李陽，趙天倚，步洪石，王淑敏

（長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林長春130117）

近年來，酒精性肝病的發(fā)病率呈逐年上升變化趨勢，臨床治療主要通過阻斷酒精攝入和藥物輔助兩方面對其進(jìn)行干預(yù)，常因患者配合度低戒酒效果不佳從而達(dá)不到治療效果，而長時間服藥會產(chǎn)生副作用從而對機(jī)體產(chǎn)生毒害反應(yīng)。藥食兩用中草藥安全性高，患者以食療代替藥療的模式可達(dá)到對慢性疾病預(yù)防的目的[1]。

葛根山楂人參顆粒由葛根6 g、砂仁6 g、山楂3 g、麩炒白術(shù)3 g、人參和茯苓各1.5 g配制而成，具有解酒保肝、化酒祛濕、溫中和胃的功效。有關(guān)研究人員發(fā)現(xiàn)，解酒護(hù)肝產(chǎn)品能夠顯著提高受試動物體內(nèi)乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶的活力，同時可降低血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶的平均含量以及丙二醛含量，增加機(jī)體內(nèi)肝臟超氧化物歧化酶活力及還原性谷胱甘肽含量，起到解除酒毒保護(hù)肝臟功能的效果[2-4]。本研究擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，從靶點(diǎn)預(yù)測、網(wǎng)絡(luò)分析及分子對接以及動物實(shí)驗(yàn)揭示葛根山楂人參顆粒解酒保肝作用的藥理機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

雄性昆明小鼠，體重20～22 g，SPF級，由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證編號：SCXK（遼）2020-0001；合格證編號：210726200100461748。正常飼養(yǎng)，自由攝取水和食物，保持12 h光暗循環(huán)。

葛根山楂人參顆粒由長春中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室制備。甘草酸二銨腸溶膠囊（中國正大天晴藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號：200711102）；二鍋頭白酒（北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司，批號：20200618）；丙二醛（MDA，批號：20210322）、還原性谷胱甘肽（GSH，批號：20210320）、甘油三脂（TG，批號：20210322），以上試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 分組、造模及給藥

將所有實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為4組，每組10只，即空白組、模型組、甘草酸二銨組（60 mg kg-1）[5]和葛根山楂人參顆粒組（800 mg kg-1），各組按照相應(yīng)劑量連續(xù)灌胃10 d。最后一天，給藥4 h后，除空白組外，其余各組均以每劑量12 h的間隔灌胃2劑56°白酒（12 mL kg-1），空白組給予等量的蒸餾水[6]。

1.3 組織指標(biāo)檢測

試驗(yàn)小鼠末次給予酒精1 h后，頸脫臼處死，取部分肝組織制成10%肝組織勻漿，4℃離心，取上清液。根據(jù)試劑盒說明書測定肝組織上清液中MDA、GSH和TG的水平[7,8]。

1.4 葛根山楂人參顆粒中化學(xué)成分檢索與篩選

運(yùn)用中草藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺（TCMSP，http://tcmspw.com）[9]，分別輸入關(guān)鍵詞“葛根”、“砂仁”、“人參”、“白術(shù)”和“茯苓”，檢索5味中藥中含有的化學(xué)成分，整合得到相應(yīng)的化學(xué)成分，將化合物口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18作為篩選要求[10-18]。再結(jié)合中醫(yī)藥百科全書數(shù)據(jù)庫ETCM（http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index/)檢索山楂的活性成分[12]。

1.5 靶點(diǎn)的預(yù)測與“處方中藥-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在PubChem數(shù)據(jù)庫中下載活性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，將其導(dǎo)入靶點(diǎn)預(yù)測數(shù)據(jù)庫Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）進(jìn)行靶標(biāo)預(yù)測，得到的靶標(biāo)通過UniProt（https://www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫，校準(zhǔn)其標(biāo)準(zhǔn)基因名，種群限定為“Homo sapiens”，獲取作用于人種的葛根山楂人參顆粒的有效靶點(diǎn)[10,12,18,19]。整理中藥、成分、靶點(diǎn)表格文件，將其導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建“葛根山楂人參顆粒中藥-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。

1.6 疾病靶點(diǎn)的篩選與構(gòu)建

以酒精性肝病為關(guān)鍵詞，限定物種為“Homo sapiens”，通過GeneCards、OMIM、Drugbank和PharmGkb等數(shù)據(jù)庫獲取作用于疾病的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.7 葛根山楂人參顆粒蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

將與酒精性肝病相關(guān)靶點(diǎn)和葛根山楂人參顆粒的成分靶點(diǎn)進(jìn)行交互，結(jié)果導(dǎo)入STRING（https://stringdb.org/）數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建蛋白間的相互作用關(guān)系，保存TSV格式的互作結(jié)果文件，并導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件進(jìn)行Network Analyzer分析[10]，將重復(fù)和孤立邊刪除，以節(jié)點(diǎn)（node）由大到小、顏色由深到淺用于反映網(wǎng)絡(luò)連接度[20,21]，保存設(shè)置，輸出文件得到葛根山楂人參顆粒作用靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.8 靶點(diǎn)的基因本體及通路富集分析

為了進(jìn)一步明確篩選出的靶標(biāo)蛋白基因的功能以及在信號通路中的作用，將1.2所得處方相關(guān)成分靶點(diǎn)導(dǎo)入matescape數(shù)據(jù)庫(http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)[22]，本數(shù)據(jù)庫整合了GO、KEGG、UniProt和DrugBank等數(shù)據(jù)庫內(nèi)容，其數(shù)據(jù)更新較快，能夠完成通路富集分析和生物過程注釋，操作時將靶基因名稱列表保存文本文檔進(jìn)行上傳，物種限定為人，轉(zhuǎn)換gene ID后，進(jìn)行GO生物學(xué)過程注釋、聚類分析和KEGG通路富集分析，將所得KEGG分析結(jié)果前20個條目的P值進(jìn)行轉(zhuǎn)換，運(yùn)用微生信繪圖云平臺（http://www.bioinformatics.com.cn/login/）對所得結(jié)果進(jìn)行氣泡圖繪制。

1.9 分子對接

運(yùn)用AutoDock軟件將PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中度值前3的NFKB1、NR3C1和SRC分別與篩選出來的3個關(guān)鍵成分進(jìn)行分子對接；在PubChem數(shù)據(jù)庫中查詢相應(yīng)化合物結(jié)構(gòu)，結(jié)果文件保存為SDF格式，通過導(dǎo)入Open Bable軟件，將其轉(zhuǎn)化保存為mol2格式，打開分子對接軟件AutoDock Tools 1.5.6將其加氫，并計(jì)算電荷等操作后保存為pdbqt格式文件。在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫PDB（https://www.rcsb.org/）中下載3個蛋白的三維晶體結(jié)構(gòu)pdb格式文件，導(dǎo)入Pymol軟件將蛋白的水分子以及小分子配體去除后，導(dǎo)入Auto-Dock Tools進(jìn)行加氫，計(jì)算電荷操作，完成后保存文件為pdbqt格式。打開AutoDock Vina 4.0軟件，進(jìn)行分子對接[11,12]，將得到的最優(yōu)對接結(jié)果導(dǎo)入Discovery Studio 2020 Client進(jìn)行視圖優(yōu)化處理。

2 結(jié)果

2.1 葛根山楂人參顆粒對酒精性肝損傷小鼠MDA、GSH和TG的影響

與空白組相比，模型組肝組織中的MDA水平、TG含量顯著升高（P＜0.01），GSH水平顯著降低（P＜0.01）。與模型組相比，葛根山楂人參顆粒給藥組MDA水平顯著降低（P＜0.05），TG含量顯著降低（P＜0.05），GSH水平顯著升高（P＜0.05）[23]。以上結(jié)果表明葛根山楂人參顆?？梢悦黠@減輕酒精性肝損傷小鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)變化，同時升高還原型谷胱甘肽含量，起到對肝臟的保護(hù)作用，結(jié)果見表1。

表1 小鼠肝組織中MDA、TG和GSH含量Table 1 Contents of MDA,TG and GSH in the mice liver tissue

2.2 處方中藥活性成分及靶標(biāo)篩選結(jié)果

TCMSP數(shù)據(jù)庫對葛根山楂人參顆粒進(jìn)行檢索共得到89個活性成分，其中葛根4個，山楂31個，人參22個，麩炒白術(shù)7個，砂仁10個，茯苓15個，剔除重復(fù)項(xiàng)最終獲得活性成分59個，與活性成分相關(guān)的靶點(diǎn)共1 474個，去除重復(fù)項(xiàng)獲得靶點(diǎn)956個。運(yùn)用Cy-toscape軟件繪制所得葛根山楂人參顆粒中藥-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)如圖1，綠色圓形為處方中5味中藥，橙色三角形為活性成分，紫色菱形為對應(yīng)靶點(diǎn)[20]。拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)分析得到度值前3位的成分為Dehydroeburiconic acid（去氫沒食子酸）、Sulfurenic acid（硫色多孔菌酸）和Quercetin（槲皮素）對應(yīng)度值分別為47、38和21。

圖1 葛根山楂人參顆粒中藥-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Fig.1 The drug-component-target network of Gegen Hawthorn Ginseng granules

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果

運(yùn)用STRING數(shù)據(jù)庫平臺分析葛根山楂人參顆粒中的組方靶點(diǎn)，將靶點(diǎn)與靶點(diǎn)之間相互作用關(guān)系導(dǎo)出作用結(jié)果另存文件為TSV格式，將文件導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行分析，經(jīng)互作網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)計(jì)算，結(jié)果顯示其涉及80個節(jié)點(diǎn)，154條邊，如圖2所示；其中以圓形節(jié)點(diǎn)代表蛋白，以每條邊表示蛋白與蛋白之間的相互作用關(guān)系，兩個蛋白之間有邊相連即代表其存在相互作用。其中以節(jié)點(diǎn)顏色深淺、形狀大小表示度值的高低，顏色越深、形狀越大代表該節(jié)點(diǎn)度值越高，即該節(jié)點(diǎn)的關(guān)鍵程度越高[20,21]。以度值大小梯度排序得到交互作用較多的靶標(biāo)前10個為NR3C1、NFKB1、SRC、RXRA、AKTI、NCOA2、PPARG、ESR1、AR和AER1C3。AKTI、NCOA2與腫瘤的生物學(xué)特征均有一定關(guān)系，相關(guān)蛋白與AKTI結(jié)合可抑制前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[24]；NCOA2的融合可作為類似卵巢性索腫瘤的子宮腫瘤診斷評估[25]。ESR1、NR3C1、AR系列為激素受體基因，涉及雌激素、糖皮質(zhì)激素和內(nèi)分泌調(diào)節(jié)等信號通路。有研究表明，ESR1表達(dá)CCL23的表達(dá)受ESR1轉(zhuǎn)錄調(diào)控；另一方面，CCL23可以抑制AKT信號的激活，從而促進(jìn)ESR1的表達(dá)，在肝癌細(xì)胞中形成反饋環(huán)，從而抑制肝癌的發(fā)展[26]。AKT是細(xì)胞存活的信號和必要因素，它參與細(xì)胞的生長和增殖，發(fā)揮了重要作用[27]；同時AKT1在肝細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞的纖維生成過程中起到了抑制作用[28]，對于防治肝纖維化的發(fā)展提供了新的思路。

圖2 葛根山楂人參顆粒解酒保肝作用潛在靶點(diǎn)蛋白-蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)分析Fig.2 The PPI network analysis of Gegen Hawthorn Ginseng Granule in relieving alcoholism and protecting liver

2.4 GO富集分析及KEGG富集分析

取葛根山楂人參顆粒解酒護(hù)肝作用相關(guān)的前80個主要靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集分析，在GO分析得到的生物過程結(jié)果中選取前20個富集程度最高的生物過程[6]，輸出條目圖表見圖3。其主要包括類固醇代謝、細(xì)胞對有機(jī)環(huán)狀化合物反應(yīng)、一元羧酸代謝過程、脂質(zhì)代謝過程的調(diào)節(jié)和對有毒物質(zhì)的反應(yīng)?；蚬δ芫垲惤Y(jié)果展示了各生物過程間的關(guān)系聯(lián)接包括細(xì)胞對有毒物質(zhì)、脂代謝、脂多糖、細(xì)胞分化和氧化應(yīng)激的反應(yīng)等，見圖4和圖5。圖4是由群集著色構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)，節(jié)點(diǎn)顏色接近的是具有其中相同群集ID的生物過程，圖5是由P值著色構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)，其中具有較深著色的代表其含有較多基因的項(xiàng)并具有較顯著的P值；KEGG分析選取前20條富集程度最高的信號通路見圖6，相關(guān)靶點(diǎn)主要在癌癥、類固醇激素生物合成、EB病毒感染、甲狀腺激素信號、胰高血糖素信號和膽汁分泌異常等通路上富集。

圖3 GO富集分析前20條條目Fig.3 The first 20 entries of GO enrichment analysis

圖4 葛根山楂人參顆粒解酒保肝作用GO聚類分析（群集著色）Fig.4 Gegen Hawthorn Ginseng Granule in relieving alcoholism and protecting liver GO clustering analysis(cluster coloring)

圖5 葛根山楂人參顆粒解酒護(hù)肝作用GO聚類分析（值顯著性著色）Fig.5 Gegen Hawthorn Ginseng Granule in relieving alcoholism and protecting liver GO clustering analysis(value significant coloring)

圖6 葛根山楂人參顆粒解酒保肝作用前20條KEGG通路富集分析Fig.6 The first 20 entries of KEGG channel enrichment analysis for Gegen Hawthorn Ginseng Granule in relieving alcoholism and protecting liver

2.5 分子對接結(jié)果

當(dāng)分子與受體穩(wěn)定結(jié)合時，結(jié)合能越低，發(fā)生相互作用的可能性則越大，結(jié)果顯示，Dehydroeburiconic acid與SRC最小結(jié)合能為-8.63 kJ/mol，Sulfurenic acid與SRC最小結(jié)合能為-7.67 kJ/mol，Sulfurenic acid與NR3C1最小結(jié)合能為-4.91 kJ/mol，皆具有穩(wěn)定的結(jié)合表現(xiàn)[11,12]。核心化合物Dehydroeburiconic acid、Sulfurenicacid與SRC及NR3C1對接模式如下圖。

圖7 Dehydroeburiconic acid與SRC對接模式圖Fig.7 The dehydroeburiconic acid and SRC docking mode diagram

圖8 Dehydroeburiconic acid與SRC成鍵方式圖Fig.8 The dehydroeburiconic acid and SRC bonding mode diagram

圖9 Sulfurenic acid與SRC對接模式圖Fig.9 The sulfurenic acid and SRC docking mode diagram

圖10 Sulfurenic acid與SRC成鍵方式圖Fig.10 The sulfurenic acid and SRC bonding mode diagram

圖11 Sulfurenic acid與NR3C1對接模式圖Fig.11 The sulfurenic acid and NR3C1 docking mode diagram

圖12 Sulfurenic acid與NR3C1成鍵方式圖Fig.12 The sulfurenic acid and NR3C1 bonding mode diagram

表2 靶點(diǎn)PDB ID信息Table 2 The PDB ID information of target

3 討論

酒精性肝病已經(jīng)嚴(yán)重影響人類的身體健康，多是由于長期大量飲酒而導(dǎo)致慢性中毒性肝損傷，發(fā)病初期主要癥狀為輕度脂肪肝，進(jìn)而可發(fā)展成酒精性肝炎、肝纖維化和肝硬化，嚴(yán)重時可導(dǎo)致肝功能衰竭[29,30]?，F(xiàn)代臨床治療多給予保肝、抗炎藥物多烯磷脂酰膽堿、還原型谷胱甘肽和水飛薊素類等，改善肝臟生物化學(xué)指標(biāo)，達(dá)到保肝作用。對于輕中度酒精性脂肪肝的藥物如甘草酸二銨、甘草酸單銨半胱氨酸等應(yīng)用也十分廣泛[31,32]。美他多辛可加速酒精從血清中清除，可改善慢性酒精中毒后的肝功能[33]。隨著多種抗炎保肝藥物的長期服用，其帶來的毒副作用也越發(fā)明顯，進(jìn)一步增加了患者肝臟負(fù)擔(dān)。中藥復(fù)方具有多成分、多靶點(diǎn)和多途徑的作用優(yōu)勢，其安全性較高，能夠發(fā)揮良好的藥效。

本研究通過TCMSP、TCMID、ETCM數(shù)據(jù)庫檢索和篩選后共獲得了59個潛在活性成分，將篩選得到重要性前3的活性成分與蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中度值前3位的核心靶蛋白進(jìn)行了分子對接驗(yàn)證，其中槲皮素和脫氫沒食子酸等化合物相關(guān)的靶蛋白較多且穩(wěn)定性較好，與核心靶點(diǎn)能夠較好地結(jié)合；槲皮素屬于黃酮類化合物，研究表明該類化合物具有改善脂肪酸代謝、抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)腸道微生物群和膽汁酸、保護(hù)肝臟的作用[34]。沒食子酸屬于多酚化合物，研究表明多酚類化合物可通過抗氧化、抗炎、脂質(zhì)調(diào)節(jié)、抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)腸道微生物群組成和抗纖維化的作用機(jī)制達(dá)到對肝臟的保護(hù)作用[35]。PPI網(wǎng)絡(luò)得到的核心靶點(diǎn)NFB1基因，其多態(tài)性可影響NF-B信號通路的活化水平[36]，當(dāng)人體內(nèi)攝入過多酒精后，過量酒精產(chǎn)生的毒性作用導(dǎo)致活性氧自由基大量生成，從而引起肝細(xì)胞膜脂質(zhì)的過氧化，同時內(nèi)毒素水平的劇增誘導(dǎo)了NF-B的激活，大量的炎癥介質(zhì)由此產(chǎn)生，并與炎癥級聯(lián)放大作用效應(yīng)，導(dǎo)致重要的細(xì)胞器受到侵害，從而引發(fā)肝細(xì)胞功能紊亂甚至造成肝細(xì)胞凋亡或壞死，最終影響肝臟功能并導(dǎo)致酒精性肝病的形成[37,38]。分子對接過程中葛根山楂人參顆粒中的活性成分與NFB1基因可以穩(wěn)定結(jié)合，從而抑制炎癥的發(fā)展達(dá)到保護(hù)肝臟的目的。SRC激酶是在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、遷移和侵襲起著重要作用的一個抗腫瘤藥物靶點(diǎn)，在肺癌、乳腺癌、腎癌、直腸癌和胰腺癌等多種腫瘤中都有較高水平的表達(dá)。SRC激酶抑制劑藥物對肝纖維化有良好的治療效果[39,40]，同時抑制肝癌的發(fā)展。對接結(jié)果顯示，蛋白NR3C1與葛根山楂人參顆粒中的主要成分結(jié)合良好，而NR3C1是一種糖皮質(zhì)激素受體，研究表明NR3C1與NCOA1、NCOA2、NOCRO1和FKBP5等蛋白存在相互作用，并且參與了炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖和分化等生物過程[41]。在炎癥反應(yīng)中，抗炎細(xì)胞因子可在糖皮質(zhì)激素的誘導(dǎo)下合成[42]，炎性細(xì)胞因子白介素6（IL-6）、白介素8（IL-8）和腫瘤壞死因子-（TNF-）的合成受到抑制，藥物即可發(fā)揮抗炎和免疫抑制作用，干預(yù)炎癥反應(yīng)，從而達(dá)到防治肝炎、阻斷肝纖維化發(fā)展的效果。其中，作為一種急性和慢性炎癥的主要調(diào)節(jié)因子白介素6，密切影響了肝細(xì)胞的壞死程度，肝衰竭的嚴(yán)重程度也可以通過IL-6的高表達(dá)去反應(yīng)[43]。臨床上，激素治療酒精性肝病的案例，效果也較為顯著[44]。但由于個體差異以及激素耐受人群的不同，在用于治療酒精性肝病上還存有爭議。葛根山楂人參顆粒是在經(jīng)典解酒方劑葛花解酒湯的基礎(chǔ)上重新配伍調(diào)制，通過相關(guān)數(shù)據(jù)庫分析葛根山楂人參顆粒得到的活性成分與SRC、NR3C1等蛋白具有較好的對接活性，在分子層面上，藥物靶點(diǎn)作用疾病靶標(biāo)，二者穩(wěn)定結(jié)合，阻斷疾病的發(fā)生，達(dá)到防御的目的。通路分析結(jié)果顯示，葛根山楂人參顆?？蓞⑴c甾類激素生物合成通路、癌癥通路和胰高血糖素通路等發(fā)揮其藥理作用。相關(guān)研究表明甾類化合物對于抗炎、抗癌和鎮(zhèn)痛等方面能夠發(fā)揮良好的藥用效果[45]。處方中的成分基因促進(jìn)甾類化合物的合成，形成抗炎屏障，抑制炎癥的產(chǎn)生。本研究通過大數(shù)據(jù)的分析與處理，對于中藥復(fù)方藥理作用機(jī)制的探索提供了一定的參考價值，進(jìn)一步體現(xiàn)了葛根山楂人參顆粒對于解酒護(hù)肝的臨床治療潛力。

綜上所述，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)分析了葛根山楂人參顆粒治療酒精性肝病的潛在作用機(jī)制，為酒精性肝病的防治提供了新的思路與依據(jù)，同時對于解酒護(hù)肝保健食品的研發(fā)也提供了新的方法。以食療代替藥療，讓中醫(yī)養(yǎng)生走入尋常百姓家，致力更多研究開發(fā)保肝護(hù)肝的新產(chǎn)品，促進(jìn)健康產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展！