費(fèi)學(xué)寧，鄭元杰，谷迎春，李光旻，趙洪賓，張寶蓮

天津城建大學(xué)理學(xué)院，天津 300384

引 言

熒光探針生物識(shí)別技術(shù)憑借其可視性影像表達(dá)及無(wú)創(chuàng)傷檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，已成為重大疾病早期識(shí)別和組織成像研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。近年來(lái)熒光成像技術(shù)在癌癥靶向識(shí)別研究方面取得了長(zhǎng)足進(jìn)展。葉酸受體(FR)介導(dǎo)的生物熒光探針識(shí)別研究持續(xù)受到關(guān)注。葉酸受體是癌細(xì)胞表面過(guò)量表達(dá)的標(biāo)志物，利用葉酸受體與葉酸的特異性結(jié)合關(guān)系，可介導(dǎo)葉酸及熒光偶聯(lián)物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部且不被放入溶酶體被破壞； 葉酸受體作為靶向標(biāo)志物在癌癥識(shí)別研究中具有獨(dú)特地位。癌癥和炎癥巨噬細(xì)胞表面過(guò)量表達(dá)的兩種葉酸受體亞型FAα和FAβ具有高度同源性，亞型的存在使得熒光探針識(shí)別癌癥和炎癥巨噬細(xì)胞存在著結(jié)構(gòu)性缺陷，F(xiàn)Aα和FAβ分別由257和255個(gè)氨基酸組成，區(qū)別在于三個(gè)末端未翻譯區(qū)，用來(lái)包結(jié)葉酸分子的三角空腔的三種氨基酸不同。如圖1所示，F(xiàn)Aα和FAβ存在的手性特性區(qū)別，兩種葉酸受體亞型的三角空腔構(gòu)成兩個(gè)不同手性特征的“手性空間”，為設(shè)計(jì)更加客觀識(shí)別癌細(xì)胞的“熒光-手性”靶向識(shí)別探針，實(shí)現(xiàn)癌癥和炎癥巨噬細(xì)胞的區(qū)分提供了可能性[1]。

1 生物熒光探針研究進(jìn)展

1.1 有機(jī)熒光染料探針

有機(jī)熒光染料探針在生物標(biāo)記過(guò)程中，具有熒光量子產(chǎn)率高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。文獻(xiàn)報(bào)道較多的主要有以下四類探針, 如表1所示。

表1 有機(jī)熒光探針?lè)肿有揎棙?gòu)效關(guān)系Table 1 Molecular structure modification of organic dyes probes

含有長(zhǎng)波長(zhǎng)熒光發(fā)色團(tuán)的熒光分子具有對(duì)客體無(wú)損成像、生物體內(nèi)自發(fā)熒光且背景干擾低[2]等優(yōu)點(diǎn)。Koide等[2]將羅丹明B 10位的氧原子用硅原子取代，雜原子的電負(fù)性改變了雜環(huán)熒光染料分子中電子云密度分布，可使其熒光發(fā)射波長(zhǎng)紅移到650 nm以上，熒光量子產(chǎn)率為0.39； 將羅丹明B的氧原子替換為砜基，產(chǎn)物的熒光發(fā)射波長(zhǎng)可達(dá)700 nm以上，量子產(chǎn)率高于0.4，對(duì)細(xì)胞具有良好的兼容性。

研究表明, 近紅外二區(qū)(NIR-Ⅱ, 1 000～1 700 nm)熒光光譜成像可極大減弱生物組織對(duì)光的吸收、散射現(xiàn)象, 可顯著提升光譜成像效果，在重大疾病診斷與治療等領(lǐng)域表現(xiàn)出優(yōu)異的特性, 具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。由供電子基團(tuán)(D)和受電子基團(tuán)(A)構(gòu)筑的D-A-D熒光分子結(jié)構(gòu)，可大大的提高染料分子量子產(chǎn)率。苯并雙噻二唑(BBTD)作為一種強(qiáng)吸電子基團(tuán)具有高光穩(wěn)定性和高熒光效率(熒光發(fā)射最高峰可達(dá)1 000 nm以上)被廣泛應(yīng)用[3]。引入電子屏蔽基團(tuán)(S)設(shè)計(jì)的S-D-A-D-S型熒光探針結(jié)構(gòu)，可減少探針與其他分子的相互作用、碰撞猝滅，使分子熒光增強(qiáng)，量子產(chǎn)率可達(dá) 0.3以上。研究表明，處于高濃度或聚集狀態(tài)的熒光分子也能夠發(fā)射強(qiáng)熒光。四苯基乙烯是典型的具有上述聚集誘導(dǎo)發(fā)光(AIE)效應(yīng)特性的熒光分子。

1.2 無(wú)機(jī)量子點(diǎn)熒光探針

無(wú)機(jī)量子點(diǎn)(quantum dots, QDs)是另一類性能優(yōu)異的生物熒光探針，受光能激發(fā)產(chǎn)生熒光的生物標(biāo)記劑。包括第Ⅲ—Ⅴ或Ⅱ—Ⅵ族元素組成的如CdTe，CdSe和ZnS等無(wú)機(jī)金屬半導(dǎo)體量子點(diǎn)、碳量子點(diǎn)等。尺寸在1～10 nm之間[4], 與有機(jī)染料相比，量子點(diǎn)具有熒光量子產(chǎn)率高、激發(fā)光譜連續(xù)，熒光發(fā)射光譜窄，峰型對(duì)稱等優(yōu)點(diǎn)[4]。

2 生物熒光探針靶向修飾

熒光探針對(duì)癌細(xì)胞的特異性作用是實(shí)現(xiàn)癌癥細(xì)胞靶向識(shí)別的客觀要求。葉酸是維持細(xì)胞功能的基本物質(zhì)之一，葉酸憑借能與葉酸受體特異性結(jié)合的特點(diǎn)，在介導(dǎo)熒光探針靶向識(shí)別腫瘤研究中具有獨(dú)到的地位。

2.1 葉酸受體介導(dǎo)的腫瘤識(shí)別探針?lè)肿痈男匝芯?/h3>

常見(jiàn)于通過(guò)葉酸分子活性位點(diǎn)與熒光探針?lè)肿舆M(jìn)行偶聯(lián), 可賦予熒光分子的靶向性； 葉酸和多糖(殼聚糖、環(huán)糊精等)修飾熒光染料分子，可提高熒光靶向探針的生物相容性； 葉酸修飾量子點(diǎn)探針，檢測(cè)靈敏、量子產(chǎn)率高； 葉酸修飾熒光納米聚合物點(diǎn)，化學(xué)與熱力學(xué)穩(wěn)定性及生物相容性好。

癌癥和炎癥巨噬細(xì)胞表面過(guò)量表達(dá)的兩種葉酸受體亞型FAα和FAβ的高度同源性使得熒光染料探針在識(shí)別癌癥和炎癥巨噬細(xì)胞的過(guò)程中存在著結(jié)構(gòu)性缺陷?？茖W(xué)家重新審視腫瘤細(xì)胞的精細(xì)結(jié)構(gòu)指出，可依照葉酸受體的三維結(jié)構(gòu), 研究基于葉酸受體亞型介導(dǎo)的細(xì)胞靶向標(biāo)記物的信息應(yīng)答關(guān)系，設(shè)計(jì)特異性識(shí)別探針，有望提升識(shí)別效率。

2.2 葉酸受體的手性特征

葉酸受體有4種不同的亞型(FRα，F(xiàn)Rβ，F(xiàn)Rγ和FRδ)，前兩者因在癌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表面過(guò)量表達(dá)被密切關(guān)注。FRα主要在約90%癌細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)，與人類乳腺及口腔表皮樣癌細(xì)胞(KB)中的蛋白相同，分子量為28 256，由257個(gè)氨基酸組成； FRβ主要在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎炎癥部位巨噬細(xì)胞表面，胎盤(pán)和單核細(xì)胞中高表達(dá)，分子量為27 401，由255個(gè)氨基酸組成。葉酸受體亞型FRα和FRβ約有70%的同源性，主要區(qū)別位于三個(gè)末端未翻譯區(qū)，有三種不同種類的氨基酸形成一個(gè)用來(lái)包結(jié)葉酸分子的三角空腔； FRα為丙氨酸(Alanine)、纈氨酸(Valine)、谷氨酸(Glutamate)； FRβ為亮氨酸(Leucine)、甘氨酸(Glycine)、苯丙氨酸(Phenylalanine)； 如圖1所示： 葉酸受體的結(jié)構(gòu)性差異及結(jié)合葉酸的口袋作用關(guān)系。FRα和FRβ本身的結(jié)構(gòu)對(duì)不同的配體表現(xiàn)出立體特異性[5]。葉酸受體亞型存在的“手性空間”差異性為設(shè)計(jì)新型的基于亞型手性選擇性表達(dá)識(shí)別探針提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

圖1 葉酸受體結(jié)構(gòu)性差異及結(jié)合葉酸的口袋關(guān)系(a)，(b)： 葉酸受體正反兩面示意圖; (c)： 包結(jié)葉酸的三角空腔; (d)： 葉酸α，β亞型區(qū)別Fig.1 Structural differences of folate receptor and pocket relationship of folate binding(a), (b): The figure show the positive and negative sides of folate receptor;(c): The triangle cavity of folate inclusion; (d): The difference of folate α and β subtypes

2.3 手性熒光探針?lè)肿幼R(shí)別氨基酸

2.3.1 手性熒光探針?lè)肿幼R(shí)別氨基酸原理

現(xiàn)有氨基酸的識(shí)別法主要包括光譜法、電化學(xué)發(fā)光分析、色譜法和手性識(shí)別傳感器檢測(cè)法等。光譜分析法因其利用手性對(duì)映體本身不同旋光和圓二特征可快速識(shí)別手性化合物得到廣泛應(yīng)用[6]。其中最常用的對(duì)手性化合物的表征方法是利用圓二色性(CD)，對(duì)氨基酸的R、L兩種構(gòu)型發(fā)生電子躍遷過(guò)程中對(duì)圓偏振光吸收程度不同進(jìn)行區(qū)分，可在溶液狀態(tài)下測(cè)定，較接近其生理狀態(tài)[6]。手性光譜識(shí)別法的原理是基于手性對(duì)映異構(gòu)體和外界手性環(huán)境(如環(huán)糊精和多糖)之間發(fā)生氫鍵、疏水和靜電等非共價(jià)相互作用，形成非對(duì)映異構(gòu)體，或者手性選擇劑對(duì)手性對(duì)映體吸附效應(yīng)不同，引起圓二特征峰或熒光強(qiáng)度發(fā)生明顯變化，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)手性識(shí)別。

2.3.2 用于識(shí)別氨基酸的手性熒光探針?lè)肿釉O(shè)計(jì)

可用于手性識(shí)別氨基酸的分子有以下幾類： 基于聯(lián)萘酚不同位點(diǎn)進(jìn)行修飾的環(huán)狀分子，手性大環(huán)的特殊結(jié)構(gòu)與氨基酸作用，通過(guò)熒光增強(qiáng)能很好的區(qū)分α-氨基酸； 方酰胺因其獨(dú)特的四元環(huán)剛性結(jié)構(gòu)、較強(qiáng)的氫鍵給體屬性和兩個(gè)側(cè)鏈易于修飾的特點(diǎn)在手性識(shí)別領(lǐng)域成為研究熱點(diǎn)之一。在其分子上引入堿性的叔胺基團(tuán), 可與氨基酸顯酸性的羧基中和, 羧基上的質(zhì)子轉(zhuǎn)移到叔胺上形成鹽，兩個(gè)氫鍵位點(diǎn)被溶劑占據(jù)或與過(guò)量的氨基酸結(jié)合形成雙氫鍵而引起熒光強(qiáng)度的變化，可實(shí)現(xiàn)對(duì)氨基酸的手性識(shí)別； 在分子中同時(shí)引入兩個(gè)方酰胺片段, 可構(gòu)建一類具有4個(gè)氫鍵作用位點(diǎn)的口袋式探針?lè)肿?，通過(guò)與氨基酸作用引起熒光強(qiáng)度的改變從而達(dá)到識(shí)別的效果[7]。

近年來(lái)，由于手性量子點(diǎn)同時(shí)具有熒光和手性識(shí)別特性并能為測(cè)試提供手性環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)受到廣泛關(guān)注。

2.4 手性無(wú)機(jī)量子點(diǎn)

量子點(diǎn)連接L-半胱氨酸等手性配體即成為手性量子點(diǎn)，2007年，Gun’ko課題組合成了左旋/右旋-青霉胺穩(wěn)定的并具有鏡像對(duì)稱CD信號(hào)的CdS量子點(diǎn)被正式提出[8]，與未被修飾的量子點(diǎn)相比，量子產(chǎn)率明顯提升。手性有機(jī)分子與無(wú)機(jī)納米粒子的耦合實(shí)現(xiàn)了手性從分子尺度向納米尺度的跨越, 此外，某些蛋白質(zhì)和藥物只對(duì)一個(gè)對(duì)映體有活性，而具手性特性能為其標(biāo)記、測(cè)試提供不可多得的手性環(huán)境，也是目前納米科學(xué)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一[9]。

2.4.1 量子點(diǎn)手性產(chǎn)生的本質(zhì)和發(fā)光原理

Takuya Nakashima課題組[10]合成巰基封端的手性CdTe納米晶體，通過(guò)對(duì)圓二譜圖的分析，推測(cè)手性產(chǎn)生的本質(zhì)。CdSe量子點(diǎn)未在第一激子躍遷帶(400 nm以上)范圍內(nèi)出現(xiàn)CD信號(hào)，因此觀測(cè)到的CD信號(hào)不能歸因于核的第一激子躍遷。他們推測(cè)手性來(lái)源于包括手性封端分子在內(nèi)的表面殼層，巰基通過(guò)S原子配位Cd原子形成Cd-S配體單層，手性分子中硫醇電子直接躍遷到Cd，改變?cè)颖砻骐娮榆S遷引起手性變化。

圖2 巰基封端CdTe納米晶圓二譜圖Fig.2 Spectrogram of sulfhydryl terminated CdTe nanocrystals

Li等[11]通過(guò)研究手性半胱氨酸(Cysteine, Cys)與CdTe量子點(diǎn)作用機(jī)制探究手性產(chǎn)生的本質(zhì)，如圖3所示，量子點(diǎn)本身能產(chǎn)生圓二信號(hào)，當(dāng)手性Cys與呈四面體排布的CdTe量子點(diǎn)結(jié)合時(shí)，Cys的巰基與Cd原子成鍵產(chǎn)生手性中心，在280～400 nm產(chǎn)生明顯的CD信號(hào), 不僅保留了半胱氨酸本身的手性信號(hào), 還顯示出手性分子誘導(dǎo)的CdTe核的手性(250～350 nm的寬峰)，因此類四面體可能是表現(xiàn)手性行為的主要因素，且手性可能源于更容易被修飾或置換的納米粒子頂端原子的貢獻(xiàn)。

圖3 CdTe量子點(diǎn)的圓二特征峰以及結(jié)構(gòu)Fig.3 Circular dichotomous peaks and structures of CdTe quantum dots

有研究發(fā)現(xiàn)金納米粒子也可以被手性配體誘導(dǎo)產(chǎn)生手性。Alvarez等[12]利用谷胱甘肽作為穩(wěn)定劑制備了手性Au28量子點(diǎn)，在可見(jiàn)光區(qū)顯示出了配體誘導(dǎo)的手性信號(hào)。

本課題組通過(guò)研究L/D-cys-CdTe量子點(diǎn)與半胱氨酸、亮氨酸、谷氨酸對(duì)映體相互作用時(shí)，通過(guò)光學(xué)活性的變化探究了手性產(chǎn)生的本質(zhì)，并提出兩種主要的觀點(diǎn)： 第一，手性是由外殼層的結(jié)構(gòu)手性變形引起，可能是由于表面原子的手性變形或配體殼的手性排列引起。第二，手性配體和半導(dǎo)體量子點(diǎn)間的電子相互作用(而不是物理畸變)反過(guò)來(lái)會(huì)導(dǎo)致圓二發(fā)光[11]； QD-CD光譜形狀和誘導(dǎo)的CD帶的大小取決于許多因素，如材料本身的性質(zhì)、合成過(guò)程中使用的手性配體的濃度等。

理解QD與手性配體之間的關(guān)系，可為手性量子點(diǎn)手性的起源提供另一種視角； 手性量子點(diǎn)能為對(duì)映體識(shí)別提供不可多得的手性環(huán)境，在借助光譜生物成像和醫(yī)學(xué)診療方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

2.4.2 手性量子點(diǎn)識(shí)別氨基酸對(duì)映體

一些對(duì)映體和手性量子點(diǎn)之間的相互作用會(huì)改變他們的光物理和光化學(xué)特性，使其更具有辨識(shí)度。但目前只有少數(shù)報(bào)道研究手性半導(dǎo)體量子點(diǎn)與其他手性部分(如氨基酸)之間的相互作用。在量子點(diǎn)表面修飾手性配體(半胱氨酸、環(huán)糊精、焦谷氨酸)，制備的手性量子點(diǎn)可用來(lái)手性識(shí)別氨基酸對(duì)映體。環(huán)糊精((Cyclodextrin，CD)是一種具有客體包合能力的手性分子，適合手性化合物的對(duì)映體選擇性分析，其空腔能夠和多種物質(zhì)如有機(jī)分子、無(wú)機(jī)離子等通過(guò)分子間作用力形成包合物，引起熒光強(qiáng)度不同程度的改變； 焦谷氨酸是一種廉價(jià)易得的手性原料，相對(duì)堅(jiān)硬的五元內(nèi)酰胺骨架和羧酸基團(tuán)可形成雙氫鍵，提供了很強(qiáng)的捕捉目標(biāo)分子的能力，在氨基酸的識(shí)別上提供了一種新的手性對(duì)映體識(shí)別模塊[13]。

Hak Sung Jung課題組[14]用谷胱甘肽穩(wěn)定CdSe/ZnS量子點(diǎn)，利用雙功能偶聯(lián)劑，將包含羅丹明B的β-環(huán)糊精連接到量子點(diǎn)上制備熒光共振能量轉(zhuǎn)移探針成功識(shí)別不同構(gòu)型的苯丙氨酸。量子點(diǎn)作為能量的給與者, 羅丹明B作為能量的接受者，與苯丙氨酸作用后，苯丙氨酸替換羅丹明B，由于不同構(gòu)型的苯丙氨酸與環(huán)糊精締合常數(shù)不同，熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象被不同程度的破壞，憑借熒光強(qiáng)度的變化區(qū)分對(duì)映體。類似的原理還有以β-環(huán)糊精為穩(wěn)定劑, 制備的CdSe/ZnS核殼結(jié)構(gòu)量子點(diǎn), 成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)酪氨酸對(duì)映體的手性識(shí)別。Zhou Xu等制得β-環(huán)糊精修飾的銀量子點(diǎn)并成功區(qū)分色氨酸對(duì)映體。

Zhu等[13]利用巰基片段修飾焦谷氨酸制備手性配體，連接到CdSe/ZnS量子點(diǎn)表面，如圖4所示，焦谷氨酸內(nèi)酰胺部分具有卓越的氫鍵和立體控制能力易于捕獲目標(biāo)分子。對(duì)映體與手性識(shí)別模塊可構(gòu)成的氫鍵容量不同，結(jié)果表明，該手性量子點(diǎn)對(duì)D/L-組氨酸(Histidine)、D/L-谷氨酸(Glutamate)對(duì)映體具有良好的手性選擇性。

圖4 焦谷氨酸修飾的CdSe/ZnS量子點(diǎn)Fig.4 Pyroglutamic acid modified CdSe/ZnS quantum dots

韓翠平等[15]用環(huán)糊精修飾制得的手性量子點(diǎn)和巰基乙酸修飾制備的非手性量子點(diǎn)與氨基酸作用，發(fā)現(xiàn)非手性量子點(diǎn)無(wú)法區(qū)分氨基酸對(duì)映體，由此他們推測(cè)手性量子點(diǎn)的對(duì)映選擇效應(yīng)是由于手性配體與氨基酸的相互作用。氨基酸與環(huán)糊精作用，原子的嵌入/連接引起核外配體結(jié)構(gòu)變化，限制分子構(gòu)象，誘導(dǎo)環(huán)糊精均勻排列，這種有序取向/增強(qiáng)的構(gòu)象剛性會(huì)抑制猝滅路徑，增強(qiáng)了發(fā)光強(qiáng)度。

因此手性識(shí)別模塊的構(gòu)建是實(shí)現(xiàn)特異性識(shí)別的關(guān)鍵。通過(guò)手性量子點(diǎn)對(duì)不同氨基酸的特異性識(shí)別，有望區(qū)分葉酸的兩種不同亞型，進(jìn)而區(qū)分腫瘤細(xì)胞和炎癥巨噬細(xì)胞(如圖5所示)。手性納米結(jié)構(gòu)是一類具有獨(dú)特性質(zhì)和潛在應(yīng)用價(jià)值的材料, 將分子的手性傳遞到納米尺度并挖掘其生物應(yīng)用具有非常重要的意義, 但是將手性量子點(diǎn)真正運(yùn)用于人體腫瘤診斷還需要進(jìn)行大量的實(shí)驗(yàn)，同時(shí)也面臨著許多挑戰(zhàn)，如探針的重金屬離子溶出和生物相容性等問(wèn)題； 值得關(guān)注的是，腫瘤細(xì)胞與炎癥巨噬細(xì)胞表面過(guò)量表達(dá)的葉酸受體，其亞型存在的不同手性特征，為構(gòu)建實(shí)現(xiàn)區(qū)分癌癥和炎癥的生物手性熒光探針提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

圖5 葉酸受體亞型FRα和FRβ的手性空間與手性量子點(diǎn)作用關(guān)系Fig.5 Chiral space of folate receptor subtypes FRα and FRβ and their interaction with chiral quantum dots

3 結(jié) 論

手性探針的特異性可被用于設(shè)計(jì)構(gòu)建葉酸受體亞型水平識(shí)別探針，進(jìn)而探討對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行精準(zhǔn)靶向識(shí)別的科學(xué)性與可行性, 具有潛在的應(yīng)用前景和不可替代的優(yōu)勢(shì)； 值得關(guān)注的是，葉酸受體亞型的三角空腔是由三種不同的氨基酸構(gòu)成的，與單一氨基酸識(shí)別的不同之處，三角空腔中三種氨基酸是以一定的空間位置構(gòu)成的“手性空間”?！笆中钥臻g”中如此近的氨基酸質(zhì)點(diǎn)之間的電子擾動(dòng)行為和能量作用關(guān)系，是否存在“手性能量轉(zhuǎn)移”現(xiàn)象是值得關(guān)注的重要問(wèn)題。隨著對(duì)手性物質(zhì)本質(zhì)規(guī)律的進(jìn)一步理解，對(duì)疾病本質(zhì)的進(jìn)一步認(rèn)識(shí), 手性質(zhì)點(diǎn)之間的作用關(guān)系將會(huì)對(duì)癌細(xì)胞精準(zhǔn)識(shí)別提供新的依據(jù)。

相信隨著分子生物學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展, “腫瘤標(biāo)記物學(xué)”這一新興學(xué)科會(huì)取得更長(zhǎng)足的發(fā)展、為早期反映體內(nèi)腫瘤變化狀態(tài)提供更充足的依據(jù)。