陳文妤, 吳晨光

(1. 江蘇大學醫(yī)學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2. 江蘇大學附屬人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇 鎮(zhèn)江 212002)

甲狀腺癌是成人最常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年升高，在2018年全球癌癥統(tǒng)計中，其發(fā)病率排第9位[1]。乳頭狀甲狀腺癌(papillary thyroid cancer，PTC)是最常見的甲狀腺癌類型，PTC尤其是甲狀腺微小乳頭狀癌的檢出率升高被認為是甲狀腺癌發(fā)病率升高的主要原因，但細針穿刺活檢及相關(guān)突變基因檢測均存在一定的局限性[2]，同時對于PTC可能存在的過度診斷和過度治療也存在爭議。另一方面，雖然與其他病理類型的甲狀腺癌相比，PTC的惡性程度較低，治療效果及總體預(yù)后較好，但是10%～15%的患者可出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移、復發(fā)或放射性碘治療耐受，導致整體生存率下降[3]。因此，尋找潛在的生物標志物以在疾病早期階段識別高風險的PTC患者，提供潛在的治療靶點，對PTC患者的診斷、治療、長期管理及預(yù)后判斷具有重要意義。研究表明，長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)與PTC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。LncRNA能在多個表達層面參與調(diào)控基因組轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，為PTC的診斷和治療提供了新的重要靶點。本文介紹lncRNA調(diào)控PTC的機制。

1 LncRNA概述

LncRNA是一類序列長度大于200個單位的RNA分子，主要包括長基因間非編碼RNA(long intergenic non-coding RNAs, lincRNAs)和蛋白質(zhì)編碼基因的天然反義轉(zhuǎn)錄本[4]。大多數(shù)lncRNA具有順式調(diào)控能力，但缺乏翻譯和編碼蛋白等能力。

與微小RNA(miRNA)相比，lncRNA的功能更加多樣化，可在多個表達水平調(diào)控基因表達。染色質(zhì)修飾是lncRNA的一項重要功能。lncRNA可以與染色質(zhì)修飾復合體相互作用，并通過將這些復合體招募到特定的基因組位點來介導表觀遺傳變化[5]。LncRNA的另一項重要功能是轉(zhuǎn)錄調(diào)控，可以直接調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄基因，也可以靶向轉(zhuǎn)錄激活因子影響基因轉(zhuǎn)錄。還有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA通過形成R環(huán)或lncRNA-DNA-DNA三連體結(jié)構(gòu)，直接與DNA結(jié)合以調(diào)控基因表達[6]。LncRNA在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。最近已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多l(xiāng)ncRNA通過改變核小體的功能和完整性在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA與多個mRNA轉(zhuǎn)錄加工步驟(例如剪接、轉(zhuǎn)運和降解)存在特異性相互作用，一些核定位的lncRNA被發(fā)現(xiàn)與核糖體有關(guān)，說明lncRNA可能參與翻譯調(diào)控[8]。此外，lncRNA能編碼一種長度在100個氨基酸以內(nèi)的小肽，與肌肉功能、胚胎發(fā)育、腫瘤細胞的增殖等有關(guān)[9]。

2 LncRNA在PTC中的作用機制

LncRNA在PTC中起重要調(diào)控作用，其異常表達通常與PTC的腫瘤大小、包膜浸潤、淋巴結(jié)和遠處轉(zhuǎn)移、術(shù)后復發(fā)及放射性碘治療耐受等相關(guān)。LncRNA通過調(diào)控信號通路中的關(guān)鍵蛋白表達、基因突變、DNA甲基化或者作為競爭性內(nèi)源性RNA(competing endogenous RNA, ceRNA)調(diào)控下游應(yīng)答元件，影響腫瘤細胞增殖、侵襲、遷移、凋亡、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)等細胞功能，是PTC潛在的診斷和治療的分子標志物。

2.1 LncRNA調(diào)控信號通路

現(xiàn)有研究已發(fā)現(xiàn)多個信號通路的激活或失活對PTC的發(fā)生、進展存在影響，例如磷脂酰肌醇激酶(phosphatidylinositide 3-kinases,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB或AKT)[10]，Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)[11]，核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor κB, NF-κB)[12]，信號轉(zhuǎn)錄和激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)[13]，絲裂原激活蛋白激酶激酶1(mitogen-activated protein kinase kinase 1, MAP2K1或MEK1)/細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)等。近幾年的研究認為，lncRNA對PTC的調(diào)控作用與這些錯綜復雜的信號通路密切相關(guān)，lncRNA可能調(diào)控信號通路中的關(guān)鍵蛋白表達，影響腫瘤細胞的增殖能力和侵襲性。Wang等[14]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA 溶質(zhì)載體家族26成員4反義RNA 1(solute carrier family 26 member 4 antisense RNA 1, SLC26A4-AS1)在PTC組織中低表達，其主要定位于細胞核內(nèi)發(fā)揮作用，通過促進MAPK通路中富集的腫瘤蛋白p53表達抑制MAPK通路，進而抑制細胞的侵襲和遷移能力，并促進PTC細胞凋亡。此外，MAPK途徑的激活可能抑制SLC26A4-AS1表達。轉(zhuǎn)錄因子STAT3 誘導ABHD11-AS1(ABHD11 antisense RNA 1)過表達，通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路和靶向miR-1303-3p/STAT3軸促進PTC細胞的增殖和轉(zhuǎn)移[15]。肝細胞癌中上調(diào)的長鏈非編碼RNA(hepatocellular carcinoma up-regulated long non-coding RNA,HULC)過表達通過促進miR-106a表達增強PI3K/AKT和Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路活性，抑制PTC細胞的凋亡，并促進細胞增殖、遷移和侵襲[16]。Sun等[17]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA 核富集轉(zhuǎn)錄體1(nuclear paraspeckle assembly transcript 1, NEAT1)在PTC中表達顯著上調(diào)，其亞型NEAT1-2通過miR-491/谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶軸激活NF-κB通路，促進轉(zhuǎn)錄因子p65發(fā)生核異位并與下游纖連蛋白1啟動子部位結(jié)合，激活纖連蛋白1表達，促進PTC侵襲和轉(zhuǎn)移。此外，lncRNA DOCK9-AS2(dedicator of cytokinesis 9 antisense RNA2,)在PTC中高表達，DOCK9-AS2是一種源自PTC腫瘤干細胞樣細胞的外泌體lncRNA，PTC腫瘤干細胞樣細胞通過外泌體將DOCK9-AS2傳遞給受體PTC細胞，定位于PTC細胞的細胞核和細胞質(zhì)中，通過靶向miR-1972和Sp1轉(zhuǎn)錄因子促進β-連環(huán)蛋白的編碼基因連環(huán)蛋白β1表達，激活Wnt/β-連環(huán)蛋白通路，促進PTC細胞的增殖、遷移、侵襲、EMT，并增加干細胞特性相關(guān)蛋白CD133、胚胎干細胞關(guān)鍵蛋白、性別決定區(qū)Y框蛋白2(sex determining region Y-box 2，SOX2)表達[18]。

2.2 LncRNA調(diào)控EMT

EMT是上皮細胞失去極性，獲得遷移能力，然后向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的過程，它參與了胚胎發(fā)生過程中組織和器官的形成。目前的研究認為，腫瘤細胞可以重新激活EMT程序，從而增加其侵襲性、干細胞特性和耐藥性[19]。已有研究證實了lncRNA異常表達對EMT關(guān)鍵蛋白表達的影響。Zhou等[20]發(fā)現(xiàn)lncRNA 腫瘤易感基因2(cancer susceptibility 2，CASC2)過表達增加了上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin) 的mRNA和蛋白表達，抑制間質(zhì)細胞標志物E-盒結(jié)合鋅指蛋白1(zinc finger E-box binding homeobox 1，ZEB1)和神經(jīng)型鈣黏蛋白(N-cadherin)的mRNA和蛋白表達，從而抑制細胞侵襲。HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA(HOX transcript antisense RNA,HOTAIR)通過激活Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路使E-cadherin表達減少，波形蛋白表達增加，進而促進人甲狀腺癌細胞株的遷移和侵襲[21]。LINC0163在PTC中表達上調(diào)，影響EMT相關(guān)分子標志物表達，通過EMT促進PTC細胞增殖和轉(zhuǎn)移[22]。LncRNA SLC26A4-AS1與PTC的總體生存率有關(guān)[23]， 能促進EMT的關(guān)鍵蛋白E-cadherin表達，同時使ERK和波形蛋白表達降低，抑制EMT進程[14]。

2.3 LncRNA作為ceRNA

LncRNA參與構(gòu)建的ceRNA網(wǎng)絡(luò)是近幾年的研究熱點，lncRNA靶向miRNA的3′非翻譯區(qū)，競爭性結(jié)合miRNA并降低其濃度，影響具有共同miRNA應(yīng)答元件的mRNA表達，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控多種病理生理過程[24]。一項基于癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)，京都基因與基因組百科全書(kegg kyoto encyclopedia of genes and genome，KEGG)和基因本體論(Gene Ontology, GO)數(shù)據(jù)庫的研究中，運用微陣列表達譜構(gòu)建了PTC相關(guān)的lncRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)包含21個lncRNA、241個mRNA和803條網(wǎng)絡(luò)連接，可識別lncRNA 煙酰胺核苷酸轉(zhuǎn)氫酶反義RNA 1(nicotinamide nucleotide transhydrogenase antisense RNA 1，NNT-AS1)作為網(wǎng)絡(luò)中的中樞節(jié)點，通過競爭性結(jié)合miR-485與47個mRNA相互作用，且這些mRNA與腫瘤的信號通路有關(guān)[25]。此外，一個lncRNA可能與一個或多個miRNA靶向結(jié)合，不同的lncRNA也可能靶向同一個miRNA，這種錯綜復雜的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)帶來的多維累積效應(yīng)，是lncRNA參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的重要機制。

同源框A簇反義RNA 2(homeobox A cluster antisense RNA 2，HOXA-AS2)[26]、HULC[16]等大量lncRNA被發(fā)現(xiàn)通過ceRNA網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)PTC的發(fā)生、進展。Ding等[27]研究發(fā)現(xiàn)，小核仁RNA宿主基因1(small nucleolar RNA host gene 1，SNHG1)在PTC組織和細胞系中表達上調(diào)，SNHG1主要定位于細胞質(zhì)中，在轉(zhuǎn)錄后水平競爭性結(jié)合miR-199a-5p激活Sp1表達，從而促進PTC細胞的增殖和侵襲，并在體內(nèi)促進腫瘤生長。有趣的是，Sp1能靶向SNHG1啟動子區(qū)域，形成Sp1/SNHG1/miR-199a-5p/Sp1正反饋環(huán)，進一步加速腫瘤發(fā)生和進展。Liu等[28]發(fā)現(xiàn)，尿路上皮癌相關(guān)蛋白1(urothelial cancer associated 1，UCA1)在PTC組織和細胞系中上調(diào)，與miR-204互補結(jié)合，進而調(diào)節(jié)胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白5的表達，促進PTC細胞的增殖、侵襲和遷移。Wang等[29]驗證了心肌梗死相關(guān)轉(zhuǎn)錄物(myocardial infarction associated transcript，MIAT)上調(diào)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和較差的臨床病理分期有關(guān)，MIAT可能通過靶向miR-212促進PTC細胞的增殖、侵襲、遷移，從而促進腫瘤生長。此外，MIAT也能作為miR-324-3p的ceRNA誘導LIM和SH3蛋白1(LIM and SH3 protein 1，LASP1)基因過表達，并可能通過PI3K/AKT信號通路誘導PTC細胞的增殖和遷移[30]。雙同源異形盒A假基因8(double homeobox A pseudogene 8, DUXAP8)靶向miR-20b-5p，提高MEK1/2和ERK1/2磷酸化水平，并下調(diào)細胞周期蛋白D1和原癌基因c-myc表達，促進PTC細胞增殖并抑制細胞凋亡[31]。DUXAP8也可以通過miR-223-3p/C-X-C基序趨化因子受體4(C-X-C motif chemokine receptor 4，CXCR4)軸促進PTC細胞的增殖、遷移和侵襲性[32]。轉(zhuǎn)錄因子激活轉(zhuǎn)錄因子2(activating transcription factor 2, ATF2)結(jié)合lncRNA GAS8-AS1啟動子部位調(diào)控其表達，GAS8-AS1分別通過GAS8-AS1/miR-187-3p/自噬相關(guān)基因5(autophagy related 5, ATG5)軸和GAS8-AS1/miR-1343-3p/ATG7軸抑制PTC細胞增殖并顯著促進細胞自噬[33]。CASC7在PTC中起抑癌基因的作用，通過競爭性結(jié)合miR-34a-5p，上調(diào)腫瘤蛋白p73表達，抑制PTC細胞的增殖和遷移[34]。

LncRNA參與的ceRNA網(wǎng)絡(luò)除了參與調(diào)控PTC細胞的增殖、侵襲、遷移、凋亡、自噬等功能以外，還可能調(diào)控PTC細胞對放射性碘治療的耐受性。放射性碘治療是分化型甲狀腺癌的重要治療手段，但在治療過程中腫瘤可能出現(xiàn)失分化導致治療無效，還有部分患者在自然狀態(tài)下即可出現(xiàn)放射性碘治療耐受[35]。LncRNA NEAT1在耐放射性碘治療的PTC組織和細胞系中過表達，加速增殖并抑制細胞凋亡。NEAT1通過靶向miR-101-3p誘導纖連蛋白1基因表達，激活PI3K/AKT信號通路，降低放射性碘對腫瘤細胞的損害作用。研究發(fā)現(xiàn)母系表達基因3(maternally expression gene 3, MEG3)低表達與131I治療的甲狀腺癌患者預(yù)后不良有關(guān)。Liu等[36]發(fā)現(xiàn)過表達的MEG3通過競爭性結(jié)合miR-182抑制耐放射性碘的PTC細胞增殖，促進細胞凋亡并誘導DNA損傷，明顯提高甲狀腺癌細胞對放射性碘的敏感性，但MEG3/miR-182的下游靶基因和信號通路還有待進一步研究。

2.4 LncRNA調(diào)控BRAF基因突變

B-Raf原癌基因(B-Raf proto-oncogene，BRAF)基因突變是成人PTC最普遍的一種基因突變，對PTC的病理侵襲性、復發(fā)及死亡具有很強的預(yù)測價值，與PTC的增殖、轉(zhuǎn)移、耐放射性碘治療等有關(guān)，在PTC中的風險分層和管理中的潛在用途近年來備受關(guān)注[37- 38]。其中，BRAFV600E是最常見的類型，存在于半數(shù)以上的PTC中。

BRAF激活的非蛋白編碼RNA(BRAF-activated non-protein coding RNA, BANCR)是一種與BRAFV600E突變密切相關(guān)的lncRNA。Zheng等[39]發(fā)現(xiàn)敲除BANCR后可以使促甲狀腺激素受體失活從而抑制細胞周期蛋白1表達，將細胞周期阻滯在G0/G1期，減少PTC細胞增殖。其中，促甲狀腺激素受體是典型的G蛋白偶聯(lián)受體，血清促甲狀腺激素水平升高與惡性甲狀腺結(jié)節(jié)風險增加有關(guān)，二者的相互作用導致甲狀腺細胞功能和增殖的改變，可能是甲狀腺癌的誘發(fā)因素之一。另一項研究發(fā)現(xiàn)，BANCR的過度表達使腫瘤干細胞標志物富含亮氨酸重復G蛋白偶聯(lián)受體5和上皮細胞黏附分子的表達增加，并且上調(diào)MAPK信號通路中關(guān)鍵蛋白c-Raf、MEK1/2和ERK1/2的磷酸化水平，BANCR可能通過MAPK途徑調(diào)控腫瘤細胞的干細胞特性和腫瘤細胞分化[40]。但是，Liao等[41]的研究得到了相反的結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)與正常甲狀腺組織相比，PTC組織中BANCR表達下調(diào)，與腫瘤大小和多灶性病變有關(guān)，BANCR的過表達使ERK1/2和p38失活，抑制PTC的增殖和轉(zhuǎn)移，并促進細胞凋亡。這些不同的研究結(jié)果可能與腫瘤的異質(zhì)性有關(guān)，還需要更大的標本量和更深入的機制研究來解釋。

Esposito等[42]研究發(fā)現(xiàn)，酪氨酸激酶受體相關(guān)基因(correlated to ceptor tyrosine kinase，COMET)是一種天然反義轉(zhuǎn)錄本，在BRAFV600E突變或Ret原癌基因重排的腫瘤(即BRAF樣腫瘤)中高表達。在PTC中，COMET是屬于MAPK信號通路的不同基因共表達網(wǎng)絡(luò)的一部分，COMET耗盡可導致該網(wǎng)絡(luò)中基因的表達減少。沉默COMET可抑制BRAF樣腫瘤的Ret原癌基因重排，抑制細胞的增殖和侵襲，并提高腫瘤細胞對BRAF突變抑制劑維拉非尼的敏感性。因此，COMET可能是一種潛在的治療靶標。

2.5 LncRNA參與DNA甲基化調(diào)控

LncRNA可參與表觀遺傳學調(diào)控，改變DNA或RNA的甲基化狀態(tài)，進而控制相關(guān)基因的表達。Zhao等[43]發(fā)現(xiàn)，Linc00313在甲狀腺癌中過表達，通過結(jié)合無根狀同源異型盒-4(aristaless-like homeobox 4, ALX4)啟動子區(qū)域，并募集DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNA methyltransferase 1, DNMT1)和DNMT3B促進ALX4啟動子區(qū)域的甲基化并抑制其表達，激活A(yù)KT信號通路，促進PTC細胞的增殖、遷移、侵襲和EMT。甲基轉(zhuǎn)移酶富集的lncRNA跨膜通道樣蛋白6與絲氨酸/蘇氨酸激酶4(serine/threonine kinase 4，STK4)啟動子區(qū)域結(jié)合，通過促進STK4甲基化并降低巨噬細胞刺激蛋白受體1和巨大腫瘤抑制激酶1/2的總蛋白水平來抑制STK4，進而通過Hippo通路促進甲狀腺癌細胞增殖，抑制凋亡和自噬[44]。

LncRNA的異常表達可能與DNA或RNA甲基化有關(guān)。Li等[45]運用TCGA數(shù)據(jù)庫進行了PTC的甲基化和轉(zhuǎn)錄組的綜合分析，鑒定了與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)的483個甲基化驅(qū)動的lncRNA，運用隨機生存森林分析和COX多因素分析，構(gòu)建了基于lncRNA表觀遺傳調(diào)控的預(yù)后模型，該模型可以預(yù)測甲狀腺癌患者生存期的獨立危險因素。Gou等[46]發(fā)現(xiàn)lncRNA AB074169(lncAB)啟動子區(qū)CpG島高度甲基化導致其在PTC細胞中表達降低，通過抑制KH型剪切調(diào)控蛋白增加周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A的表達，降低細胞周期蛋白依賴性激酶2表達，在PTC發(fā)生過程中發(fā)揮著腫瘤抑制因子的作用。

2.6 其他

LncRNA可能干預(yù)miRNA前體剪切加工為成熟miRNA的過程。三基序蛋白29(tripartite motif containing 29，TRIM29)結(jié)合lncRNA細胞骨架調(diào)節(jié)RNA(cytoskeleton regulator RNA，CYTOR)啟動子區(qū)域促進其表達，通過失活核糖核酸內(nèi)切酶，抑制前體miR-873切割為成熟的miR-873-5p和miR-873-3p，影響纖連蛋白1 mRNA的穩(wěn)定性，進而促進PTC細胞的遷移和侵襲[47]。

3 總結(jié)

LncRNA在PTC中的作用及其機制在近幾年的研究中取得較多的成果，一些lncRNA被認為是PTC潛在的診斷和治療的分子標志物。但是，也有部分lncRNA在PTC中的表達水平和作用機制存在爭議，需要更大的樣本量和深入的機制研究來解決其不一致性。此外，近幾年ceRNA的研究熱度較高，而例如DNA甲基化、lncRNA與mRNA和蛋白的相互作用、lncRNA的編碼功能等其他作用機制也值得進一步地深入探索。LncRNA能否作為新的診斷標志物或治療靶標進入臨床應(yīng)用，還需要大量的科學研究。