曹學(xué)全，陳麗麗，范廣民，蔡小波，阮正英，盧洪勝，楊朝暉

（臺州市中心醫(yī)院（臺州學(xué)院附屬醫(yī)院），浙江 臺州 318000）

甲狀腺乳頭狀癌 （Papillary thyroid carcinoma，PTC）是最常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，占所有甲狀腺癌的80%-85%[1]。前B細(xì)胞白血病同源盒基因 3（Pre-B-cell leukemia homeobox 3，PBX3）屬于PBX家族成員。研究表明，PBX3在喉鱗癌[2]、宮頸癌等多種實(shí)體瘤中高表達(dá)，且其表達(dá)水平與腫瘤的病理分級、臨床分期等有關(guān)，腫瘤惡性程度越高，PBX3的表達(dá)越高[3]。最近的一項(xiàng)研究顯示，PBX3是結(jié)直腸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）網(wǎng)絡(luò)的一個重要調(diào)節(jié)蛋白，有望成為新的預(yù)后預(yù)測因子[4]。在許多腫瘤的進(jìn)展中，腫瘤轉(zhuǎn)移往往與EMT發(fā)生及上游基因的調(diào)控有關(guān)。E-cadherin是EMT重要的標(biāo)志性蛋白，屬于鈣粘附蛋白家族成員之一，其表達(dá)起著抑癌作用，能抑制腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其表達(dá)異?；蛉笔軌虼龠M(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲[5]。目前，PBX3和E-cadherin在PTC組織中的表達(dá)及相關(guān)性研究鮮見報道，本研究采用Western blot法檢測PTC和癌旁組織中PBX3、E-cadherin蛋白表達(dá)的差異，并分析表達(dá)的臨床意義及兩者的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017年1月-2018年1月在本院行手術(shù)切除的PTC標(biāo)本60例（PTC組），術(shù)后病理診斷結(jié)果為PTC。所有患者均具有完整的臨床和病理資料，且術(shù)前未接受放療、化療及生物學(xué)治療。同時選取同組癌旁組織（距離腫瘤≥2cm）60例作為對照（癌旁組），經(jīng)病理診斷為60例癌旁組織均為正常甲狀腺組織。收集新鮮的癌和癌旁組織標(biāo)本，離體后20分鐘內(nèi)放入-80℃低溫冰箱保存用于Western blot檢測PBX3和E-cadherin蛋白的表達(dá)。根據(jù)有無包膜侵犯、有無淋巴結(jié)侵犯，以及TNM分期分組，分為侵犯組和無侵犯組；轉(zhuǎn)移組和無轉(zhuǎn)移組，以及TNMⅠ-Ⅱ期組和TNMⅢ-Ⅳ期組，不同分組方式的兩組間一般資料（年齡、性別及腫瘤長徑）比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。詳見表1。

表1 三對組別的一般資料比較

1.2 方法

1.2.1 試劑 T-PER組織總蛋白提取試劑購自Thermo Fisher公司，PBX3兔抗人多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，E-cadherin鼠抗人單克隆抗體購自英國Abcam公司。辣根過氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗兔及羊抗鼠二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 Western blot 取約 25mg組織加入 500μL T-PER組織總蛋白提取液 （含1%PMSF）提取蛋白質(zhì)，在冰上充分碾磨，10000g離心5分鐘，收集上清液。BCA法檢測蛋白濃度，取30μg總蛋白進(jìn)行電泳。SDS-PAGE凝膠進(jìn)行蛋白分離，濕轉(zhuǎn)法將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，用5%牛血清白蛋白（BSA）封閉 1.5 小時， 加一抗 PBX3（1:500）、E-cadherin（1:1000）和 GAPDH（1:1000）孵育過夜。 HRP 標(biāo)記的二抗室溫孵育1.5小時，用化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯色，進(jìn)行X射線曝光顯影，使用軟件ImageProplus 6.0分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參。

1.3 觀察指標(biāo) （1）探討PTC組織、癌旁組織以及PTC患者包膜侵犯組和未侵犯組、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無轉(zhuǎn)移組、TNMⅠ-Ⅱ期組和TNMⅢ-Ⅳ期組PBX3和E-cadherin蛋白的表達(dá)水平，比較兩組蛋白表達(dá)水平差異；（2）PTC患者中PBX3和E-cadherin蛋白表達(dá)的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以（±s）表示，采用 t檢驗(yàn)；計數(shù)資料以百分率表示，采用χ2檢驗(yàn)。蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 PTC組和癌旁組PBX3、E-cadherin蛋白表達(dá)水平比較 PTC組中PBX3蛋白相對表達(dá)量高于癌旁組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=13.868，P<0.01）。 PTC中E-cadherin相對表達(dá)量低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=29.690，P<0.01）。 詳見表 2。

表2 兩組PBX3、E-cadherin蛋白相對表達(dá)量的比較（±s）

表2 兩組PBX3、E-cadherin蛋白相對表達(dá)量的比較（±s）

與癌旁組比較**P<0.01

組別 n PBX3 E-cadherin PTC 組 60 1.53±0.26** 0.45±0.03**癌旁組 60 0.83±0.04 1.02±0.13

2.2 不同組間PBX3、E-cadherin蛋白的表達(dá) 根據(jù)是否侵犯包膜分組，侵犯組PBX3相對表達(dá)量高于無侵犯組，E-cadherin相對表達(dá)量低于無侵犯組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）；根據(jù)有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移進(jìn)行分組，轉(zhuǎn)移組PBX3相對表達(dá)量高于無轉(zhuǎn)移組，E-cadherin相對表達(dá)量低于無轉(zhuǎn)移組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）；根據(jù)TNM分期進(jìn)行分組，TNMⅢ-Ⅳ期PBX3相對表達(dá)量高于TNMⅠ-Ⅱ期組，E-cadherin相對表達(dá)量低于TNMⅠ-Ⅱ期組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。 詳見表3。

表3 不同分組方式兩組間PBX3、E-cadherin蛋白的相對表達(dá)量（±s）

表3 不同分組方式兩組間PBX3、E-cadherin蛋白的相對表達(dá)量（±s）

與無侵犯組比較#P<0.05，##P<0.01；與無轉(zhuǎn)移組比較△P<0.05，△△P<0.01；與 TNMⅢ-Ⅳ期組比較▲P<0.05，▲▲P<0.01

組別 n PBX3 E-cadherin侵犯組 27 1.76±0.45# 0.46±0.03##無侵犯組 33 1.52±0.28 0.50±0.05轉(zhuǎn)移組 40 1.74±0.41△ 0.44±0.03△△無轉(zhuǎn)移組 20 1.48±0.23 0.49±0.05 TNMⅠ-Ⅱ期組 46 1.47±0.12▲ 0.51±0.06▲▲TNMⅢ-Ⅳ期組 14 1.73±0.53 0.45±0.03

2.3 PTC組織中PBX3與E-cadherin蛋白表達(dá)的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析顯示，PTC組織中PBX3蛋白相對表達(dá)量為 1.5324±0.2643，E-cadherin蛋白相對表達(dá)量為 0.4472±0.0263，PBX3、E-cadherin蛋白表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.396，P＜0.05）。

3 討論

PBX3屬于PBX家族成員之一，作為細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子在哺乳動物細(xì)胞發(fā)育、進(jìn)化過程中發(fā)揮重要作用[3]。據(jù)報道，PBX3在許多實(shí)體瘤以及一些血液系統(tǒng)惡性腫瘤中過表達(dá)，且促進(jìn)細(xì)胞存活、侵襲和增殖[6-7]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PTC組織中PBX3蛋白表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，提示PBX3蛋白表達(dá)上調(diào)在PTC的發(fā)生中起促癌作用。同時研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，PBX3表達(dá)與PTC的包膜侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期密切相關(guān)，提示PBX3蛋白表達(dá)水平升高在PTC的發(fā)生、發(fā)展過程中起促進(jìn)作用。國內(nèi)學(xué)者在宮頸癌研究中也發(fā)現(xiàn)，PBX3蛋白在宮頸癌組織中的表達(dá)水平升高，且表達(dá)水平與宮頸癌患者的臨床特征顯著相關(guān)，在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后評估中有著重要的臨床意義[8]。分析其機(jī)制，可能與PBX3特異性結(jié)合靶RNA的編碼區(qū)、激活RNA的翻譯、并在轉(zhuǎn)錄后發(fā)揮促進(jìn)作用有關(guān)。PBX3對血管生成有明顯的促進(jìn)作用，進(jìn)而參與癌細(xì)胞增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移[9]。新的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，PBX3對p21轉(zhuǎn)錄的調(diào)控是通過p21的上游調(diào)節(jié)因子，即腫瘤抑制因子p53來實(shí)現(xiàn)的，表明PBX3通過調(diào)節(jié)p53/p21軸來調(diào)節(jié)腫瘤生長，參與腫瘤的進(jìn)展[10]。

E-cadherin是鈣黏蛋白家族的成員之一，是細(xì)胞間粘附連接的主要組成部分，該連接可維持細(xì)胞-細(xì)胞間粘附、細(xì)胞極性和上皮組織穩(wěn)定性，從而抑制細(xì)胞運(yùn)動和惡性腫瘤進(jìn)展[11-12]。Niknami等[13]發(fā)現(xiàn)，Vimentin的表達(dá)隨著腫瘤分級、病理分期和區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的增加而增加，在伴有血管侵犯的癌中，波形蛋白值較高。相反，E-cadherin表達(dá)隨著腫瘤分級、病理分期和TNM分期的增加而降低。本研究結(jié)果顯示，E-cadherin在癌旁組織中的表達(dá)高于PTC組織，隨著PTC伴有包膜侵犯、淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移和較晚的臨床分期，E-cadherin表達(dá)水平進(jìn)一步下調(diào)，其可能機(jī)制與上游基因調(diào)控后（包括轉(zhuǎn)錄抑制和甲基化等），上皮細(xì)胞表面黏附分子表達(dá)水平改變（包括E-cadherin表達(dá)下降或缺失等），導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)異常、失去極性及黏附性，進(jìn)而獲得間質(zhì)細(xì)胞的某些特征有關(guān)[14]。

本研究還探討了PTC中PBX3與EMT標(biāo)志物E-cadherin的關(guān)系，Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，PTC中PBX3和E-cadherin蛋白表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。有研究顯示，胃癌細(xì)胞中PBX3過表達(dá)降低了上皮細(xì)胞的生物標(biāo)記物E-cadherin的表達(dá)，增加了間充質(zhì)細(xì)胞的生物標(biāo)記物N-cadherin和Vimentin的表達(dá)。結(jié)果表明，PBX3的過度表達(dá)通過誘導(dǎo)EMT促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[15]。綜合以上文獻(xiàn)報道及本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推測，PBX3高表達(dá)可能通過抑制E-cadherin的表達(dá)介導(dǎo)EMT，進(jìn)而促進(jìn)PTC發(fā)生包膜侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。