郝 穎 趙艷麗 閆素梅 郭曉宇 郭詠梅 齊敬宇

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，內(nèi)蒙古自治區(qū)高校動物營養(yǎng)與飼料科學重點實驗室，呼和浩特 010018)

乳脂肪是構(gòu)成牛奶的重要組成成分之一，也是衡量乳品質(zhì)的關(guān)鍵指標，其含量與組成是奶業(yè)核心競爭力重要標志。在泌乳期間的奶牛，尤其是高產(chǎn)奶牛，由于合成和分泌大量的乳汁，乳腺組織代謝增強，對能量和氧的需求與利用增加，奶牛乳腺上皮細胞(BMECs)內(nèi)呼吸作用加強，導致奶牛體內(nèi)產(chǎn)生過多的活性氧(ROS)，當奶牛體內(nèi)產(chǎn)生的大量ROS與機體抗氧化防御系統(tǒng)的清除能力不平衡時，會導致乳腺組織發(fā)生氧化應(yīng)激[1-2]。乳腺組織是泌乳動物體內(nèi)代謝最強的組織之一，BMECs是乳腺組織的主要實質(zhì)細胞，是合成和分泌乳汁中乳脂和乳蛋白的主要場所。氧化應(yīng)激的發(fā)生會對乳腺組織造成損傷，使其易遭受病原微生物的感染，易患乳房炎，并且會降低乳脂和乳蛋白的合成，影響乳產(chǎn)量和乳品質(zhì)[3]，使奶牛的淘汰率增加，對奶業(yè)的健康發(fā)展造成重大損失。因此，緩解BMECs氧化應(yīng)激的發(fā)生，進而改善乳腺健康和保證乳品質(zhì)對奶業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展具有非常重要的意義。本課題組前期研究得出，飼糧添加高于推薦劑量的維生素A可提高奶?？寡趸δ芎彤a(chǎn)乳性能[4]，體外研究也發(fā)現(xiàn)，維生素A的添加可促進BMECs內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶1(GPx1)、谷胱甘肽過氧化物酶4(GPx4)和硫氧還蛋白還原酶1(TrxR1)的活性及其基因表達，促進乳脂合成相關(guān)基因的表達，對氧化損傷細胞具有緩解作用[4-6]，但其機制尚不清楚。過氧化氫(H2O2)是屬于ROS的一種體內(nèi)代謝產(chǎn)物，可消耗抗氧化物質(zhì)使機體抗氧化能力降低，對細胞有一定的毒害作用，其極容易穿過細胞膜，在細胞內(nèi)與Fe2+反應(yīng)生成高活性的自由基。Jin等[7]研究發(fā)現(xiàn)，過量H2O2可引起B(yǎng)MECs氧化損傷，降低細胞抗氧化能力。由于H2O2性質(zhì)較穩(wěn)定并容易獲得，所以目前很多研究都將其作為氧化損傷模型的誘導劑[8]。鑒于此，本試驗以H2O2為誘導劑，研究不同濃度的維生素A對H2O2誘導的BMECs內(nèi)乳脂合成的影響，為合理調(diào)控乳腺內(nèi)氧化還原平衡，進而改善乳腺健康、提升原料乳質(zhì)量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

本試驗采用單因子完全隨機試驗設(shè)計，將第3代BMECs隨機分成對照組(CON組)、H2O2損傷組(H2O2組)和7個維生素A預保護組，每個組6個重復。其中，CON組BMECs不進行維生素A與H2O2處理，用生長培養(yǎng)基于5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)30 h；H2O2組BMECs進行H2O2損傷處理，即用CON組培養(yǎng)基于5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，再加入H2O2繼續(xù)培養(yǎng)6 h；7個維生素A預保護組BMECs預添加維生素A后進行H2O2損傷處理，即在CON組培養(yǎng)基中添加不同濃度維生素A后于5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，再加入H2O2繼續(xù)培養(yǎng)6 h，維生素A濃度分別為0.05(0.05VAH組)、0.10(0.1VAH組)、0.20(0.2VAH組)、0.50(0.5VAH組)、1.00(1VAH組)、2.00(2VAH組)和4.00 μg/mL(4VAH組)。培養(yǎng)結(jié)束后收集培養(yǎng)液和細胞用于分析測定。維生素A濃度以及H2O2濃度與處理時間依據(jù)本課題組前期研究結(jié)果[4,7]設(shè)定，H2O2濃度與處理時間分別為800 μmol/L和6 h。

1.2 試劑配制

生長培養(yǎng)基：在DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清(FBS，Gibco公司，美國)、0.5%胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒鈉(ITS，Gibco公司，美國)、10 ng/mL表皮生長因子(EGF，Sigma公司，美國)、2.5 μg/mL兩性霉素(Sigma公司，美國)、2%雙抗(Gibco公司，美國)、1 μg/mL氫化可的松(Sigma公司，美國)。

維生素A貯備液：稱取100 mg的視黃酸(RA，Sigma公司，美國)溶解于5 mL的二甲基亞砜(DMSO，Amresco公司，美國)溶液中，配制成20 mg/mL的維生素A原液，然后再用DMSO溶液將維生素A原液稀釋成0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00和4.00 mg/mL的維生素A貯備液，用0.22 μm過濾器過濾，避光保存。

H2O2工作液：3%的H2O2(Sigma公司，美國)濃度約為0.88 mol/L，用超純水將0.88 mol/L的H2O2原液稀釋成800 mmol/L的H2O2貯備液，最后用不加FBS的生長培養(yǎng)基將H2O2貯備液配制成880 μmol/L的工作液。

1.3 BMECs的培養(yǎng)

BMECs原代培養(yǎng)采用膠原酶消化法，操作方法參考Sheng等[9]的方法進行。將從屠宰場采回的健康奶牛乳腺去除組織表層，再剪成約1 cm3大小的組織塊，用3×雙抗磷酸鹽緩沖溶液(PBS，HyClone公司，美國)清洗。在超凈臺里用PBS、75%酒精分別清洗后從乳腺內(nèi)部剪取腺泡豐富的部位剪碎至糊狀，再加入等體積的0.5%膠原酶Ⅱ(Gibco公司，美國)，37 ℃消化1 h。最后用80目濾網(wǎng)過濾，濾液262×g離心5 min后棄上清，用PBS清洗細胞，在相同條件下離心3 min，棄上清，加入生長培養(yǎng)基懸浮細胞并接種于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。當細胞貼壁度達到80%～90%時，使用0.05%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(Gibco公司，美國)進行細胞純化并傳代。原代細胞含有少量的成纖維細胞，但在純化與傳代培養(yǎng)過程中，成纖維細胞很少被傳入第3代細胞中，詳見圖1。

圖1 原代(a)和第3代(b)奶牛乳腺上皮細胞的顯微鏡圖像Fig.1 Microscopic images of primary (a)and F3 (b) bovine mammary epithelial cells (100×)

1.4 測定指標與方法

1.4.1 細胞活力

BMECs的細胞活力采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法測定，使用相對增殖率(RGR)表示。將細胞懸液接種到96孔細胞板內(nèi)，按試驗設(shè)計處理后加入20 μL的CCK-8溶液(北京碧云天生物技術(shù)研究所)，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，使用全自動酶標儀檢測各孔450 nm波長處的吸光度值(OD450 nm)。

RGR(%)=(試驗組OD450 nm/CON組OD450 nm)×100。

1.4.2 甘油三酯(TG)含量、抗氧化指標以及乳脂合成相關(guān)酶活性

按照試驗設(shè)計培養(yǎng)結(jié)束后棄上清，用PBS清洗2次，每孔加入200 μL裂解液混勻后室溫靜置10 min，收集裂解液于1.5 mL無酶無菌離心管中，70 ℃加熱10 min，室溫下622×g離心5 min后取上層清液進行TG含量測定。TG含量使用酶法，按照試劑盒說明書(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)進行測定。

細胞培養(yǎng)液總抗氧化能力(T-AOC)采用鉬酸銨顯色法測定，總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性采用黃嘌呤氧化酶法測定，過氧化氫酶(CAT)活性采用比色法測定，谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)活性采用二硫代二硝基苯甲酸法測定，試劑盒購于南京建成生物工程研究所，具體測定方法按照試劑盒說明書進行。細胞裂解液中ROS和TrxR1以及乳脂合成相關(guān)酶——脂肪酸合成酶(FASN)、乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、脂酰輔酶A去飽和酶(SCD)和脂蛋白酯酶(LPL)活性采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法測定，試劑盒購自美國R&D公司，具體測定方法按照試劑盒說明書進行。細胞裂解液中GPx和TrxR1活性換算為蛋白質(zhì)基礎(chǔ)，蛋白質(zhì)含量采用二喹啉甲酸法測定。

1.4.3 細胞內(nèi)抗氧化和乳脂合成相關(guān)基因的相對表達量

表1 引物序列及參數(shù)Table 1 Primer sequences and parameters

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)利用SAS 9.0軟件的ANOVA程序進行單因素方差分析，采用Duncan氏法進行多重比較。統(tǒng)計結(jié)果以P≤0.05表示組間差異顯著，P>0.05表示組間差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 維生素A對H2O2誘導的BMECs內(nèi)RGR、抗氧化指標和ROS活性的影響

由表2可知，H2O2組的RGR顯著低于CON組(P≤0.05)；與H2O2組相比，0.1VAH～4VAH組的RGR顯著增加(P≤0.05)，以1VAH組最高。與CON組相比，H2O2組的GPx、T-AOC、T-SOD、CAT、TrxR活性顯著降低(P≤0.05)，但ROS活性顯著增加(P≤0.05)。與H2O2組相比，0.2VAH～4VAH組的GPx活性顯著升高(P≤0.05)，以1VAH組最高；0.2VAH～2VAH組的T-AOC顯著增加(P≤0.05)，其他維生素A預保護組變化不顯著(P>0.05)；1VAH～4VAH組的TrxR活性顯著增加(P≤0.05)，其他維生素A預保護組變化不顯著(P>0.05)；1VAH組的T-SOD和CAT活性顯著增加(P≤0.05)，但ROS活性顯著下降(P≤0.05)。

表2 維生素A對H2O2誘導的BMECs內(nèi)RGR、抗氧化指標和ROS活性的影響Table 2 Effects of VA on RGR,antioxidant indexes and ROS activity of BMECs induced by H2O2

續(xù)表2項目Items組別GroupsCONH2O20.05VAH0.1VAH0.2VAH0.5VAH1VAH2VAH4VAH均值標準誤SEMP值P-value硫氧還蛋白酶TrxR1/(U/mgprot)4.65a3.29c3.37c3.40c3.90bc3.78bc4.11ab4.11ab4.08ab0.1590.002活性氧ROS/(U/mL)67.20c78.40a70.20bc77.70a77.40a75.33ab66.73c76.13ab69.73bc1.8420.003

2.2 維生素A對H2O2誘導的BMECs內(nèi)TG含量和乳脂合成相關(guān)酶活性的影響

由表3可知，H2O2組的TG含量顯著低于CON組(P≤0.05)。與H2O2組相比，1VAH組的TG含量顯著升高(P≤0.05)。與CON組相比，H2O2組的ACC、LPL和SCD活性顯著降低(P≤0.05)，F(xiàn)ASN活性無顯著變化(P>0.05)。與H2O2組相比，0.5VAH和1VAH組的FASN活性顯著升高(P≤0.05)；0.1VAH～4VAH組的ACC活性顯著升高(P≤0.05)；0.1VAH、1VAH、2VAH和4VAH組的LPL活性顯著升高(P≤0.05)；0.2VAH、1VAH、2VAH和4VAH組的SCD活性顯著升高(P≤0.05)。

表3 維生素A對H2O2誘導的BMECs內(nèi)TG含量和乳脂合成相關(guān)酶活性的影響Table 3 Effects of VA on TG content and enzyme activities related to milk fat synthesis of BMECs induced by H2O2

2.3 維生素A對H2O2誘導的BMECs內(nèi)抗氧化和乳脂合成相關(guān)基因表達的影響

由表4可知，與CON組相比，H2O2組的GPx1、GPx4、TrxR1、FASN、ACC和PPARγ相對表達量顯著降低(P≤0.05)。與H2O2組相比，0.05VAH～4VAH組的GPx1、SCD和PPARγ相對表達量顯著升高(P≤0.05)，GPx1相對表達量以1VAH組最高；1VAH～4VAH組的GPx4相對表達量顯著升高(P≤0.05)，以4VAH組最高；0.1VAH～4VAH組的TrxR1相對表達量顯著升高(P≤0.05)；0.2VAH～4VAH組的FASN和LPL相對表達量顯著升高(P≤0.05)，F(xiàn)ASN相對表達量以1VAH組最高；0.1VAH和0.2VAH組的ACC相對表達量顯著升高(P≤0.05)；0.05VAH～2VAH組的SREBP1相對表達量顯著升高(P≤0.05)；0.05VAH～0.5VAH組的FABP3相對表達量顯著升高(P≤0.05)。

表4 維生素A對H2O2誘導的BMECs內(nèi)抗氧化和乳脂合成相關(guān)基因表達的影響Table 4 Effects of VA on expression of genes involved in antioxidation and milk fat synthesis in BMECs induced by H2O2

3 討 論

動物機體在正常的生理代謝情況下會產(chǎn)生具有氧化性的自由基，例如ROS和H2O2等，但ROS過量產(chǎn)生并積累可對動物組織和細胞產(chǎn)生實質(zhì)性損害，導致細胞氧化應(yīng)激[10-11]?？寡趸窯Px、TrxR、T-SOD和CAT在催化還原H2O2和一些脂溶性過氧化物方面發(fā)揮了重要的作用，可以清除組織細胞由氧化損傷而產(chǎn)生的自由基[1,12]。在人體肝細胞及BMECs上的研究表明，H2O2損傷細胞后，細胞內(nèi)GPx1、CAT和超氧化物歧化酶(SOD)的活性顯著降低，而ROS活性顯著升高[5,11]。本課題組前期研究得出，奶牛飼糧添加高于推薦劑量的維生素A(220 IU/kg飼糧)可以提高血清抗氧化酶GPx、TrxR、T-SOD、CAT等的活性，降低ROS活性，減緩機體及細胞氧化損傷[5]，體外研究也得出了相似的結(jié)果[7]。本試驗從體外進一步驗證了H2O2會導致細胞活力和抗氧化功能的降低，抗氧化酶活性及抗氧化相關(guān)基因GPx1、GPx4和TrxR表達的下調(diào)，ROS活性顯著增加；采用0.20～2.00 μg/mL維生素A進行預保護會減緩細胞氧化損傷，抑制ROS活性的增加，尤以1.00 μg/mL的維生素A效果最好。

TG含量約占乳脂總量的98%，其含量高低可以反映乳脂的合成情況。TG主要在哺乳動物的乳腺組織中積累形成脂質(zhì)滴，其主要成分是脂肪酸[13]。乳中脂肪酸有2個來源途徑：一是中短鏈脂肪酸的從頭合成；二是從血液中吸收的長鏈脂肪酸。FASN和ACC是乳腺內(nèi)短鏈(C4～C8)和中鏈(C10～C14)以及一部分C16脂肪酸從頭合成的2個關(guān)鍵酶[13]，并且ACC也是牛乳脂合成的限速酶。LPL和FABP3參與BMECs內(nèi)多種組織脂肪酸的攝取和轉(zhuǎn)運，LPL將血液中攝取的乳糜微粒和TG水解成甘油和分子質(zhì)量較小的脂肪酸，然后FABP3將脂肪酸從細胞膜運送到TG和磷脂合成與氧化的位點上[14]。SCD在乳脂合成過程中具有脫氫去飽和作用，F(xiàn)ABP3主要作用是為SCD提供脫氫底物[14]。有研究表明，用氧化誘導劑作用BMECs后，細胞內(nèi)抗氧化酶活性降低，導致細胞氧化損傷，進而引起乳脂合成相關(guān)酶活性降低[3,13]，抑制乳脂的合成[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，添加維生素A預保護后可減緩H2O2引起的細胞內(nèi)TG含量、與脂肪酸從頭合成相關(guān)基因FASN和ACACA的表達和其對應(yīng)酶活性及其與脂肪酸攝取相關(guān)酶LPL和SCD活性的下降。

PPARγ和SREBP1是脂肪合成中重要的轉(zhuǎn)錄因子和核受體，可以調(diào)節(jié)乳腺內(nèi)FASN、ACACA、SCD、LPL和FABP3等靶基因的表達。奶山羊乳腺細胞中敲除PPARγ會導致上述基因的表達量顯著下降[16]，表明PPARγ調(diào)節(jié)乳腺細胞中脂肪酸的從頭合成和去飽和過程。Wang等[13]研究指出，脂多糖(LPS)誘導的BMECs會使SREBP1活性及其基因相對表達量下降，導致TG合成和分泌減少。H2O2誘導損傷神經(jīng)元細胞后，使PPARγ磷酸化并使其失活[17]，而PPARγ激活可以抑制ROS和脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)生，提高SOD活性和谷胱甘肽(GSH)含量，減少細胞氧化損傷[18]。本課題組前期研究指出，在BMECs中添加PPARγ抑制劑GW9662后，細胞內(nèi)PPARγ和TrxR的相對表達量顯著降低[19]。過氧化酶體增殖物激活受體(PPAR)與配體結(jié)合激活后能和類維生素A的X受體(RXR)形成異源二聚體，然后和靶基因上的PPAR反應(yīng)元件相互作用調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達，而維生素A的代謝產(chǎn)物9-順式維甲酸(9-cisRA)是RXR的有效配體[20]。本研究結(jié)果得出，添加維生素A預保護逆轉(zhuǎn)了H2O2誘導引起的BMECs中PPARγ、FASN、ACC和LPL相對表達量的降低，并上調(diào)了SREBP1、SCD和FABP3的表達，提示維生素A可能通過抑制轉(zhuǎn)錄因子PPARγ和SREBP1表達的下降，促進脂肪酸從頭合成和脂肪酸攝取來緩解氧化損傷引起的細胞內(nèi)TG合成的下降；但維生素A在減緩氧化損傷的細胞內(nèi)TG合成降低的同時，是否對乳脂肪中各種脂肪酸的組成產(chǎn)生影響尚需在后續(xù)的研究中進一步探討。

大鼠發(fā)生脂肪肝炎后，脂肪組織內(nèi)TrxR、GPx的活性與TrxR的基因表達量顯著降低，氧化應(yīng)激加劇，引起肝組織中游離脂肪酸含量增加，PPARγ的基因表達量顯著減少[21]。在小鼠上的研究發(fā)現(xiàn)，增加血清GPx活性可以促進PPARγ活化，減輕動脈炎癥并降低體內(nèi)氧化應(yīng)激水平[22]。本課題組前期研究指出，沉默BMECs中GPx基因可降低PPARγ基因的表達[20]。上述結(jié)果提示維生素A緩解H2O2引起的BMECs內(nèi)乳脂合成的降低可能是通過增強TrxR、GPx活性引起PPARγ的活性升高，因此有必要利用基因沉默或過表達技術(shù)從該領(lǐng)域繼續(xù)進行深入研究。本試驗從體外研究了維生素A對氧化損傷后BMECs內(nèi)乳脂合成減少的緩解效果，并得出1.00 μg/mL維生素A的效果較好。在實際生產(chǎn)中，飼糧中維生素A的添加量具體為多少可以對乳腺組織氧化損傷具有較好的減緩效果，還需要在體內(nèi)進一步驗證。

4 結(jié) 論

維生素A對H2O2誘導的氧化損傷引起的BMECs抗氧化能力的降低，乳脂合成、轉(zhuǎn)錄因子PPARγ和SREBP1以及從頭合成基因FASN、ACC與脂肪酸攝取基因LPL、SCD和FABP3表達的下降具有減緩作用，并呈劑量依賴性，以0.20～2.00 μg/mL維生素A的效果較好，尤以1.00 μg/mL維生素A的效果最好。