劉華偉，李朝緒，李芬，呂朝軍，吳少英，覃偉權(quán)

摘? 要：椰心葉甲嚙小蜂（Tetrastichus brontispae）是外來有害生物椰心葉甲（Brontispa longissima）的蛹期寄生蜂，分析其轉(zhuǎn)錄組序列中的SSR、SNP和InDel位點(diǎn)信息，可以為開發(fā)新的分子標(biāo)記，深入研究其遺傳多樣性、種群遺傳結(jié)構(gòu)和歷史動(dòng)態(tài)等提供數(shù)據(jù)支撐。本研究基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用MISA軟件和Varscan軟件對(duì)Unigene進(jìn)行SSR、SNP和InDel位點(diǎn)進(jìn)行搜索。在11 802條Unigene中共獲得29 754個(gè)SSR位點(diǎn)，平均每1.72 kb含有1個(gè)SSR位點(diǎn)，發(fā)生率為39.96%。SSR片段為10～382 bp，長(zhǎng)度具有顯著差異，平均長(zhǎng)度為23.91 bp。SSR片段中，單堿基重復(fù)最多（60.82%），其次是二堿基重復(fù)（27.69%），再次為三堿基重復(fù)（10.79%）。其中優(yōu)勢(shì)重復(fù)基元類型為A/T（59.32%），其次為AT/AT（15.28%）。在6895個(gè)Unigene中發(fā)掘出51 334個(gè)SNP位點(diǎn)，轉(zhuǎn)換位點(diǎn)37 445個(gè)（72.94%），顛換位點(diǎn)13 975個(gè)（27.22%），平均每條Unigene上含有7.45個(gè)SNP位點(diǎn)。還在6040個(gè)Unigene中篩選出15 644個(gè)InDel位點(diǎn)，平均每條Unigene上有2.59個(gè)InDel位點(diǎn)。椰心葉甲嚙小蜂轉(zhuǎn)錄組中SSR、SNP和InDel位點(diǎn)數(shù)量多，出現(xiàn)頻率高，類型豐富，具有較高的多態(tài)性潛能。

關(guān)鍵詞：椰心葉甲嚙小蜂;轉(zhuǎn)錄組;SSR;SNP;InDel

中圖分類號(hào)：S476? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

SSR， SNP and InDel Analysis Based on Tetrastichus brontispae Transcriptome

LIU Huawei1，2，3，4，， LI Chaoxu1，3，4， LI Fen2， LYU Chaojun1，3，4， WU Shaoying2， QIN Weiquan1，3，4*

1. Coconut Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Wenchang， Hainan 571399， China; 2. Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 3. Hainan Innovation Center of Academician Team （Integrated Management of Arecanut Yellow Leaf Disease）， Wenchang， Hainan 571339， China; 4. Hainan Key Laboratory of Tropical Oil Crops Biology， Wenchang， Hainan 571399， China.

Abstract： Tetrastichus brontispae is the pupal parasitic wasp of Brontispa longissima， an exotically invasive pest. The analysis of SSR， SNP and InDel sites in the transcriptome sequences of T. brontispae can provide data support for the development of new molecular markers and the in-depth study of its genetic diversity， population genetic structure and historical dynamics. Based on transcriptional data， MISA software and Varscan software were used to search the SSR， SNP and InDel sites of Unigenes. A total of 29 754 SSR sites were obtained in 11 802 Unigenes， with an average of 1 SSR per 1.72 kb， with an incidence of 39.96%. The length of the SSR fragments was 10-382 bp， with an average length of 23.91 bp. In the SSR segment， mononucleotide was dominant （60.82%）， followed by dinucleotide （27.69%） and trinucleotide （10.79%）. In all repeating motifs， the dominant repeating motif was A/T （59.32%）， followed by AT/AT （15.28%）. Among 6 895 Unigenes， 51 334 SNP sites were discovered， and each Unigene contained 7.45 SNP on average. There were 37 445 transition sites （72.94%） and 13 975 transversion points （27.22%）. 15 644 InDel sites were also identified out of 6 040 Unigene， with an average of 2.59 InDel per Unigene.SSR， SNP and InDel sites are abundant in the transcriptome of T. brontispae， with a large number， high occurrence frequency， rich type and polymorphism potential.

Keywords： Tetrastichus brontispae; transcriptome; SSR; SNP; InDel

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.10.011

椰心葉甲嚙小峰（Tetrastichus brontispae Ferrière）屬膜翅目（Hymenoptera）姬小蜂科（Eulophidae）嚙小蜂屬（Tetrastichus），是重大危險(xiǎn)性外來有害生物椰心葉甲[Brontispa longissima （Gestro）]的寄生性天敵[1]，主要寄生蛹期的椰心葉甲，通過野外釋放該蜂可以有效地防控椰心葉甲危害。目前國(guó)內(nèi)外已對(duì)椰心葉甲嚙小蜂的成蟲習(xí)性、寄主適應(yīng)性、生物生態(tài)學(xué)特性、室內(nèi)大量繁殖和野外釋放等方面進(jìn)行了相關(guān)研究[1-5]。

分子標(biāo)記技術(shù)隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展在動(dòng)植物中被廣泛應(yīng)用。在各種分子標(biāo)記中，簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）又稱作微衛(wèi)星，因具有數(shù)量多易檢測(cè)、多態(tài)性信息豐富、呈共顯性遺傳等優(yōu)點(diǎn)而成為研究群體遺傳學(xué)、遺傳育種、保護(hù)遺傳學(xué)以及系統(tǒng)進(jìn)化等方面的有力工具，在動(dòng)植物、微生物以及人類醫(yī)學(xué)等各領(lǐng)域都得到了廣泛的應(yīng)用。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的逐步發(fā)展，基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選SSR位點(diǎn)在動(dòng)植物研究中也被廣泛應(yīng)用[6-7]。單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP）由于其具有分布廣、位點(diǎn)多、易檢測(cè)、準(zhǔn)確率高、遺傳穩(wěn)定性高、并且在不同物種中具有顯著差異等特點(diǎn)而也被廣泛應(yīng)用[8-9]。插入/缺失多態(tài)性（insenion-deletion，InDel）標(biāo)記是根據(jù)核苷酸片段的插入或缺失而開發(fā)的，具有分布廣（僅次于SNP位點(diǎn)）、可重復(fù)性高、密度高、成本較低、變異率低、多態(tài)性強(qiáng)且易于檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，可以利用InDel進(jìn)行優(yōu)異基因挖掘、基因精細(xì)定位、遺傳多樣性分析等研究[10-12]。

由于椰心葉甲嚙小蜂在基因信息方面比較缺乏，所以目前國(guó)內(nèi)外對(duì)其分子標(biāo)記方面的研究仍是空白。本研究利用MISA和Varscan軟件，基于椰心葉甲嚙小蜂轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)SSR、SNP和InDel位點(diǎn)進(jìn)行搜索并分析，以期為椰心葉甲嚙小蜂及近緣種的SSR、SNP和InDel分子標(biāo)記的開發(fā)深入研究其遺傳多樣性、種群遺傳結(jié)構(gòu)和歷史動(dòng)態(tài)提供參考依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

材料已上傳到NCBI SRA數(shù)據(jù)庫(kù)中，GenBank登錄號(hào)：PRJNA678031。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量參照劉華偉等[13]的研究。

1.2? 方法

1.2.1? 轉(zhuǎn)錄組SSR的篩選及分析? 利用MISA軟件（https：//webblast.ipk-gatersleben.de/misa/）從椰心葉甲嚙小蜂轉(zhuǎn)錄組的Unigene中進(jìn)行SSR搜索，篩選標(biāo)準(zhǔn)：?jiǎn)魏塑账嶂貜?fù)數(shù)≥10，二核苷酸重復(fù)數(shù)≥6，三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸≥5;運(yùn)用Excel軟件對(duì)轉(zhuǎn)錄組的SSR各類型比例、序列分布和特征進(jìn)行分析和統(tǒng)計(jì)。

SSR發(fā)生頻率=含SSR的Unigene數(shù)與Unigene總數(shù)的比值;SSR分布的平均距離=總Unigene長(zhǎng)度與搜索到的SSR數(shù)量的比值。

1.2.2? 轉(zhuǎn)錄組中SNP和InDel的篩選及分析? 利用Varscan軟件（http：//varscan.sourceforge.net/），搜索候選SNP和InDel位點(diǎn)。篩選標(biāo)準(zhǔn)：SNP/InDel位點(diǎn)堿基Q>20;覆蓋該位點(diǎn)的Reads數(shù)目>8;支持突變位點(diǎn)的Reads數(shù)目>2;SNP/InDel位點(diǎn)P<0.01。

2? 結(jié)果與分析

2.1? SSR重復(fù)基元的分布

通過MISA軟件，在11 802條Unigene檢測(cè)到29 754個(gè)SSR位點(diǎn)，SSR的發(fā)生頻率為39.96%，平均1.72 kb出現(xiàn)1個(gè)SSR位點(diǎn)。包含1個(gè)以上SSR位點(diǎn)的Unigene有6177條，復(fù)合型的SSR位點(diǎn)有4346個(gè)。

2.2? 椰心葉甲嚙小蜂轉(zhuǎn)錄組中SSR的數(shù)量和分布特點(diǎn)

各堿基類型中的SSR序列占比差異較大（表1），共有74種重復(fù)基序。單核苷酸～六核苷酸堿基重復(fù)基元分別有2、4、10、24、12、22種。單核苷酸為優(yōu)勢(shì)重復(fù)類型（60.82%），其中A/T出現(xiàn)的最多（97.54%）;二堿基重復(fù)SSR含量約占總數(shù)的27.69%，AG/CT出現(xiàn)的頻率為55.20%;在三堿基重復(fù)SSR（10.79%）中，AGC/CTG出現(xiàn)的頻率為30.72%;而四堿基、五堿基、六堿基重復(fù)SSR占比較少（0.05%～0.53%）。出現(xiàn)頻率最高的重復(fù)基元分別是AAAT/ATTT（28.93%）、AAAAT/ATTTTT（18.75%）、AGCCGC/CGGCTG和ACCAGC/CTGGTG（11.43%）。在所有的堿基重復(fù)模式中，各種重復(fù)基元中在總SSR中的比例> 0.5%有13類，不同類型重復(fù)基序SSR比例分布見圖1。

2.3? SSR長(zhǎng)度分析

SSR長(zhǎng)度也存在極顯著變異。椰心葉甲嚙小蜂轉(zhuǎn)錄組SSR片段長(zhǎng)度由10～382 bp，平均長(zhǎng)度23.91 bp。主要是重復(fù)長(zhǎng)度≤20 bp的序列，有18 695條，占總數(shù)的73.58%，長(zhǎng)度大于50 bp的長(zhǎng)序列占SSR總數(shù)的10.30%（圖2）。

SSR數(shù)量與重復(fù)次數(shù)的關(guān)系如圖3所示，各種SSR的數(shù)量均與重復(fù)次數(shù)呈負(fù)相關(guān)。其中單核苷酸曲線的下降速率最大，當(dāng)重復(fù)次數(shù)達(dá)到13次時(shí)，下降速率變慢。其他核苷酸曲線的下降趨勢(shì)趨于平緩。

2.4? 椰心葉甲嚙小蜂轉(zhuǎn)錄組SNP和InDel的特征分析

在獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，利用Varscan軟件進(jìn)行SNP搜索，在6895個(gè)Unigene中檢測(cè)51 334個(gè)SNP位點(diǎn)，平均每1000 bp出現(xiàn)一個(gè)SNP位點(diǎn)，在所有的SNP位點(diǎn)中，轉(zhuǎn)換（Transition）位點(diǎn)有37 445個(gè)，顛換（Transversion）位點(diǎn)有13 975個(gè)，SNP位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)見表2。

從圖4可見，含有1個(gè)SNP位點(diǎn)的Unigene最多（25.74%），其次是含有2個(gè)SNP位點(diǎn)的Unigene（14.58%），含有3～10個(gè)SNP位點(diǎn)的Unigene數(shù)量呈下降趨勢(shì)（136～756個(gè)Unigene），在1186個(gè)Unigene上發(fā)現(xiàn)了超過10個(gè)SNP位點(diǎn)，平均每條Unigene上有7.45個(gè)SNP位點(diǎn)。

利用Varscan軟件對(duì)InDel位點(diǎn)進(jìn)行搜索，最終在6040個(gè)Unigene中共找到15 644個(gè)InDel位點(diǎn)，每3281 bp出現(xiàn)1個(gè)InDel位點(diǎn)。InDel位點(diǎn)分布趨勢(shì)和SNP位點(diǎn)的分布趨勢(shì)相同（圖5），含有1個(gè)SNP位點(diǎn)的Unigene最多（43.77%），其次是2個(gè)InDel位點(diǎn)（21.79%），含有3～10個(gè)InDel位點(diǎn)的Unigene呈下降趨勢(shì)（31～726個(gè)Unigene），在83個(gè)Unigene上發(fā)現(xiàn)了超過10個(gè)InDel位點(diǎn)，平均每條Unigene上有2.59個(gè)InDel位點(diǎn)。

3? 討論

近年來，隨著測(cè)序成本的降低和組學(xué)研究的深入，基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選、分析SSR、SNP和InDel等分子標(biāo)記位點(diǎn)在曼氏無(wú)針烏賊[7]、大黃魚[9]、甜菜[10]、大麥[11]等動(dòng)植物中被大量研究，特別是在品種鑒定和種群關(guān)系分析方面。由于椰心葉甲嚙小蜂遺傳信息的缺乏，對(duì)其分子標(biāo)記方面的研究仍是空白。

本研究在椰心葉甲嚙小蜂轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出29 754個(gè)SSR位點(diǎn)，發(fā)生頻率為39.96%，比已報(bào)道的大部分昆蟲，如黑腹胃蠅（31.09%）[14]、溫帶臭蟲（18.86）[6]、印度谷螟（8.52%）[15]、沙蔥螢葉甲（4.53%）[16]、桔小實(shí)蠅（4.23%）[17]和黃粉甲（1.67%）[18]等數(shù)量都要高。并且其SSR平均分布距離（每1.72 kb出現(xiàn)一個(gè)SSR位點(diǎn)）也比印度谷螟（13.38 kb）[14]和桔小實(shí)蠅（10.21 kb）[17]要小得多。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能與物種的特異性、測(cè)序數(shù)據(jù)量大小以及數(shù)據(jù)的篩選參數(shù)有關(guān)[6]，在一定程度上說明椰心葉甲嚙小蜂中含有豐富的SSR標(biāo)記位點(diǎn)，具有較高的多態(tài)性潛能。

在唐培安等[15]的研究中提出，普遍認(rèn)為基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)挖掘的昆蟲SSR位點(diǎn)以三堿基重復(fù)為主。然而在椰心葉甲嚙小蜂中最優(yōu)重復(fù)單元為單堿基重復(fù)（60.82%），主要重復(fù)基序是A/T（97.54%），這與溫帶臭蟲[6]、沙蔥螢葉甲[16]的研究結(jié)果相一致。另外有一些昆蟲以二堿基重復(fù)為主，如印度谷螟[15]，還有一些昆蟲單堿基和三堿基占比相近，都是優(yōu)勢(shì)重復(fù)單元，如黑腹胃蠅[14]和黃粉甲[18]。推測(cè)出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因可能與物種本身的基因型和SSR的篩選參數(shù)有關(guān)[19]。

值得注意的是，在Meglécz等[20]和Yoon等[21]的研究中表示，由于胞嘧啶（C）容易甲基化突變?yōu)樾叵汆奏ぃ═），推測(cè)在動(dòng)植物的轉(zhuǎn)錄組或基因組中，GC/CG的數(shù)量都幾乎接近0。但在李敏等[6]和唐培安等[15]的研究中表示，雖然大部分昆蟲中GC/GC的含量非常低甚至沒有，不過也在鱗翅目玉米粘蟲、二點(diǎn)委夜蛾和細(xì)梢小卷蛾中發(fā)現(xiàn)GC/GC基序不僅常見而且有較高的占比。本研究中，椰心葉甲嚙小蜂的GC/CG同樣是二堿基重復(fù)SSR中占比最少的重復(fù)基元（0.02%），但數(shù)量有586個(gè)，這與大部分昆蟲有差異。

Meglécz等[20]研究表示，SSR的長(zhǎng)度越長(zhǎng)，其核心基元的重復(fù)次數(shù)越多，多態(tài)性越高。Temnykh[22]的研究認(rèn)為，當(dāng)SSR長(zhǎng)度≥20 bp時(shí)，多態(tài)性較高，當(dāng)12 bp

本研究利用Varscan軟件，在6895個(gè)Unigene中檢測(cè)51 334個(gè)SNP位點(diǎn)，平均每1000 bp出現(xiàn)一個(gè)SNP位點(diǎn)，其中轉(zhuǎn)換位點(diǎn)有37 445個(gè)，顛換位點(diǎn)有13 975個(gè)。從理論上來說轉(zhuǎn)換∶顛換應(yīng)該等于1∶2，在本研究中，轉(zhuǎn)換比顛換的比率達(dá)到2.68，遠(yuǎn)大于理論值，這種現(xiàn)象稱為轉(zhuǎn)換偏差，這與堿基組成和進(jìn)化過程中的選擇機(jī)制有關(guān)，說明堿基的轉(zhuǎn)換突變可能不是隨機(jī)產(chǎn)生的[23]。在轉(zhuǎn)換類型中，C-T的發(fā)生頻率最高，并且多是C轉(zhuǎn)換為T，這可能與CG中的胞嘧啶（C）常為甲基化的，脫氨后就變成胸腺嘧啶（T）有關(guān)[24]。另外還發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)換位點(diǎn)和顛換位點(diǎn)的總和與SNP位點(diǎn)總數(shù)不相等，這是因?yàn)樵谕粋€(gè)位點(diǎn)同時(shí)發(fā)生轉(zhuǎn)換和顛換2種突變而導(dǎo)致。在椰心葉甲嚙小蜂轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，平均每條Unigene上含有7.45個(gè)SNP位點(diǎn)，其中含有1個(gè)SNP位點(diǎn)的Unigene最多（25.74%），其次是含有2個(gè)SNP位點(diǎn)的（14.58%）。除了SNP位點(diǎn)，本研究還利用Varscan軟件，在6040個(gè)Unigene中15 644個(gè)InDel位點(diǎn)，平均每3281 bp出現(xiàn)一個(gè)InDel位點(diǎn)。InDel位點(diǎn)的數(shù)量分布與SNP大致相同，也是一個(gè)InDel位點(diǎn)最多（43.77%），其次是2個(gè)InDel位點(diǎn)的（21.79%），平均每條Unigene上有2.59個(gè)InDel位點(diǎn)。

本研究利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)挖掘椰心葉甲嚙小蜂SSR、SNP和InDel位點(diǎn)，并對(duì)其特征進(jìn)行了分析，為后續(xù)開發(fā)和應(yīng)用分子標(biāo)記的提供了數(shù)據(jù)支撐。通過進(jìn)一步的設(shè)計(jì)、篩選引物，還可應(yīng)用到椰心葉甲嚙小峰的遺傳多樣性分析、種群鑒定和遷飛能力評(píng)估等方面。

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