楚 妙 熊朝暉 趙麗娜 李康寧 巨朝娟

臨床上視神經(jīng)損傷又稱外傷性視神經(jīng)病變，是顱腦損傷常見的并發(fā)癥，占顱腦外傷的2%～5%[1]。視神經(jīng)損傷分為直接損傷和間接損傷[2]，直接損傷是指銳器刺傷視神經(jīng)引起的損傷，但在臨床上比較少見。目前約90%視神經(jīng)損傷為間接損傷，如打擊傷、墜落傷、車禍傷等，損傷特點(diǎn)是沒有出現(xiàn)眼球或者視神經(jīng)損傷，但會伴有嚴(yán)重的視力降低。視神經(jīng)損傷的病理基礎(chǔ)是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGCs)進(jìn)行性死亡和神經(jīng)纖維的丟失[3]。損傷后RGCs生長程序再激活能力較弱，RGCs中促進(jìn)軸突再生的相關(guān)基因及營養(yǎng)因子的表達(dá)不足[4]。雖然許多轉(zhuǎn)錄因子、信號通路與視神經(jīng)損傷后RGCs生長程序再激活和軸突再生有關(guān)，但是關(guān)于它們的作用機(jī)制目前尚不完全清楚。磷酸酶-張力蛋白同源物(PTEN)和細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制蛋白3(SOCS3)是重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控因子，除了具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和存活能力外，還具有調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、基因組穩(wěn)定性等作用[5]。本研究通過建立視神經(jīng)損傷模型，探討PTEN/SOCS3缺失對改善視神經(jīng)損傷大鼠RGCs存活的作用機(jī)制，為深入闡述視神經(jīng)損傷的發(fā)病機(jī)制和治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物PTENflox/flox大鼠、SOCS3flox/flox大鼠、神經(jīng)元特異性表達(dá)黃色熒光轉(zhuǎn)基因(Thy-1 YFP)大鼠均從美國Jackson 實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)。Thy1-YFP/PTENF/F、Thy1-YFP/SOCS3F/F和Thy1-YFP/PTENF/FSOCS3F/F大鼠各20只分別由Thy-1 YFP與PTENflox/flox大鼠、SOCS3flox/flox大鼠交配獲得，需要基因鑒定后才能使用。所有大鼠飼養(yǎng)環(huán)境溫度保持在21 ℃，光照和黑暗交替各12 h，所有大鼠自由飲食。

1.2 方法

1.2.1 敲減大鼠PTEN和SOCS3基因大鼠玻璃體內(nèi)注射腺相關(guān)病毒(AAV)介導(dǎo)PTEN或SOCS3基因缺失，大鼠通過腹腔注射氯胺酮麻醉，使用微量移液管向大鼠一眼玻璃體內(nèi)注射的AAV 1 μL，注射后涂抗生素軟膏，注射AAV后24～48 h對動物進(jìn)行密切監(jiān)測，了解動物的正常反應(yīng)以及飲水、進(jìn)食行為。

1.2.2 動物分組Thy1-YFP/PTENF/FSOCS3F/F大鼠為對照組；玻璃體內(nèi)注射AAV介導(dǎo)PTEN基因缺失的Thy1-YFP/PTENF/F大鼠為PTEN-/-組；玻璃體內(nèi)注射AAV介導(dǎo)SOCS3基因缺失的Thy1-YFP/SOCS3F/F大鼠為SOCS3-/-組；玻璃體內(nèi)注射AAV介導(dǎo)PTEN和SOCS3基因缺失的Thy1-YFP/PTENF/FSOCS3F/F大鼠為PTEN-/-SOCS3-/-組；每組各20只大鼠。

1.2.3 大鼠視神經(jīng)夾傷模型制備大鼠視神經(jīng)夾傷模型制備參照文獻(xiàn)[6]，用10 g·L-1戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，置于40倍視野的顯微鏡下手術(shù)，剪開左眼眶皮膚，分離眶內(nèi)脂肪，碰觸眶內(nèi)靜脈竇，向著眼球的方向分離，暴露視神經(jīng)，同時要控制小血管出血；采用5號鐘表鑷劃開視神經(jīng)鞘膜背側(cè)，距離神經(jīng)根部1 mm夾閉5 s，術(shù)后涂抗生素軟膏。

1.2.4 各組大鼠視網(wǎng)膜HE染色各組大鼠造模后48 h腹腔注射水合氯醛麻醉處死，顯微鏡下取出大鼠部分視網(wǎng)膜組織固定于40 g·L-1多聚甲醛中，PBS溶液清洗；積分?jǐn)?shù)70%乙醇蒸餾1 h，用體積分?jǐn)?shù)60%～90%乙醇梯度脫水；體積分?jǐn)?shù)2.5%、 3.0%二甲苯溶液梯度脫水，靜置30 min；將石蠟組織包埋，切成3 μm的厚度，二甲苯中脫蠟；乙醇脫水，蘇木精染色液染色30 min，PBS清洗,伊紅溶液染色,組織切片進(jìn)行透明清洗操作,中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡觀察記錄和拍照。

1.2.5 各組大鼠RGCs分離參照文獻(xiàn)[7]分離大鼠RGCs，各組大鼠造模后48 h腹腔注射水合氯醛麻醉處死，取出大鼠部分視網(wǎng)膜，溶解于0.2 g·L-1左旋/右旋半胱氨酸、15 U·mL-1木瓜蛋白酶和0.04 g·L-1脫氧核糖混合液中，離心處理，加入兔抗巨噬細(xì)胞抗體(175)和IgG 抗體(1400)孵育30 min，然后將貼壁的RGCs采用胰蛋白酶消化、離心后，將RGCs接種于已包被多聚賴氨酸和層粘連蛋白的96孔板中，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d換液 1次，流式細(xì)胞術(shù)檢測活化星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和RGCs，并計(jì)算RGCs純度。

1.2.6 免疫熒光染色鑒定各組大鼠RGCs存活情況將各組大鼠RGCs用40 g·L-1多聚甲醛固定20 min，室溫下將細(xì)胞用體積分?jǐn)?shù)0.3%Triton X-100透化，添加免疫熒光封閉液室溫孵育 60 min，加入一抗8-羥基脫氧鳥苷(1500)，4 ℃孵育過夜,PBS 清洗；將細(xì)胞與Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)二抗(1500)孵育1 h，DAPI染色10 min，PBS漂洗；利用Image-Proplus軟件對熒光圖像進(jìn)行分析，計(jì)算RGCs存活率。

1.2.7 流式細(xì)胞儀檢測各組大鼠RGCs凋亡情況采用胰蛋白酶消化各組RGCs，調(diào)整細(xì)胞密度為300×103個·mL-1，采用400 μL Annexin V結(jié)合液懸浮細(xì)胞，添加5 μL Annexin V-FITC著色液并混勻，靜置15 min，加入10 μL PI著色液，上流式細(xì)胞儀檢測，并計(jì)算RGCs凋亡率。

1.2.8 各組大鼠視神經(jīng)損傷后軸突再生數(shù)量觀察各組大鼠造模后30 d腹腔注射麻醉，左眼注射1 μL霍亂毒素B型亞單位進(jìn)行順行示蹤標(biāo)記，48 h后給予麻醉并灌注40 g·L-1多聚甲醛，摘取視神經(jīng)樣品，40 g·L-1多聚甲醛固定4 h，分別在50 g·L-1、150 g·L-1和300 g·L-1蔗糖溶液中進(jìn)行梯度脫水，然后用包埋劑進(jìn)行包埋，冰凍切成約8 μm厚的切片，選擇5個視神經(jīng)切片，距離視神經(jīng)擠壓部位不同距離處估算逆行示蹤劑霍亂毒素B型亞單位標(biāo)記軸突的數(shù)量。

1.2.9 Western blot檢測各組大鼠RGCs中GFAP和GAP-43蛋白的表達(dá)采用RIPA細(xì)胞裂解液提取各組大鼠RGCs的總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜，將膜浸入50 g·L-1脫脂奶粉的封閉液中，封閉2 h。分別加入GFAP (以1500稀釋)和GAP-43 (以11000稀釋)一抗，置于4 ℃的恒溫環(huán)境，過夜處理；添加HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG (以15000稀釋)，置于28 ℃孵育1 h，將PVDF膜放入電化學(xué)發(fā)光顯色液內(nèi)顯色處理，使用Image-Pro Plus 6.0分析蛋白質(zhì)灰度值。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠視網(wǎng)膜組織病理學(xué)觀察HE染色分析結(jié)果顯示，對照組大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞炎癥反應(yīng)明顯，細(xì)胞之間層次結(jié)構(gòu)混亂、連接差、分散性強(qiáng)；PTEN-/-組和SOCS3-/-組大鼠視網(wǎng)膜整體結(jié)構(gòu)較規(guī)則，層次較清晰，炎癥反應(yīng)有所減輕；PTEN-/-SOCS3-/-組大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)清晰，較規(guī)則，細(xì)胞之間連接緊密，炎癥反應(yīng)明顯減輕(圖1)。

圖1 各組大鼠視網(wǎng)膜組織HE染色結(jié)果(×200)

2.2 各組大鼠RGCs存活情況分析對照組、PTEN-/-組、SOCS3-/-組和PTEN-/-SOCS3-/-組大鼠RGCs存活率分別為(47.29±5.16)%、(76.54±11.95)%、(73.27±12.53)%和(99.64±1.07)%，PTEN-/-組和SOCS3-/-組大鼠RGCs存活率均顯著高于對照組(均為P<0.001)，PTEN-/-SOCS3-/-組大鼠RGCs存活率均明顯高于PTEN-/-組和SOCS3-/-組(均為P<0.001)(圖2)。

圖2 各組大鼠RGCs存活情況

2.3 各組大鼠RGCs凋亡情況分析對照組、PTEN-/-組、SOCS3-/-組和PTEN-/-SOCS3-/-組大鼠RGCs凋亡率分別為17.96%、6.85%、12.37%和4.81%，PTEN-/-組和SOCS3-/-組大鼠RGCs凋亡率均顯著低于對照組(均為P<0.001)，PTEN-/-SOCS3-/-組大鼠RGCs凋亡率均明顯低于PTEN-/-組和SOCS3-/-組(均為P<0.001)(圖3)。

圖3 各組大鼠RGCs凋亡情況

2.4 各組大鼠視神經(jīng)損傷后軸突再生情況對照組大鼠視神經(jīng)軸突數(shù)目為(36.27±11.58) 個,PTEN-/-組大鼠視神經(jīng)軸突數(shù)目為(553.15±89.32)個,SOCS3-/-組大鼠視神經(jīng)軸突數(shù)目為(126.48±37.53)個，PTEN-/-SOCS3-/-組大鼠視神經(jīng)軸突數(shù)目為(954.03±87.59)個，PTEN-/-組和SOCS3-/-組大鼠視神經(jīng)軸突數(shù)目均顯著多于對照組(均為P<0.001)，PTEN-/-SOCS3-/-組大鼠視神經(jīng)軸突數(shù)目均明顯多于PTEN-/-組和SOCS3-/-組(均為P<0.001)(圖4)。

圖4 各組大鼠視神經(jīng)損傷30 d后軸突再生情況 注:紅色箭頭所指為視神經(jīng)軸突。

2.5 各組大鼠RGCs中GFAP和GAP-43蛋白的表達(dá)PTEN-/-組和SOCS3-/-組大鼠RGCs中GFAP和GAP-43蛋白表達(dá)均顯著低于對照組(均為P<0.001)，PTEN-/-SOCS3-/-組大鼠RGCs中GFAP和GAP-43蛋白表達(dá)均明顯低于PTEN-/-組和SOCS3-/-組(均為P<0.001)(圖5)。

圖5 各組大鼠RGCs中GFAP和GAP-43蛋白表達(dá)

3 討論

視神經(jīng)損傷后發(fā)生視覺功能減退不可逆的重要因素是RGCs在視神經(jīng)損傷后繼發(fā)性的變性。有研究顯示，RGCs在視覺損傷后再生能力有限，所以抑制RGCs繼發(fā)性的變性、阻滯其凋亡，對視神經(jīng)損傷具有重要的意義[8]。另外，視神經(jīng)再生與RGCs內(nèi)軸突結(jié)構(gòu)的再生在一定程度上關(guān)系密切，視網(wǎng)膜主要由RGCs層、內(nèi)核層和外核層組成[9]。其中RGCs軸突投射至視神經(jīng)，視神經(jīng)元損傷后可能會分泌炎癥因子，或者干擾營養(yǎng)因子的供應(yīng)，導(dǎo)致RGCs啟動凋亡的過程[10]。視神經(jīng)的結(jié)構(gòu)、發(fā)育特征以及相關(guān)功能與中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有一定的相似性，傳統(tǒng)生物學(xué)研究認(rèn)為，動物的中樞神經(jīng)組織受損一般是不可再生的[11]，所以說，視神經(jīng)損傷后視覺功能是不可逆的。因此，研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生能力的內(nèi)在機(jī)制是非常重要的。

PTEN是具有蛋白磷酸酶和脂質(zhì)磷酸酶雙重磷酸酶活性的基因，該基因除了具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和存活能力外，還具有調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、基因組穩(wěn)定性和細(xì)胞周期等的作用[12]。SOCS-3 是JAK/STAT細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的負(fù)性調(diào)控分子家族,能夠負(fù)向調(diào)控細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄，避免過度的炎癥反應(yīng)造成的組織損傷，在細(xì)胞免疫中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[13]。目前PTEN和SOCS-3在RGCs存活和軸突再生中作用尚未完全清楚。在本研究中，我們雜交了PTENflox/flox、SOCS3flox/flox和Thy-1YFP大鼠轉(zhuǎn)基因得到Thy1-YFP/PTENF/F、Thy1-YFP/SOCS3F/F和Thy1-YFP/PTENF/FSOCS3F/F大鼠，然后進(jìn)行視神經(jīng)損傷建模處理，研究PTEN、SOCS3基因缺失或者共同缺失對大鼠RGCs存活和軸突再生的影響。

本研究首先通過HE染色對各組大鼠視網(wǎng)膜組織的病理學(xué)進(jìn)行對比分析發(fā)現(xiàn)，未做PTEN和SOCS3基因敲減的大鼠視網(wǎng)膜出現(xiàn)大量的炎癥反應(yīng)，細(xì)胞之間的結(jié)構(gòu)混亂、連接差、分散性強(qiáng)，而分別敲減PTEN和SOCS3的大鼠視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng)有所減輕，整體結(jié)構(gòu)較規(guī)則，層次較清晰；PTEN和SOCS3共同敲減的大鼠視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng)明顯減輕，視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)清晰有規(guī)則，細(xì)胞之間連接緊密，從而說明了PTEN和SOCS3缺失對大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)的變化有一定影響。為了證明PTEN和SOCS3缺失在RGCs中存活和凋亡的作用，本研究利用免疫熒光染色和流式細(xì)胞儀檢測驗(yàn)證了RGCs存活和凋亡狀況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分別敲減PTEN和SOCS3大鼠RGCs存活率均顯著高于未做PTEN和SOCS3基因敲減的大鼠，同時敲減PTEN和SOCS3大鼠RGCs存活率均明顯高于分別敲減PTEN和SOCS3大鼠；分別敲減PTEN和SOCS3大鼠RGCs凋亡率均顯著低于未做PTEN和SOCS3基因敲減的大鼠，同時敲減PTEN和SOCS3大鼠RGCs凋亡率均明顯低于分別敲減PTEN和SOCS3大鼠。為了進(jìn)一步驗(yàn)證PTEN和SOCS3缺失在大鼠視神經(jīng)損傷后軸突再生中的作用，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分別敲減PTEN和SOCS3大鼠視神經(jīng)軸突數(shù)目均顯著高于未做PTEN和SOCS3基因敲減的大鼠，同時敲減PTEN和SOCS3大鼠中視神經(jīng)軸突數(shù)目均明顯高于分別敲減PTEN和SOCS3大鼠。結(jié)果提示，同時敲減PTEN和SOCS3基因不僅可以促進(jìn)大鼠RGCs活性，抑制其凋亡，還可以促進(jìn)大鼠視神經(jīng)損傷后軸突的再生功能。研究報道，特異性敲減小鼠體內(nèi)的PTEN，提高了mTOR通路的活性，在皮質(zhì)脊髓束損傷模型和成年小鼠視神經(jīng)損傷中都觀察到了大量的軸突再生[14]。也有研究報道，SOCS3在大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)元內(nèi)過表達(dá)，會損耗損傷神經(jīng)元的再生和存活能力[15]。另有研究表明，視神經(jīng)損傷后4周，同時敲減PTEN和SOCS3基因，與單獨(dú)PTEN或SOCS3基因敲減相比，軸突再生的能力更強(qiáng)[16]。

GFAP是神經(jīng)組織特異性磷酸蛋白，是神經(jīng)生長、神經(jīng)元發(fā)育、神經(jīng)再生、突觸形成和重建的標(biāo)志蛋白[17]。GAP-43 是神經(jīng)特異性的鈣調(diào)素連接蛋白，可促進(jìn)神經(jīng)纖維的再生和分化，調(diào)節(jié)突觸生長[18]。本研究通過Western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同時敲減PTEN和SOCS3基因大鼠RGCs中GFAP和GAP-43蛋白水平表達(dá)均明顯降低，這說明敲減PTEN和SOCS3基因能夠抑制GFAP和GAP-43的表達(dá)。

綜上所述，PTEN和SOCS3基因缺失與視神經(jīng)損傷大鼠RGCs存活和軸突再生具有一定的關(guān)系，不僅能夠促進(jìn)RGCs的增殖，抑制其凋亡，還能夠促進(jìn)視神經(jīng)軸突再生，同時敲減PTEN和SOCS3基因則作用最為顯著。