黎昌江 李秋慧 洪 娟 陳方安 郭翠玲

年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)是好發(fā)于50歲以上老年人并累及黃斑部的不可逆性視網(wǎng)膜退行性病變[1]，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜[2]。視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞死亡是AMD發(fā)病的主要原因[3]。為了維持光感受器的新陳代謝，RPE細(xì)胞比其他細(xì)胞需要更多的氧氣，當(dāng)暴露于過多的活性氧(ROS)環(huán)境中，RPE細(xì)胞會發(fā)生線粒體功能障礙，甚至凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致光感受器萎縮和視力喪失[4-5]。黃芪甲苷(AS-IV)是傳統(tǒng)中草藥黃芪的主要活性成分，具有抗氧化和抗凋亡作用[6]。PINK1/Parkin通路對調(diào)節(jié)細(xì)胞線粒體損傷至關(guān)重要，激活它可促進(jìn)細(xì)胞吞噬作用，保護(hù)細(xì)胞免于死亡和凋亡[7]。本研究通過建立RPE細(xì)胞藍(lán)光損傷模型，探討AS-IV對藍(lán)光誘導(dǎo)損傷的RPE細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制，以期為AMD的臨床診治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料ARPE-19細(xì)胞(美國典型菌種保藏中心)，DMEM/F12培養(yǎng)液、胎牛血清和胰蛋白酶(美國Gibco公司)，CCK-8檢測試劑(南京建成生物研究所)，Annexin V-FITC/PI 流式細(xì)胞檢測試劑盒(美國BD公司)，細(xì)胞線粒體分離試劑盒(上海碧云天生物試劑公司)，2’，7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽熒光探針和JC-1熒光探針(美國Invitrogen公司)，蛋白定量試劑盒(美國Pierce公司)，鼠抗人細(xì)胞色素C(Cyt C)多克隆抗體、鼠抗人Cyt C氧化酶IV亞型多克隆抗體、鼠抗人LC3B多克隆抗體、鼠抗人PINK1單克隆抗體、鼠抗人Parkin單克隆抗體(美國ABGENT公司)，免疫印跡二抗IgG(美國Abcam公司)。將純度>98%的AS-IV(美國GlpBio公司)溶于二甲基亞砜中(濃度為200 g·L-1)，臨用前以新鮮的DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋到所需濃度(二甲基亞砜的體積分?jǐn)?shù)不超過0.1%)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組將ARPE-19細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和10 g·L-1青鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)液中，放入37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以13的比例傳代，用4～6代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將傳代后的細(xì)胞分為5組?？瞻捉M：在暗環(huán)境中培養(yǎng)細(xì)胞，不給藍(lán)光照射；光照組：采用輻射強(qiáng)度為(4.0±0.5) mW·cm-2的藍(lán)光照射細(xì)胞4 h；光照+AS-IV組：采用相同輻射強(qiáng)度的藍(lán)光照射4 h+50 mg·L-1AS-IV培養(yǎng)細(xì)胞24 h；光照+AS-IV+siNC組：將細(xì)胞轉(zhuǎn)染對照siRNA后，采用相同輻射強(qiáng)度藍(lán)光照射4 h+50 mg·L-1AS-IV培養(yǎng)細(xì)胞24 h；光照+AS-IV+siPINK1組：將細(xì)胞轉(zhuǎn)染siPINK1后，采用相同輻射強(qiáng)度藍(lán)光照射4 h+50 mg·L-1AS-IV培養(yǎng)細(xì)胞24 h。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除ARPE-19細(xì)胞中PINK1基因，設(shè)計并構(gòu)建兩個sgRNA序列，利用Bbs1酶切技術(shù)將其構(gòu)建成psgRNA。將構(gòu)建的1 μg質(zhì)粒和1 μg pCas9-GFP利用LipofectamineTM3000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到ARPE-19細(xì)胞(1×106個·L-1)中，加入嘌呤霉素抗性基因共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并與嘌呤霉素(1.5 mg·L-1)共培養(yǎng)，篩選嘌呤霉素抗性細(xì)胞。從細(xì)胞中提取總蛋白，用免疫印跡法檢測質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3 選擇合適的藍(lán)光照射時間將ARPE-19細(xì)胞以20×106個·L-1密度每孔100 μL接種于96孔板中，分別培養(yǎng)1 h、2 h、4 h、6 h、8 h后加入CCK-8試劑，繼續(xù)孵育約3 h。在讀板前，將平板輕輕混入圓軌道振蕩器中振蕩1 min，用酶標(biāo)儀檢測450 nm的光密度(D)。細(xì)胞存活率(%)=D實(shí)驗(yàn)/D對照×100%。

1.2.4 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性接種ARPE-19細(xì)胞，按照空白組、光照組、光照+AS-IV組處理方式培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，加入CCK-8試劑，檢測各組細(xì)胞D450，計算細(xì)胞存活率。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況收集空白組、光照組、光照+AS-IV組ARPE-19細(xì)胞(包括貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞)，用結(jié)合緩沖液重懸，然后加入5 μL Annexin V-FITC避光輕振混勻，室溫孵育15 min后，上機(jī)前5 min加入5 μL 碘化丙啶染色，進(jìn)樣，用流式細(xì)胞儀在530 nm和575 nm波長處檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.2.6 JC-1熒光探針檢測細(xì)胞線粒體膜電位預(yù)先用超純水稀釋的JC-1(1200)與JC-1(15)緩沖液按照說明書進(jìn)行混合，制備300 nmol·L-1JC-1工作液。收集空白組、光照組、光照+AS-IV組ARPE-19細(xì)胞后，反復(fù)洗滌2次，重懸于0.5 mL DMEM培養(yǎng)液，加入等體積JC-1工作液，吹打混勻后置于培養(yǎng)箱中作用30 min。用磷酸鹽緩沖液洗滌2次后重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞線粒體膜電位。線粒體膜電位較低時，JC-1熒光探針呈綠色的單體。

1.2.7 DHE熒光探針法檢測細(xì)胞內(nèi)ROS含量收集空白組、光照組、光照+AS-IV組ARPE-19細(xì)胞，加入10 mmol·L-1DHE熒光探針，37 ℃避光孵育30 min，然后用DM500型熒光顯微鏡檢測細(xì)胞內(nèi)ROS含量。

1.2.8 細(xì)胞質(zhì)和線粒體組分的分離收集各組ARPE-19細(xì)胞，利用RIPA裂解液提取總蛋白，使用細(xì)胞線粒體分離試劑盒分離線粒體片段。分離線粒體和細(xì)胞質(zhì)片段后，用裂解緩沖液從兩片段中提取蛋白質(zhì)，BCA法蛋白濃度定量試劑盒測定蛋白含量，進(jìn)一步進(jìn)行Western blot檢測。

1.2.9 Western blot檢測蛋白表達(dá)取5 μg蛋白樣品在2×樣品緩沖液中溶解，之后采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離目標(biāo)蛋白。然后將目標(biāo)蛋白條帶轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，在含體積分?jǐn)?shù)5%牛血清白蛋白的封閉液中室溫孵育60 min。取免疫印跡一抗(Cyt C 11000，鼠抗人Cyt C氧化酶IV亞型多克隆抗體12500，鼠抗人LC3B多克隆抗體11500，PINK1 12000，Parkin 11000)用于與膜在4 ℃下通宵孵育。用抗小鼠IgG-過氧化物酶結(jié)合的二級抗體室溫孵育2 h。使用化學(xué)發(fā)光盒對蛋白條帶進(jìn)行可視化處理，并用ImageJ軟件對其進(jìn)行量化。每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞合適的藍(lán)光照射時間ARPE-19細(xì)胞經(jīng)藍(lán)光照射1 h、2 h、4 h、6 h、8 h后，細(xì)胞存活率逐漸降至(94.45±3.20)%、(86.20±4.88)%、(78.10±5.49)%、(77.34±6.28)%、(76.52±6.50)%。當(dāng)連續(xù)照射4 h以上，ARPE-19細(xì)胞存活率均低于80%，故選擇照射時間為4 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 AS-IV對藍(lán)光照射后ARPE-19細(xì)胞存活率的影響光照組細(xì)胞存活率明顯低于空白組[(79.24±3.25)%、(100.02±1.55)%，t=16.319、P<0.001]；但是光照+AS-IV組細(xì)胞存活率[(93.85±1.79)%]則明顯高于光照組(t=11.141、P<0.001)。

2.3 AS-IV對藍(lán)光照射后ARPE-19細(xì)胞凋亡的影響光照組細(xì)胞凋亡率明顯高于空白組[(27.85±3.44)%、(3.65±0.59)%，t=19.605、P<0.001]，但是光照+AS-IV組細(xì)胞凋亡率[(11.03±1.65)%]則明顯低于光照組(t=12.472、P<0.001)(圖1)。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測各組ARPE-19細(xì)胞凋亡率

2.4 AS-IV對藍(lán)光照射后ARPE-19細(xì)胞線粒體膜電位的影響采用JC-1熒光探針綠/紅色熒光強(qiáng)度比代表線粒體膜電位。光照組細(xì)胞線粒體膜電位高于空白組(綠/紅色熒光強(qiáng)度比值分別為1.72±0.25、0.58±0.07，t=12.418、P<0.001)，但是光照+AS-IV組細(xì)胞線粒體膜電位(綠/紅色熒光強(qiáng)度比值為0.81±0.10)則低于光照組(t=9.559、P<0.001)(圖2)。

圖2 JC-1熒光探針檢測各組ARPE-19細(xì)胞線粒體膜電位

2.5 AS-IV對藍(lán)光照射后ARPE-19細(xì)胞ROS含量的影響DCF熒光強(qiáng)度代表ROS含量。光照組和光照+AS-IV組細(xì)胞DCF熒光強(qiáng)度分別是空白組細(xì)胞的(2.45±0.30)倍和(1.53±0.28)倍，光照+AS-IV組細(xì)胞ROS含量少于光照組(t=6.341、P<0.001)(圖3)。

圖3 DHE熒光探針法檢測ARPE-19細(xì)胞DCF熒光強(qiáng)度

2.6 各組ARPE-19細(xì)胞PINK1和Parkin蛋白表達(dá)自藍(lán)光照射4 h開始，光照組ARPE-1細(xì)胞PINK1蛋白(4 h：0.68±0.07，6 h：0.70±0.08，8 h：0.70±0.10)和Parkin蛋白(4 h：0.45±0.06，6 h：0.50±0.08，8 h：0.49±0.07)相對表達(dá)量較空白組(PINK1蛋白：1.03±0.07，Parkin蛋白：0.95±0.08)均明顯降低(均為P<0.001)。然而同樣用藍(lán)光照射4 h，光照+AS-IV組ARPE-19細(xì)胞PINK1蛋白(1.18±0.14，t=9.035、P<0.001)和Parkin蛋白(0.77±0.09，t=8.106、P<0.001)相對表達(dá)量則均明顯高于光照組。此外，與空白組相比，轉(zhuǎn)染對照siRNA后光照+AS-IV+siNC組ARPE-19細(xì)胞PINK1蛋白(0.99±0.17，t=0.615、P=0.548)和Parkin蛋白(0.94±0.12，t=0.196、P=0.847)相對表達(dá)量基本不變；轉(zhuǎn)染siPINK1后光照+AS-IV+siPINK1組ARPE-19細(xì)胞PINK1蛋白(0.59±0.04)和Parkin蛋白(0.43±0.03)相對表達(dá)量均明顯降低(均為P<0.001)。

2.7 各組ARPE-19細(xì)胞CytC和LC3B蛋白表達(dá)空白組和光照組ARPE-19細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)Cyt C蛋白相對表達(dá)量分別為0.36±0.03和1.54±0.12(t=26.981、P<0.001)；線粒體Cyt C蛋白相對表達(dá)量分別為0.21±0.03和0.09±0.02 (t=9.414、P<0.001)；總蛋白中LC3B-II/I蛋白表達(dá)比值分別為0.76±0.08和0.17±0.03 (t=19.532、P<0.001)。與光照組相比，光照+AS-IV組ARPE-19細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)Cyt C蛋白相對表達(dá)量降低至0.67±0.08(t=17.059、P<0.001)，線粒體Cyt C蛋白相對表達(dá)量升高至0.16±0.03(t=5.491、P<0.001)，總蛋白中LC3B-II/I蛋白表達(dá)比值升高至3.44±0.27(t=34.047、P<0.001)。與光照+AS-IV組相比，光照+AS-IV+siNC組ARPE-19細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和線粒體Cyt C蛋白相對表達(dá)量(0.70±0.09、0.15±0.03)、總蛋白中LC3B-II/I蛋白表達(dá)比值(3.26±0.33)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)，而光照+AS-IV+siPINK1組ARPE-19細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)Cyt C蛋白相對表達(dá)量(1.20±0.15)較光照+AS-IV+siNC組升高(t=8.085、P<0.001)，線粒體Cyt C蛋白相對表達(dá)量降低至0.02±0.01(t=11.628、P<0.001)，總蛋白中LC3B-II/I蛋白表達(dá)比值則降低至0.85±0.13(t=19.224、P<0.001)。

3 討論

AMD是老年人群中常見的慢性漸進(jìn)性黃斑退行性疾病[8]。AMD患者RPE功能出現(xiàn)失調(diào)并最終退化，導(dǎo)致光感受器細(xì)胞死亡以及視覺功能喪失[9-10]。AS-IV是從傳統(tǒng)中藥黃芪中提取的一種天然抗氧化劑[11]，目前已證實(shí)AS-IV可提高細(xì)胞抗氧化能力，對糖尿病視網(wǎng)膜病變具有一定的預(yù)防作用[12-13]。在本研究中，我們觀察到AS-IV可通過激活PINK1/Parkin通路，進(jìn)而抑制ARPE-19細(xì)胞自噬和凋亡，對藍(lán)光損傷的APRE-19細(xì)胞發(fā)揮一定的保護(hù)作用。

RPE細(xì)胞是視網(wǎng)膜的主要細(xì)胞，藍(lán)光刺激導(dǎo)致的RPE細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷與AMD的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[14-15]。在本研究中，我們證實(shí)藍(lán)光照射可誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷和線粒體功能障礙，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡，而且PINK1/Parkin通路在其中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。因此，保護(hù)RPE細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷是防治AMD的重要策略。氧化應(yīng)激損傷是由ROS產(chǎn)生過多所致，ROS含量過高可改變細(xì)胞蛋白和脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙，包括能量代謝受損、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)功能改變、細(xì)胞運(yùn)輸機(jī)制受損、免疫激活和炎癥反應(yīng)[16]。線粒體是ROS的一個重要來源，線粒體膜電位越高，產(chǎn)生的ROS越多[17]。在本研究中，光照組ARPE-19細(xì)胞線粒體膜電位較空白組顯著升高，然而光照+AS-IV組細(xì)胞線粒體膜電位則較光照組顯著下降，同時細(xì)胞質(zhì)Cyt C蛋白表達(dá)水平降低，線粒體Cyt C蛋白表達(dá)水平升高。這說明藍(lán)光誘導(dǎo)可導(dǎo)致線粒體內(nèi)膜非特異性通道線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放，釋放出大量Cyt C進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，Cyt C通過與凋亡酶激活因子1形成多聚復(fù)合體，進(jìn)而啟動caspase信號凋亡途徑。此外有研究證實(shí)，AS-IV在氧化應(yīng)激自噬調(diào)節(jié)中起著潛在的作用，能夠通過激活自噬抑制缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡[18-19]。這與本研究結(jié)果基本一致。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)光損傷能夠使ARPE-19細(xì)胞LC3B-II/I蛋白表達(dá)比值降低，說明藍(lán)光可通過調(diào)節(jié)ROS的生成抑制RPE細(xì)胞自噬，但是AS-IV則能夠逆轉(zhuǎn)上述作用。因此，AS-IV可能有利于保護(hù)RPE細(xì)胞免受ROS誘導(dǎo)的氧化損傷。

在哺乳動物細(xì)胞中，Ser/Thr激酶PINK1和E3泛素連接酶Parkin可以協(xié)同感知線粒體功能狀態(tài)，并通過自噬途徑標(biāo)記受損線粒體以便進(jìn)一步處理。因此，PINK1/Parkin信號途徑在細(xì)胞自噬過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[20]。PINK1/Parkin通過誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，可進(jìn)一步清除受損線粒體并改善線粒體代謝和功能，減少ROS的過量蓄積，保護(hù)細(xì)胞免于遭受更嚴(yán)重的氧化應(yīng)激損傷[21]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)光照組ARPE-19細(xì)胞中PINK1和Parkin蛋白表達(dá)下調(diào)，而經(jīng)AS-IV處理后光照+AS-IV組ARPE-19細(xì)胞中PINK1和Parkin蛋白表達(dá)增加。這些情況在光照+AS-IV+siPINK1組則被逆轉(zhuǎn)，說明藍(lán)光可能通過抑制 PINK1/Parkin信號通路發(fā)揮對RPE細(xì)胞產(chǎn)生的氧化應(yīng)激損傷，而激活PINK1/Parkin信號通路可能是AS-IV保護(hù)RPE細(xì)胞免受藍(lán)光損傷的分子機(jī)制之一。

綜上所述，AS-IV對藍(lán)光誘導(dǎo)損傷的RPE細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用，可抑制細(xì)胞產(chǎn)生大量ROS，避免細(xì)胞線粒體損傷和細(xì)胞凋亡，維持細(xì)胞活力和自噬過程，其機(jī)制可能與AS-IV上調(diào)細(xì)胞PINK1/Parkin信號通路有關(guān)。