鄭甌翔，夏雷

溫州市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所，浙江 溫州 325000

1 案 例

1.1 簡(jiǎn)要案情

本實(shí)驗(yàn)室在人員建庫(kù)工作中，通過(guò)對(duì)32 000余份無(wú)關(guān)個(gè)體樣本進(jìn)行常染色體檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)2 例D12S391基因座具有四等位基因現(xiàn)象，發(fā)生率約為0.006 25%。為驗(yàn)證該樣本檢驗(yàn)的準(zhǔn)確性及探究四等位基因形成的原因，本實(shí)驗(yàn)室對(duì)其進(jìn)行了復(fù)核檢驗(yàn)。

1.2 檢測(cè)方法

采用直接擴(kuò)增法進(jìn)行DNA擴(kuò)增。

分別采用華夏TM白金PCR 擴(kuò)增試劑盒（美國(guó)Applied Biosystems 公司），人類(lèi)STRtyper-21G 擴(kuò)增熒光檢測(cè)試劑盒、SureID? PanGlobal 人類(lèi)DNA 身份鑒定試劑盒（寧波海爾施公司），在9700型PCR 儀（美國(guó)Applied Biosystems 公司）上按各試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行STR復(fù)合擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為10μL，擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)用3500xL基因分析儀（美國(guó)Applied Biosystems 公司）進(jìn)行檢測(cè)，并使用GeneMapperTMID-X軟件（美國(guó)Applied Bio?systems公司）進(jìn)行分型。

1.3 檢測(cè)結(jié)果

首次采用華夏TM白金PCR 擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示，除D12S391基因座表現(xiàn)為四等位基因外，其余基因座均表現(xiàn)為正常分型。1號(hào)樣本D12S391基因座基因型依次為19，21，22，23，峰高比約為1∶1∶1∶1（圖1）；2 號(hào)樣本D12S391基因座基因型依次為16，21，22，23，峰高比約為1∶1∶1∶1（圖2）。

圖1 1號(hào)樣本采用華夏TM白金PCR擴(kuò)增試劑盒的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The amplification results of sample 1 with HuaxiaTM Platinum PCR Amplification Kit

圖2 2號(hào)樣本采用華夏TM白金PCR擴(kuò)增試劑盒的擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 The amplification results of sample 2 with HuaxiaTM Platinum PCR Amplification Kit

隨后分別采用人類(lèi)STRtyper-21G 擴(kuò)增熒光檢測(cè)試劑盒、SureID? PanGlobal 人類(lèi)DNA 身份鑒定試劑盒進(jìn)行復(fù)核，結(jié)果一致。

2 討論

目前，國(guó)內(nèi)外法庭科學(xué)中個(gè)體識(shí)別、親子鑒定主要采用STR 分型方法。正常人常染色體單個(gè)STR 基因座只有2 個(gè)等位基因，純合子個(gè)體圖譜表現(xiàn)為只有1 個(gè)峰或1 條帶，而雜合子個(gè)體圖譜表現(xiàn)為2 個(gè)峰或2 條帶，也有報(bào)道[1-3]稱(chēng)個(gè)別基因座檢出3 個(gè)峰或3 條帶。四等位基因是指?jìng)€(gè)體圖譜單個(gè)STR 基因座表現(xiàn)為4個(gè)峰或4條帶，并且通過(guò)不同試劑盒驗(yàn)證，可以得到確認(rèn)，情況極為罕見(jiàn)。本文涉及的2 個(gè)樣本在分別采用華夏TM白金PCR擴(kuò)增試劑盒、人類(lèi)STRtyper-21G擴(kuò)增熒光檢測(cè)試劑盒、SureID? PanGlobal 人類(lèi)DNA身份鑒定試劑盒復(fù)合擴(kuò)增后，在D12S391基因座檢出相同的基因型，且除D12S391基因座表現(xiàn)為四等位基因外，其余基因座均表現(xiàn)為正常分型，可以排除樣本污染、實(shí)驗(yàn)室污染、PCR 擴(kuò)增異常、熒光燃料污染、Pull-up 峰、某基因座過(guò)大或過(guò)小的off-ladder（OL）等位基因落在了相鄰基因座范圍內(nèi)[4-5]以及試劑盒引物設(shè)計(jì)等因素。在確定樣本為單一來(lái)源的情況下，某個(gè)STR 基因座檢出多等位基因，這種拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV）現(xiàn)象產(chǎn)生的原因是由于樣本中存在多余的染色體片段，采用PCR 引物擴(kuò)增時(shí)產(chǎn)生了額外的PCR 擴(kuò)增片段[6]。多等位基因的形成機(jī)制尚不明確，可能是由于遺傳因素，如染色體在減數(shù)分裂時(shí)出現(xiàn)不等價(jià)交換，或有絲分裂時(shí)異常分離導(dǎo)致三體綜合征、體細(xì)胞突變，或受精卵發(fā)育階段，染色體不分離產(chǎn)生嵌合體等，也可能是骨髓移植后形成了嵌合體。而根據(jù)遺傳學(xué)發(fā)育特征及D12S391基因座所在的染色體的特點(diǎn)，推測(cè)本文2 例樣本出現(xiàn)四等位基因的原因可能是局部基因重復(fù)，具體需要進(jìn)一步開(kāi)展基因座測(cè)序才可明確。關(guān)于峰高，本文2例在D12S391基因座中形成的4 個(gè)峰的峰高比均為1∶1∶1∶1，推測(cè)應(yīng)該是該基因座的引物區(qū)存在相鄰的結(jié)合位點(diǎn)，且實(shí)現(xiàn)了均衡擴(kuò)增。

在個(gè)體識(shí)別或親子鑒定中，四等位基因可能導(dǎo)致錯(cuò)誤判斷，因此，出現(xiàn)基因座分型異常時(shí)應(yīng)引起重視，使用多種試劑盒、多個(gè)基因座分型進(jìn)行復(fù)核確認(rèn)，排除各種因素的干擾和影響，降低錯(cuò)誤分析的風(fēng)險(xiǎn)，確保鑒定意見(jiàn)的準(zhǔn)確性，同時(shí)，可以考慮將四等位基因座作為特征基因座在個(gè)體識(shí)別中加以應(yīng)用。