肖文芳，李佐，陳和明，呂復(fù)兵

摘? 要：利用TP-M13-SSR分子標(biāo)記，以收集保存的29份石斛蘭種質(zhì)為試材，對其遺傳多樣性進(jìn)行分析并構(gòu)建分子身份證。14對SSR引物在29份種質(zhì)間共檢測出191個(gè)等位基因，引物檢出率為79.31%～100%;引物多態(tài)性信息含量為0.3877～0.9484，平均0.7956;Shannon指數(shù)為0.8702～3.1553，平均2.1606。29份種質(zhì)間的遺傳相似性系數(shù)為0.3037～ 0.9005，在0.7000處可將全部種質(zhì)分為6個(gè)類群。根據(jù)引物通用性和Shannon指數(shù)高低，從1對引物開始逐步增加引物數(shù)量篩選可將29份種質(zhì)全部區(qū)分的引物組合，最終確定核心引物組合為DoeSSR5+DoeSSR87+DoeSSR97?；谶@3對核心引物的擴(kuò)增結(jié)果，將等位基因編碼成字符串獲得29份石斛蘭種質(zhì)獨(dú)有、可辨的分子身份證。

關(guān)鍵詞：石斛;TP-M13-SSR;分子身份證

中圖分類號：S682.31? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Molecular Identity Card Establishment of Dendrobium Germplasms by TP-M13-SSR

XIAO Wenfang1，2， LI Zuo1，2*， CHEN Heming1，2， LYU Fubing1，2

1. Environmental Horticulture Research Institute， Guangdong Academy of Agricultural Sciences， Guangzhou， Guangdong 510640， China; 2. Guangdong Key Lab of Ornamental Plant Germplasm Innovation and Utilization， Guangzhou， Guangdong 510640， China

Abstract： A total of 29 Dendrobium germplasms were studied with tailed primer M13 microsatellite markers （TP-M13- SSR）. Analysis was made to perform the genetic diversity and establish the germplasms molecular ID. The results showed that by using 14 selected SSR markers， 191 alleles were detected and the detection rate was 79.31%-100% per primer. The polymorphism information content was 0.3877-0.9484， 0.7956 on average. Shannons information index was 0.8702-3.1553 and the average value was 2.1606. The genetic similarity coefficient of the germplasms ranged from 0.3037 to 0.9005， and all germplasms could be divided into 6 groups at 0.7000. Based on transferability and Shannons information index of the primers， more and more loci were added to distinguish all the germplasms. Finally， DoeSSR5， DoeSSR87 and DoeSSR97 at least were screened. Loci that amplified by the markers were coded to establish the unique and identifiable molecular ID of the germplasms.

Keywords： Dendrobium; TP-M13-SSR; molecular identity card

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.10.002

石斛屬（Dendrodium， Den.）為蘭科三大屬之一，全屬原生種約2000個(gè)，廣泛分布于亞洲熱帶、亞熱帶地區(qū)至大洋洲，我國原產(chǎn)約80余種[1]。石斛蘭分布范圍寬廣、生長環(huán)境多樣，導(dǎo)致種質(zhì)資源豐富多變，既有花繁色艷、極具觀賞價(jià)值的種質(zhì)，又有極具藥用價(jià)值的傳統(tǒng)名貴中藥材——霍山石斛、鐵皮石斛等。我國在石斛藥用價(jià)值方面的研究較早較多，但對各類不同種質(zhì)資源的精準(zhǔn)鑒定、深入挖掘和利用方面的研究較少。收集、整理、保存、鑒定石斛蘭豐富的種質(zhì)資源，是合理開發(fā)利用、保證藥用石斛安全性和觀賞石斛新品種選育的基礎(chǔ)。

TP-M13-SSR（tailed primer M13 microsatellite markers）技術(shù)結(jié)合了SSR分子標(biāo)記技術(shù)和熒光測序技術(shù)，具有重復(fù)性高、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，在較大程度上解決了傳統(tǒng)凝膠電泳SSR分子標(biāo)記分析通量較低、擴(kuò)增產(chǎn)物檢測流程繁瑣、數(shù)據(jù)記錄工作量大等一系列問題[2]，已在芍藥品種資源分子身份證構(gòu)建[3]、茶花新品種鑒別[4]、百合種質(zhì)資源分子身份證構(gòu)建[5]、牡丹品種的分子身份證構(gòu)建[6]等各類觀賞花卉中取得成功應(yīng)用，在蘭科植物中已成功應(yīng)用于蝴蝶蘭的突變體鑒定[7]和建蘭的核心種質(zhì)構(gòu)建[8]。目前，TP-M13-SSR在石斛屬中僅應(yīng)用于鐵皮石斛實(shí)生群體遺傳多樣性的分析上[9]，而石斛蘭種質(zhì)資源鑒定、遺傳多樣性分析及指紋圖譜構(gòu)建等主要仍是采用基于傳統(tǒng)凝膠電泳的SSR分子標(biāo)記技術(shù)[10-12]或者其他類型分子標(biāo)記技術(shù)[13-15]。

為充分保護(hù)和利用石斛蘭種質(zhì)資源，本研究通過TP-M13-SSR技術(shù)篩選高效通用的引物對石斛屬內(nèi)28個(gè)原生種和1個(gè)流行商品品種進(jìn)行分析檢測，從DNA水平揭示石斛蘭種質(zhì)資源的遺傳多樣性并構(gòu)建分子身份證，為石斛蘭種質(zhì)資源的保護(hù)及開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

29份石斛蘭種質(zhì)具體信息見表1，種植于廣東省農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化科技示范區(qū)廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境園藝研究所溫室大棚內(nèi)。2020年5月采集實(shí)驗(yàn)材料的根尖或嫩葉，置于液氮中速凍15 min后于–80 ℃超低溫冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2? 方法

1.2.1? 總DNA提取? 每份種質(zhì)取0.2 g樣品，利用新型植物基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取樣品DNA，并溶解于80 ?L 1×TE溶液中。NanoDrop分光光度計(jì)和1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA的質(zhì)量，檢測合格后存儲于–20 ℃冰箱中備用。

1.2.2? 引物篩選? 根據(jù)前人研究結(jié)果，挑選了50對在石斛蘭中擴(kuò)增效果較好的引物進(jìn)行擴(kuò)增[11， 16-19]，分別采用FAM和HEX 2種不同顏色的熒光標(biāo)記，挑選能穩(wěn)定擴(kuò)增出條帶的引物作為篩選出的引物。

1.2.3? PCR反應(yīng)? 所有引物在不同樣品中進(jìn)行10 ?L反應(yīng)體系的單重PCR擴(kuò)增，其中含1.2 ?L DNA模板（50 ng/?L），各0.3 ?L上下游引物（5 ?mol/L），1.0 ?L 10×Buffer Ι緩沖液，0.1 ?L TAKARA HS Taq酶（5 U/?L），0.8 ?L dNTP（2.5 mmol/L），0.5 ?L TP-M13（5 ?mol/L），5.8 ?L

去離子水。擴(kuò)增程序如下：95 ℃，5 min;95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán);95 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，10個(gè)循環(huán);60 ℃，30 min。

1.2.4? 檢測及分析? 96孔板中每孔加入1.0 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，9 μL體積比為0.5∶8.5的ROX-500分子量內(nèi)標(biāo)和甲酰胺混合液，95 ℃變性3 min后上ABI 3730XL檢測儀進(jìn)行檢測，1 kV電壓進(jìn)樣10 s后15 kV電壓電泳30 min。Data Colletion軟件收集原始數(shù)據(jù)并導(dǎo)入GeneMapper 3.2中，根據(jù)泳道中分子量內(nèi)標(biāo)計(jì)算出各峰值的大小。3次重復(fù)毛細(xì)管電泳檢測，取平均值四舍五入作為實(shí)驗(yàn)材料在該位點(diǎn)上的片段大小。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

將整理好的數(shù)據(jù)，運(yùn)用PopGene、NTSYS軟件進(jìn)行遺傳多樣性指標(biāo)、聚類作圖及多態(tài)信息含量計(jì)算分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 引物篩選及通用性、多態(tài)性分析

從50對引物中篩選出14對能穩(wěn)定擴(kuò)增出條帶、無雜峰，且通用性較高的引物用于29份石斛蘭種質(zhì)的鑒定。14對引物共擴(kuò)增出191個(gè)峰，擴(kuò)增片段大小為97～292 bp。引物通用性方面，DoeSSR5和DoeSSR87最佳（DoeSSR5在部分樣品中的擴(kuò)增峰見圖1），在29份種質(zhì)中均能擴(kuò)增出條帶，而其他引物存在在部分種質(zhì)中不能擴(kuò)增出條帶的現(xiàn)象（表2）。其中DoeSSR4在美花石斛中未能擴(kuò)增出條帶，DoeSSR15在純白紫瓣石斛中未能擴(kuò)增出條帶，DoeSSR23在茉香石斛、尖刀唇石斛和木石斛中未能擴(kuò)增出條帶，DoeSSR26在茉香石斛、勐臘石斛和木石斛中未能擴(kuò)增出條帶，DoeSSR28在茉香石斛、玫瑰石斛、黃貝殼石斛、聚石斛和鉛筆石斛中未能擴(kuò)增出條帶，DoeSSR41在尖刀唇石斛和河口石斛中未能擴(kuò)增出條帶，DoeSSR51在棒葉石斛中未能擴(kuò)增出條帶，DoeSSR67在茉香石斛中未能擴(kuò)增出條帶，DoeSSR84在茉香石斛、雪山石斛、矩唇石斛、木石斛、棒葉石斛和美花石斛中未能擴(kuò)增出條帶，DoeSSR93在茉香石斛、雪山石斛、喇叭唇石斛、木石斛、美花石斛和絨毛石斛樣品中未能擴(kuò)增出條帶，DoeSSR97在河口石斛中未能擴(kuò)增出條帶，DoeSSR107在報(bào)春石斛、黃喉石斛、鐵皮石斛、河口石斛、聚石斛和鉛筆石斛中未能擴(kuò)增出條帶。但通用性最低的引物其檢出率

也超過79%，說明本研究篩選的引物在石斛屬種間的通用性較高。

14對引物在29份石斛種質(zhì)中共檢測到191個(gè)等位基因，不同引物檢測到的等位基因數(shù)目（Na）從5個(gè)（DoeSSR5）到27個(gè)（DoeSSR26）不等，平均13.6429個(gè);觀測雜合度（Ho）變化范圍從0.0807（DoeSSR107）到0.6897（DoeSSR41），平均0.3754;期望雜合度（He）變化范圍從0.4064（DoeSSR107）到0.9506（DoeSSR26），平均 0.8116;多態(tài)性信息含量（PIC）最低值為0.3877（DoeSSR107），最高為0.9484（DoeSSR26），平均0.7956，除引物DoeSSR107外，其他引物均呈高度多態(tài)性

（PIC>0.5）;Shannons多樣性指數(shù)（I）的變化范圍從0.8702（DoeSSR107）到3.1553（DoeSSR26），平均為2.1606（表3）。引物多態(tài)性分析表明本研究篩選的14對引物在29份種質(zhì)中的多態(tài)性較高。

根據(jù)引物通用性和Shannons指數(shù)，從1對引物開始逐步增加引物數(shù)量篩選可將供試材料全部區(qū)分的引物組合，最終確定核心引物組合DoeSSR5+DoeSSR87+DoeSSR97能夠?qū)⑺袠悠穮^(qū)分開，可作為今后石斛蘭種質(zhì)資源鑒定的核心引物，其他引物作為備選。

2.2? 29份石斛蘭種質(zhì)聚類分析

利用14條SSR引物擴(kuò)增結(jié)果計(jì)算出29份石斛蘭種質(zhì)遺傳相似性系數(shù)變化范圍為0.3037～ 0.9005。其中，線葉石斛和晶帽石斛的遺傳相似性系數(shù)最大，說明在這29份種質(zhì)中線葉石斛和晶帽石斛的遺傳差異相對較小;茉香石斛和河口石斛的遺傳相似性系數(shù)最小，說明在這29份種質(zhì)中茉香石斛和河口石斛的遺傳差異相對較大。在遺傳相似性系數(shù)為0.7000時(shí)，可將29份石斛蘭種質(zhì)劃分為6個(gè)類群（圖2）。第一類群包括茉香石斛和木石斛，二者均為原產(chǎn)熱帶地區(qū)的黃色系具花香的石斛蘭原生種;第三類群為純白紫瓣石斛，為紫瓣石斛的白變種;第四類群為勐臘石斛，原產(chǎn)我國云南省，在泰國和緬甸也有分布的純黃色石斛屬原生種;第五類群為美花石斛，廣泛分布于東南亞地區(qū)，在我國中南部、東南部和海南也都有分布的紫紅色濃香型石斛蘭原生種;第六類群為河口石斛，只分布于我國云南省和越南的一種迷你型石斛蘭原生種;其余23份種質(zhì)均在第二

類群。第二類群又可分為4個(gè)小群，其中尖刀唇石斛單獨(dú)一個(gè)小群，尖刀唇石斛為石斛屬中分布最廣的原生種之一;聚石斛和鉛筆石斛聚在一個(gè)小群，聚石斛廣泛分布于我國西南部地區(qū)和東南亞各國，本研究采用的是泰國產(chǎn)原種，而鉛筆石斛則是只產(chǎn)于澳大利亞的一種連莖棒葉石斛屬原生種;雪山石斛、距唇石斛和棒葉石斛聚在一個(gè)小群，雪山石斛為長苞石斛（Den. bracteosum）和亮葉石斛（Den. laevifolium）雜交選育出的優(yōu)良品種，距唇石斛目前只在我國廣西和臺灣島臺北以南的烏來區(qū)有分布，棒葉石斛則是只產(chǎn)于澳大利亞的另一種連莖棒葉石斛屬原生種;剩余的17份不同的石斛屬原生種則聚在一個(gè)小群。

2.3? 29份石斛蘭種質(zhì)分子身份證構(gòu)建

對3對核心SSR引物擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)化編碼構(gòu)建29份石斛蘭種質(zhì)分子身份證，各引物擴(kuò)增片段按分子量大小排列，從小到大以阿拉伯?dāng)?shù)字1～9標(biāo)注，9個(gè)以上的片段以大寫英文字母A、B、C等標(biāo)注，若該位點(diǎn)在某個(gè)種質(zhì)中無擴(kuò)增則記為0。每個(gè)引物占2位，標(biāo)記的順序依次為DoeSSR5、

DoeSSR87、DoeSSR97。構(gòu)建的29份石斛蘭種質(zhì)分子身份證代碼均不相同，能夠?qū)⑺蟹N質(zhì)區(qū)分開（表4）。其他引物作為備選引物便于今后擴(kuò)大鑒評范圍，可實(shí)現(xiàn)石斛蘭種質(zhì)資源的數(shù)字化管理。

3? 討論

本研究從50對SSR引物中篩選出14對能穩(wěn)定擴(kuò)增出條帶、無雜峰的引物用于29份石斛蘭種質(zhì)的鑒定，引物通用性均超過79%，除引物DoeSSR107外的其他引物均呈高度多態(tài)性，說明本研究篩選的引物在石斛屬內(nèi)不同種間應(yīng)用性較好，可以一定程度反應(yīng)石斛屬內(nèi)種質(zhì)資源豐富的遺傳多樣性。擴(kuò)增結(jié)果表明，29份種質(zhì)遺傳相似性系數(shù)變化范圍較大，遺傳多樣性較高，這與本研究采用的石斛蘭種質(zhì)資源豐富多變、形態(tài)多樣的表型特征一致。本研究采用的29份石斛蘭種質(zhì)包括28個(gè)原生種和1個(gè)流行商品品種（2個(gè)不同原生種的雜交后代），地理分布跨度較廣，從澳洲（鉛筆石斛等）到緬甸、越南（絨毛石斛等）再到我國（霍山石斛等）;形態(tài)差異較大，從株型可達(dá)1.5 m的齒瓣石斛到最高只有4 cm左右的河口石斛，從花朵直徑可達(dá)10 cm的喇叭唇石斛到花朵直徑僅1 cm左右的河口石斛，包括具濃香的茉香石斛等和無香的雪山石斛等，具金黃色花的密花石斛、純白色花的木石斛、紫紅色花的美花石斛和淺黃綠花的鐵皮石斛等。前人利用ISSR標(biāo)記分析29種石斛蘭[20]、SRAP分子標(biāo)記分析48份石斛蘭種質(zhì)資源[14]、SSR分子標(biāo)記分析32份石斛蘭種質(zhì)資源[11]同樣發(fā)現(xiàn)石斛蘭種質(zhì)資源遺傳多樣性較高。如此豐富多變的種質(zhì)資源僅利用10多對SSR引物并不能完全呈現(xiàn)出其遺傳多態(tài)性，這可能是導(dǎo)致本研究根據(jù)遺傳相似性聚類的結(jié)果并沒有明顯的分類規(guī)律的原因，在前人的研究中，應(yīng)用不同的分子標(biāo)記方法對石斛蘭不同的種質(zhì)資源進(jìn)行分類的結(jié)果與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類方法相比都有一致和不同的地方[10-11， 13-14， 20]。所以針對石斛蘭種質(zhì)資源親緣關(guān)系的分析應(yīng)該結(jié)合分析標(biāo)記、形態(tài)學(xué)分類及雜交親和性等多方因素，單一方法目前不能完全呈現(xiàn)其遺傳多樣性。

種質(zhì)資源分類及鑒評是開發(fā)利用工作的基礎(chǔ)。石斛屬作為蘭科三大屬之一，具極高的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值，但長期以來我國針對石斛屬種質(zhì)資源的研究主要集中在藥用石斛上[21-24]。近年來基于國家對種質(zhì)資源的重視，開始有針對其他種質(zhì)資源分子鑒評的相關(guān)研究[10-11， 13-14， 20-21]，但相對于石斛屬龐大的種質(zhì)資源來說，相關(guān)研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，且目前尚無石斛屬種質(zhì)資源分子身份證構(gòu)建方面的研究。分子身份證是運(yùn)用不同的編碼方式對分子標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行編碼后得到的字符串，能夠更加簡單明了地區(qū)分種質(zhì)資源，克服傳統(tǒng)分類比對的繁瑣、低效等問題[6]，既能避免重復(fù)性的收集和保存，剔除同名異物和同物異名的種質(zhì)資源，又有利于科學(xué)高效地進(jìn)行種質(zhì)資源的鑒定評價(jià)和利用。本研究篩選出的14對引物能夠?yàn)?9份不同石斛蘭種質(zhì)構(gòu)建獨(dú)一無二的分子身份證，其中的3對核心引物就能夠?qū)?9份種質(zhì)完全區(qū)分開，其余引物的通用性和多態(tài)性也非常高，均可作為后續(xù)對其他更多石斛屬種質(zhì)資源進(jìn)行鑒評和分子身份證構(gòu)建的備選引物，為石斛屬種質(zhì)資源的分類、鑒定和利用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

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