周丹，羅燦，于旭東，蔡澤坪，吳繁花

摘? 要：波羅蜜（Artocarpus heterophyllus）是一種熱帶果樹，至今對其突變體的研究少有報道。本研究以波羅蜜葉片為試驗材料，探究其葉片出現(xiàn)白化和返綠現(xiàn)象的可能原因。（1）用分光光度計法、比色法測定波羅蜜葉片突變體和正常綠葉的葉綠素及葉綠素前體物質(zhì)含量;（2）用葉綠素酶Elisa試劑盒測定葉綠素酶活性;（3）用透射電子顯微鏡對葉綠體的超微形態(tài)結(jié)構(gòu)進行觀察。研究結(jié)果表明：（1）不同葉色所產(chǎn)生的葉綠素a含量、葉綠素b含量、葉綠素總含量、類胡蘿卜素含量均存在顯著差異;（2）波羅蜜葉片突變體和正常綠葉的葉綠素合成前體物質(zhì)含量之間并沒有出現(xiàn)顯著性差異;（3）對波羅蜜葉片的葉綠素酶活性進行測定時，發(fā)現(xiàn)其活性出現(xiàn)顯著差異，但對其葉綠素含量的差異性并沒有產(chǎn)生較大影響;（4）觀察波羅蜜葉片內(nèi)葉綠體超微形態(tài)結(jié)構(gòu)時，發(fā)現(xiàn)正常綠葉的葉綠體形態(tài)完好且數(shù)量較多，白化葉和返綠葉的葉綠體內(nèi)部結(jié)構(gòu)存在缺陷，其原因是葉綠體基粒構(gòu)建階段受阻;基于測定波羅蜜葉片中的葉綠素、葉綠素前體物質(zhì)含量和葉綠素酶活性，并觀察波羅蜜葉片內(nèi)葉綠體的超微形態(tài)結(jié)構(gòu)，對得到的數(shù)據(jù)結(jié)果進行比較分析。本研究推測是在葉綠素合成階段，原脫植基葉綠素合成葉綠素時受阻及葉綠體發(fā)不良導致波羅蜜出現(xiàn)白化和返綠現(xiàn)象，為今后進一步綜合研究波羅蜜突變體提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：波羅蜜;葉綠素;葉綠素前體物質(zhì);葉綠素酶活性;超微結(jié)構(gòu)

中圖分類號：S667.8? ? ? 文獻標識碼：A

Determination of Chlorophyll Content and Observation of

Ultrastructure in Leaves of Mutants of Artocarpus heterophyllus

ZHOU Dan1，2，3，4， LUO Can1，4， YU Xudong1，2，3，4*， CAI Zeping1， WU Fanhua1

1. College of Forestry， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Key Laboratory of Genetics and Germplasm Innovation of Tropical Special Forest Trees and Ornamental Plants （Hainan University）， Ministry of Education， Haikou， Hainan 570228， China; 3. Key Laboratory of Germplasm Resources Biology of Tropical Special Ornamental Plants of Hainan， Haikou， Hainan 570228， China; 4. Hainan Sub-platform of National Forest Genetic Resources Platform， Danzhou， Hainan 571737， China

Abstract： Artocarpus heterophyllus is a tropical fruit， and so far there are few reports on its mutants. In this study， the leaves of A. heterophyllus were used as the experimental materials to explore the possible reasons for the albinism and regreening of the leaves. The contents of chlorophyll and chlorophyll precursors in leaf mutants and normal green leaves were determined by conventional methods. The activity of chlorophyllase was determined by Elisa kit. The ultrastructure of chloroplast was observed by a transmission electron microscope. Chlorophyll a content， chlorophyll b content， total chlorophyll content and carotenoid content produced by different leaf colors were significantly different. There was no significant difference in the content of chlorophyll synthesis precursors between the mutant and the normal green leaves. In the determination of chlorophyll enzyme activity of the leaves， although there was a significant difference in its activity， it had no significant effect on the difference in chlorophyll content. When observing the ultrastructure of chloroplasts in the leaves， it was found that the chloroplasts in the normal green leaves were intact and had a large number， and the internal structure of chloroplasts in the albino leaves and the regreening leaves was defective， because the chloroplast grana construction stage was blocked. Based on the determination of chlorophyll， chlorophyll precursor content and chlorophyll enzyme activity in the leaves， the ultrastructure of chloroplast in the leaves was observed， and the data were compared and analyzed. In this study， it was speculated that during the chlorophyll synthesis stage， the blocked synthesis of chlorophyll by pchlide and the poor chloroplast development led to the albinism and regreening of A. heterophyllus， which would provide a theoretical basis for further comprehensive study of A. heterophyllus mutants.

Keywords： Artocarpus heterophyllus; chlorophyll; chlorophyll precursor substance; chlorophyll enzyme activity; ultrastructure

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.10.025

植物的白化病會導致植株生長緩慢，矮化甚至死亡。植物產(chǎn)生的白化現(xiàn)象與植物葉綠體的發(fā)育不良和葉綠素合成途徑受阻都十分相關(guān)[1-2]。植物葉綠體內(nèi)含有多種光合色素，是高等植物進行光合作用的主要場所[3]。葉綠體發(fā)育不良或結(jié)構(gòu)存在缺陷，會使植物葉綠素的合成受到影響，最終導致植物光合過程受阻。葉綠素的合成從起始物質(zhì)L-谷氨酰-tRNA到最終產(chǎn)生葉綠素a和葉綠素b，中間過程涉及多種物質(zhì)和酶的參與[4]，例如，葉綠素前體物質(zhì)中的δ-氨基乙酰丙酸（ALA）、原脫植基葉綠素（Pchl）等，其中任何一種葉綠素前體物質(zhì)的合成受阻，最終都會影響合成的葉綠素含量。例如：鐘小蘭和馬均等[5]在紅苞鳳梨（Ananas bracteatus）金邊嵌合體白化細胞中發(fā)現(xiàn)尿卟啉原含量與正常綠葉相比顯著減少，而其后的前體物質(zhì)含量均顯著地低于正常綠葉前體物質(zhì)的含量，最終導致葉綠素含量顯著下降。在葉綠素合成和降解過程中，如果其中任何一步發(fā)生障礙，就可能導致植物的葉色產(chǎn)生異?，F(xiàn)象。在葉綠素降解過程中，葉綠素酶是一種關(guān)鍵酶，它可以加速葉綠素的降解，因此葉綠素酶活性的高低也會對葉綠素含量產(chǎn)生影響[6]。

目前，關(guān)于植物白化的研究有很多，在一些模式植物中已鑒定出白化病的表型，例如，在木本植物中的茶樹（Camellia sinensis）[7];在草本植物中的煙草（Nicotiana tabacum）[8]、水稻（Oryza sativa）[9]、擬南芥（Arabidopsis thaliana）[10]等，但導致白化病產(chǎn)生的原因，仍未得到充分研究。作為熱帶果樹的波羅蜜（Artocarpus heterophyllus），是海南省重要的經(jīng)濟植物，其帶有白化病的苗木會對其產(chǎn)量造成一定影響。盡管目前有一些關(guān)于波羅蜜白化病的研究，但多集中在幼苗解剖觀察、生理指標的測定和形態(tài)的觀察等[11]，很少有研究關(guān)注到波羅蜜葉綠素合成代謝途徑和葉綠體發(fā)育機制的方面。

由于白化現(xiàn)象和返綠現(xiàn)象在植物形態(tài)中表現(xiàn)出明顯的性狀差異，因此在植物種子培育工作中可以作為一種標記性狀，在植株幼苗期就可觀察性狀差異。另外，植物的白化現(xiàn)象和返綠現(xiàn)象對研究植物的抗病機制也有重要的作用和意義。目前，在波羅蜜葉片突變體篩選抗病基因中也有了相關(guān)研究[12]。因此，本研究以波羅蜜的葉片為研究材料，測定波羅蜜葉片突變體和正常綠葉葉片內(nèi)的葉綠素、葉綠素合成前體物質(zhì)的含量和葉綠素酶活性，觀察植物葉片內(nèi)葉綠體的超微形態(tài)結(jié)構(gòu)，以探究波羅蜜葉片出現(xiàn)白化和返綠現(xiàn)象的可能原因，為進一步探究波羅蜜突變體葉綠素合成代謝途徑、葉綠體發(fā)育機制提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

以波羅蜜的正常苗（正常生長的健康苗）、白化苗（萌芽時即患有白化病的幼苗）及返綠苗（萌芽時患有白化病，在生長發(fā)育一段時間后，葉片出現(xiàn)返綠現(xiàn)象的幼苗）作為研究材料（圖1），波羅蜜的種子收集自海南省儋州市海南大學儋州校區(qū)（1095 E，195 N）。從帶有隱性白化遺傳基因的波羅蜜母株成熟果實中剝離出種子，挑選飽滿的種粒，種植于培養(yǎng)桶中并在室外自然環(huán)境下進行培養(yǎng)。當幼苗生長到30 d后，隨機挑選生長一致的正常苗、白化苗及返綠苗，并選取幼苗頂端向下的第三、第四片生長成熟的葉片作為試驗材料，測定葉綠素含量、葉綠素合成前體物質(zhì)含量及葉綠素酶活性，試驗重復3次以上。

1.2? 葉綠素及其前體物質(zhì)含量的測定

1.2.1? δ-氨基乙酰丙酸含量的測定? δ-氨基乙酰丙酸（ALA）含量測定參照Dei[13]的方法，使用電子天平（AR323CN）稱取新鮮波羅蜜葉片，剪碎、研磨。用Ehrlich-Hg試劑，黑暗條件下顯色15 min，利用分光光度計（ZG-EU-2200R）在波長553 nm測定OD值。

1.2.2? 膽色素原、尿卟啉原Ⅲ、糞卟啉原Ⅲ含量的測定? 膽色素原（PBG）、尿卟啉原Ⅲ（UroⅢ）、糞卟啉原Ⅲ（CoprogenⅢ）含量測定參照Bogorad[14]的方法，稱取新鮮波羅蜜葉片，剪碎并用液氮充分研磨，加入緩沖液提取，利用分光光度計測定波長553 nm、測水相405.5 nm、測鹽酸相399.5 nm處的OD值。

1.2.3? 原卟啉Ⅸ、鎂原卟啉Ⅸ和原脫植基葉綠素含量的測定? 原卟啉Ⅸ（ProtoⅨ）、鎂原卟啉Ⅸ（Mg-ProtoⅨ）原脫植基葉綠素（Pchl）含量的測定參照Hodgins等[15]的方法，稱取新鮮波羅蜜葉片，剪碎、研磨。最后利用全波長酶標儀（BioTek Epoch）測定波長在575、590、628 nm的OD值。1.2.4? 葉綠素含量的測定? 葉綠素含量的測定參照張治安[16]的方法，稱量新鮮波羅蜜葉片，剪碎、研磨、過濾。用紫外分光光度計（UV-1800PC）在波長665、649、470 nm下測定吸光度。

1.3? 葉綠素酶活性的測定

分別取波羅蜜白化葉、正常綠葉和返綠葉的葉片，按照植物葉綠素酶Elisa試劑盒說明書的方法，測定葉綠素酶活性。利用酶標儀（瑞士帝肯IF50）在450 nm波長處測定各孔的OD值。

1.4? 葉綠體超微形態(tài)觀察

為確定波羅蜜葉片中葉綠體結(jié)構(gòu)是否完整，對波羅蜜葉片細胞內(nèi)的葉綠體進行超微結(jié)構(gòu)觀察。參照楊勇驥等[17]的方法，對波羅蜜葉片進行取材及樣品的制備。用萊卡UC-6型超薄切片機進行超薄切片，最后用透射電子顯微鏡（日立HT-7700）觀察，并拍照記錄。

1.5? 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2016軟件進行整理和制表，采用Duncans新復極差法進行顯著性測驗（P<0.05）。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 波羅蜜的葉色觀察

波羅蜜葉片突變體是一個自然突變體，現(xiàn)對其葉片表型性狀進行觀察。如圖2所示，在相同環(huán)境下生長的波羅蜜幼苗，其葉片長、寬的大小表現(xiàn)為白化葉<返綠葉<正常綠葉。波羅蜜白化苗表現(xiàn)出植株葉片全部白化，植株的長勢與正常植株相比較弱;波羅蜜返綠苗呈現(xiàn)出葉片由白色變?yōu)榈G色;波羅蜜的正常苗是在植株的整個生長過程中都表現(xiàn)為綠色。

2.2? 葉綠素及其前體物質(zhì)含量的測定

2.2.1? 葉綠素前體物質(zhì)含量的測定? 為探究波羅蜜葉片葉綠素合成過程中是否發(fā)生障礙（圖3），對葉綠素合成的前體物質(zhì)δ-氨基乙酰丙酸、膽色素原、尿卟啉原Ⅲ、糞卟啉原Ⅲ、原卟啉Ⅸ、鎂原卟啉Ⅸ和原脫植基葉綠素等含量進行測定（表1），將得到的數(shù)據(jù)進行比較和分析。將波羅蜜正常綠葉中各物質(zhì)的含量定為100%，與白化葉、返綠葉測得的含量進行比較（圖4），結(jié)果顯示：波羅蜜葉片突變體和正常綠葉葉綠素前體物質(zhì)含量之間沒有出現(xiàn)顯著性差異（P>0.05）。

2.2.2? 葉綠素含量的測定? 葉綠素是光合色素的一種，在植物光合過程中，它對光能有吸收、轉(zhuǎn)化的作用[18]。測定波羅蜜葉片突變體和正常綠葉的光合色素含量，并對數(shù)據(jù)結(jié)果進行比較分析（表2）。結(jié)果顯示：波羅蜜正常綠葉葉片內(nèi)的葉綠素a（Chl a）、葉綠素b（Chl b）、類胡蘿卜素（Car）含量顯著高于白化葉、返綠葉（P<0.05）;返綠葉葉片內(nèi)的葉綠素a、葉綠素總含量顯著高于白化葉（P<0.05），白化葉、返綠葉葉片內(nèi)的葉綠素b、類胡蘿卜素含量沒有出現(xiàn)顯著性差異（P>0.05）;波羅蜜葉片突變體和正常綠葉的葉綠素a/b、類胡設(shè)正常綠葉各物質(zhì)含量為100%，白化葉、返綠葉的各物質(zhì)含量換算成相應各物質(zhì)含量的百分數(shù)。

蘿卜素/葉綠素總含量的比值也無明顯差異（P> 0.05）（圖5）。結(jié)合圖4和圖5，可以初步推測葉綠素合成在Pchlide→Chlide→Chl a→Chl b之間發(fā)生了障礙。

2.3? 葉綠素酶活性的測定

植物葉綠素的降解過程一般可分為3個階段[19]（圖6）。在葉綠素降解過程中，葉綠素酶是一種關(guān)鍵酶[20]，一般認為，它的活性越高，會加快葉綠素的降解。由圖7可知，正常綠葉葉片內(nèi)的葉綠素酶活性顯著高于白化葉、返綠葉（P<0.05），可達1425.7 U/mL，約為白化葉葉綠素酶活性的2.3倍，約為返綠葉的1.4倍;返綠葉葉片內(nèi)的葉綠素酶活性顯著高于白化葉（P<0.05），可達到994.4 U/mL，約為白化葉葉綠素酶活性的1.6倍（白化葉葉片內(nèi)的葉綠素酶活性為623.6 U/mL）。結(jié)合表2和圖7的數(shù)據(jù)結(jié)果，通過對波羅蜜不同葉色的葉綠素酶活性進行測定，發(fā)現(xiàn)正常綠葉的酶活性最高，其葉綠素的含量也是最多的，說明酶活性的高低沒有對葉綠素含量產(chǎn)生較大的影響;返綠葉的酶活性高于白化葉的酶活性，其葉綠素的含量也高于白化葉，說明葉綠素酶活性的高低不是直接影響葉綠素含量存在差異性的主要因素，而是其葉綠素合成量減少所致。因此可以推測葉綠素降解并不是引起波羅蜜葉片出現(xiàn)白化和返綠現(xiàn)象的主要原因。

2.4? 葉綠體超微形態(tài)觀察

通過觀察波羅蜜葉片內(nèi)葉綠體形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，可以發(fā)現(xiàn)環(huán)境條件變化和波羅蜜葉片之間的適應性[21]。將波羅蜜葉片進行染色制片，觀察葉片內(nèi)葉綠體的形態(tài)結(jié)構(gòu)。由圖8可知，正常綠葉的細胞內(nèi)葉綠體形態(tài)完好且數(shù)量較多，葉綠體膜結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)部片層結(jié)構(gòu)和垛疊層數(shù)都較多，排列整齊且清晰。（圖8A、圖8B）;在白化葉的細胞中，葉綠體數(shù)量極少且內(nèi)部結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯缺陷，葉綠體內(nèi)部結(jié)構(gòu)完全模糊化（圖8C）;返綠葉中的細胞內(nèi)有極少結(jié)構(gòu)較為良好的葉綠體，形狀多為長橢圓形，葉綠體被膜結(jié)構(gòu)完整，含有少量基粒類囊體結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)垛疊大致整齊，但其基質(zhì)類囊體結(jié)構(gòu)排列較為松散（圖8D）;返綠葉中的大多數(shù)葉綠體結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯缺陷，體積膨脹，形狀多為圓形（少數(shù)為長橢圓形），葉綠體膜結(jié)構(gòu)完整，基粒片層結(jié)構(gòu)完全消失，基質(zhì)片層結(jié)構(gòu)排列散亂（圖8E、圖8F）。

3? 結(jié)論

植物葉綠素的合成過程從起始物質(zhì)L-谷氨酰- tRNA到最終產(chǎn)生葉綠素a和葉綠素b一共要經(jīng)歷16步[22]，如果在這個合成途徑中的任何一個環(huán)節(jié)發(fā)生障礙，則障礙之前的前體物質(zhì)會積累，進而導致其含量增加;而其后的物質(zhì)含量會迅速下降。本文通過對一系列前體物質(zhì)含量進行測定，結(jié)果表明：波羅蜜中的白化葉、正常綠葉和返綠葉的前體物質(zhì)含量從δ-氨基乙酰丙酸（ALA）到原脫植基葉綠素（Pchl）并沒有出現(xiàn)顯著性差異，類似的結(jié)論在白肋煙（Burley21）和馬里蘭煙（Md609）葉片中也有發(fā)現(xiàn)，劉彩云等[23]研究發(fā)現(xiàn)在這2種葉片中，其葉綠素前體物質(zhì)的含量之間沒有明顯的差異，但最終形成的葉綠素a、b含量出現(xiàn)顯著差異性。因此，初步認為波羅蜜葉綠素合成的障礙是發(fā)生在Pchlide→Chlide→Chl a→Chl b之間。類似的研究結(jié)果在水稻突變體中也有發(fā)現(xiàn)，徐培洲等[24]研究發(fā)現(xiàn)水稻突變體W1葉綠素合成受阻可能發(fā)生在Pchlide到Chlide。

通過對波羅蜜葉片突變體的前體物質(zhì)含量進行比較分析，發(fā)現(xiàn)波羅蜜的白化葉、正常葉、返綠葉之間沒有顯著差異。介于此，本研究從葉綠素降解的角度，測定比較了波羅蜜不同葉片的葉綠素酶活性的高低。結(jié)果表明，波羅蜜葉片的葉綠素酶活性雖然存在顯著差異，但對其葉綠素含量的差異并沒有產(chǎn)生較大影響，說明葉綠素酶活性的高低不是直接影響葉綠素含量存在差異性的主要因素，而是其葉綠素合成量減少所致。類似的研究結(jié)果，陳友根等[25]曾在甜瓜屬（Cucumis）正反交雜種的葉綠素酶活性測定中，發(fā)現(xiàn)葉綠素降解不是發(fā)生黃葉突變體的主要原因，而是其葉綠素合成量減少所致。

植物葉綠體的發(fā)育大致經(jīng)歷5個階段，包括前質(zhì)體階段、造淀粉體階段、變形蟲狀質(zhì)體階段、前基粒質(zhì)體階段和成熟葉綠體階段[26]。在這個過程中任何一個階段發(fā)生障礙，都可能造成葉綠體發(fā)育不良或者結(jié)構(gòu)存在缺陷。植物葉色突變的產(chǎn)生與葉綠體的發(fā)育不良和葉綠素合成受阻緊密相關(guān)[27-28]。本研究通過觀察波羅蜜葉片內(nèi)的葉綠體超微形態(tài)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)白化葉內(nèi)的葉綠體數(shù)量極少，葉綠體內(nèi)部結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯缺陷，其體內(nèi)結(jié)構(gòu)完全模糊化;返綠葉中的細胞內(nèi)有極少結(jié)構(gòu)較為良好的葉綠體，大多數(shù)葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā)育不良。推測波羅蜜葉片在白化期和返綠期，葉綠體在發(fā)育過程中其基粒構(gòu)建階段受阻，使其發(fā)育不良，進而導致波羅蜜葉片發(fā)生變化。類似的研究結(jié)果在安吉白茶突變體中也有發(fā)現(xiàn)，楊熒等[29]研究發(fā)現(xiàn)安吉白茶是其葉綠體發(fā)育不良而導致安吉白茶葉白化。

4? 結(jié)論

植物葉片表現(xiàn)出的白化現(xiàn)象與植物葉綠體的發(fā)育不良和葉綠素合成途徑受阻都十分相關(guān)。通過測定波羅蜜葉片突變體和正常綠葉的葉綠素、葉綠素合成前體物質(zhì)含量和葉綠素酶活性，并觀察波羅蜜葉片內(nèi)葉綠體的超微形態(tài)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)波羅蜜的白化葉和返綠葉中的葉綠體結(jié)構(gòu)異常，同時葉綠素合成在Pchlide→Chlide→Chl a→Chl b之間發(fā)生了障礙，本研究推測是因為葉綠素合成階段受阻及葉綠體發(fā)育不良導致波羅蜜出現(xiàn)白化和返綠現(xiàn)象。波羅蜜葉片突變體材料對研究波羅蜜的葉綠素合成過程、葉綠體的發(fā)育、光合作用和培育優(yōu)良波羅蜜品種都具有重要意義。因此，對于波羅蜜突變體的葉綠素合成代謝途徑與葉綠體發(fā)育機制，還有待進一步深入研究。

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