tǒng)的質(zhì)譜定性方法通常是使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，將目標(biāo)化合物的色譜保留時(shí)間和質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行比較，以確定化合物的結(jié)構(gòu)。然而，在NPS 新化合物數(shù)量快速增長(zhǎng)的情況下，很難及時(shí)獲取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，且新化合物的質(zhì)譜圖也很難被添加到通用的商業(yè)化質(zhì)譜庫(kù)中。如果沒有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，則需要綜合利用質(zhì)譜、核磁等進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)的解析，而NMR 波譜的分析需要一定量的純化合物。采用化學(xué)合成法合成化合物成本高、周期長(zhǎng)，制備液相法簡(jiǎn)單、快速、高效，為解決NPS 制品中低含量未知化合物的定性分析難題提供了備選方案。