許 驥， 方以群， 包曉辰， 袁恒榮， 王 楠， 王芳芳

(海軍軍醫(yī)大學(xué)海軍特色醫(yī)學(xué)中心潛水與高氣壓醫(yī)學(xué)研究室， 上海 200433)

由于核潛艇遂行任務(wù)時(shí)的機(jī)動(dòng)性、隱蔽性以及所處環(huán)境的特殊性，歷史上核潛艇事故多發(fā)生在遠(yuǎn)離潛艇所屬國(guó)的海域，外界很難及時(shí)趕往現(xiàn)場(chǎng)救援，潛艇艇員的自救脫險(xiǎn)就顯得尤為重要[1-3]?？焖偕细∶撾U(xiǎn)作為一種成熟的潛艇艇員自救脫險(xiǎn)技術(shù)，具有脫險(xiǎn)深度大、高壓暴露時(shí)間短、上浮速度快等優(yōu)點(diǎn)，為各國(guó)潛艇部隊(duì)所采用。由于快速上浮脫險(xiǎn)過(guò)程壓力變化極大，如果操作不當(dāng)，脫險(xiǎn)艇員有可能發(fā)生減壓病(decompression sickness，DCS)[4,5]。減壓病是指人體暴露在高氣壓后，回到常壓過(guò)程中，因減壓幅度過(guò)大、速度過(guò)快，溶解于肌體的氣體來(lái)不及隨呼吸排出體外，而在組織和血液中形成氣泡引起的一種疾病。一般來(lái)說(shuō)脫險(xiǎn)深度越大，機(jī)體高壓暴露時(shí)間越長(zhǎng)，發(fā)生減壓病的風(fēng)險(xiǎn)越高[6-8]。而核潛艇失事常伴有輻射事故的發(fā)生，如果艇員遭受超過(guò)安全劑量的輻射會(huì)對(duì)機(jī)體造成損傷，理論上有可能增加快速上浮脫險(xiǎn)的風(fēng)險(xiǎn)，但目前相關(guān)研究很少。本研究采用大鼠模擬不同劑量核輻射后不同時(shí)間大深度快速上浮脫險(xiǎn)過(guò)程，觀察實(shí)驗(yàn)后動(dòng)物減壓病的發(fā)生情況，檢測(cè)肺濕干重比(W/D)、脾指數(shù)以及血漿IL-1β濃度變化，并分析相關(guān)性以及對(duì)機(jī)體的影響，為后續(xù)失事核潛艇艇員核輻射減壓病復(fù)合傷的監(jiān)測(cè)與防治研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組

雄性成年SD大鼠80只，平均體重(280.7±28.7)g，購(gòu)自上海畢凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司[許可證號(hào)：SCXK(滬)2018-0006]。隨機(jī)分為空白對(duì)照組、脫險(xiǎn)對(duì)照組和6個(gè)干預(yù)組： 4 Gy輻射后4 h脫險(xiǎn)組，6 Gy輻射后4 h脫險(xiǎn)組、12 Gy輻射后4 h脫險(xiǎn)組、4 Gy輻射后8 h脫險(xiǎn)組、6 Gy輻射后8 h脫險(xiǎn)組、12 Gy輻射后8 h脫險(xiǎn)組，每組10只。動(dòng)物先于海軍特色醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心適應(yīng)性飼養(yǎng)一周再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 設(shè)備儀器與試劑

動(dòng)物脫險(xiǎn)訓(xùn)練艙購(gòu)自煙臺(tái)宏遠(yuǎn)公司，低溫高速離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Sigma公司，電子天平購(gòu)自上海奔普公司，大鼠血漿IL-1β酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢伊萊瑞特公司。

1.3 核輻射

60只干預(yù)組大鼠先在海軍軍醫(yī)大學(xué)輻射中心接受輻射劑量分別為4 Gy、6 Gy、12 Gy的60Co γ射線全身外照射。

1.4 加減壓方案

輻射結(jié)束取回大鼠，按照預(yù)先分組分別在輻射4 h或8 h后送入海軍特色醫(yī)學(xué)中心動(dòng)物脫險(xiǎn)訓(xùn)練艙進(jìn)行快速上浮脫險(xiǎn)實(shí)驗(yàn)。采用本研究室前期實(shí)驗(yàn)確定的大鼠150 m快速上浮脫險(xiǎn)減壓病方案(高壓暴露時(shí)間略長(zhǎng)于該深度安全脫險(xiǎn)極限，發(fā)病率約30%)。由艙控計(jì)算機(jī)按預(yù)設(shè)自動(dòng)化程序，使用壓縮空氣以指數(shù)倍數(shù)增壓方式(每4 s艙內(nèi)壓力增加一倍)在16 s內(nèi)快速加壓到150 m水深壓力(即表壓1.5 MPa)，穩(wěn)壓停留137 s，以30 kPa/s的速率減壓至常壓后(圖1)，從艙內(nèi)取出實(shí)驗(yàn)動(dòng)物?？瞻讓?duì)照組大鼠不輻射、不進(jìn)行快速上浮脫險(xiǎn)；脫險(xiǎn)對(duì)照組大鼠不輻射，但快速上浮脫險(xiǎn)方案與干預(yù)組相同。

1.5 減壓病發(fā)病率及死亡率觀測(cè)

大鼠出艙后先進(jìn)行30 min的行為學(xué)觀察。減壓病判斷標(biāo)準(zhǔn)：行走困難、不正常呼吸、前肢和/或后肢癱瘓、翻滾、驚厥、死亡。記錄減壓病發(fā)病率、死亡率以及死亡時(shí)間。再將大鼠用3%戊巴比妥鈉溶液麻醉，收集肺臟及脾臟組織。

1.6 標(biāo)本采集和指標(biāo)測(cè)定

1.6.1 IL-1β檢測(cè) 大鼠實(shí)驗(yàn)前稱量體重并記錄。動(dòng)物麻醉后心臟穿刺法采血約4 ml置于抗凝管中，4℃，5 000 r/min，離心10 min分離血漿，按試劑盒說(shuō)明書各步驟檢測(cè)血漿中IL-1β濃度。

1.6.2 肺濕干比及脾指數(shù)檢測(cè) 取大鼠右肺及脾臟，用濾紙吸干表面污血后，放在小片稱量紙上，用電子天平稱量肺濕重、脾重，再將肺放入烘箱內(nèi)80℃干燥24 h后取出，用電子天平稱量肺干重，計(jì)算肺W/D(肺W/D=肺濕重/肺干重)和脾指數(shù)(脾指數(shù)=脾重/體重×10 000)。

1.6.3 (HE)染色 取左上肺葉，置4%多聚甲醛(4℃)中過(guò)夜。石蠟包埋，切片，貼片。一部分切片采用蘇木精及伊紅染色后，行常規(guī)病理分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為學(xué)觀察

大鼠輻射后躁動(dòng)不安，出現(xiàn)頻繁出現(xiàn)舔毛、扒搔等行為(急性放射性損傷皮膚效應(yīng))，1～2 h動(dòng)物行為逐漸恢復(fù)正常。4 h內(nèi)未見脫毛、嘔吐、腹瀉、口鼻肛門出血等癥狀，無(wú)動(dòng)物死亡。

大鼠快速上浮脫險(xiǎn)后呼吸急促，部分動(dòng)物在15 min內(nèi)出現(xiàn)瘙癢抓撓、行走障礙、肢體癱瘓等典型的減壓病癥狀，甚至抽搐、死亡。發(fā)病動(dòng)物持續(xù)觀察30 min癥狀未見緩解。

2.2 大鼠輻射對(duì)快速上浮脫險(xiǎn)肺組織病理學(xué)改變的影響

肺組織HE染色顯示，相對(duì)于空白對(duì)照組(圖1)，脫險(xiǎn)對(duì)照組肺組織出現(xiàn)間質(zhì)輕度水腫，紅細(xì)胞散在分布在肺間質(zhì)，肺泡腔內(nèi)未見紅細(xì)胞。4 Gy暴露4 h后脫險(xiǎn)組肺組織水腫明顯，可見大量的紅色粘液分布在肺泡腔及肺間質(zhì)，肺泡腔內(nèi)可見少量散在紅細(xì)胞，同樣的病理特征存在6 Gy暴露4 h后脫險(xiǎn)的大鼠肺組織中。而4 Gy、6 Gy暴露4 h后脫險(xiǎn)組的肺組織水腫比暴露8 h后脫險(xiǎn)組顯著，但后者可見較多紅細(xì)胞聚集在肺間質(zhì)中。12 Gy暴露4 h及8 h后脫險(xiǎn)組的肺組織顯示水腫及肺出血均比較顯著(圖1)。

Fig. 1 Pathological changes of lung tissues in each group

2.3 大鼠輻射對(duì)快速上浮脫險(xiǎn)致減壓病的發(fā)病例數(shù)及死亡例數(shù)的影響

各組大鼠脫險(xiǎn)后發(fā)生減壓病的情況詳見表1。與脫險(xiǎn)對(duì)照組比較，核輻射后脫險(xiǎn)大鼠的減壓病發(fā)病例數(shù)及死亡例數(shù)明顯上升。和肺組織病理結(jié)果相一致，4 Gy、6 Gy照射4 h后快速上浮脫險(xiǎn)的大鼠發(fā)病例數(shù)和死亡例數(shù)較照射8 h后快速上浮脫險(xiǎn)的高。12 Gy輻射后，4 h及8 h脫險(xiǎn)的大鼠的減壓病的發(fā)病例數(shù)及死亡例數(shù)均比低劑量照射組明顯增高，死亡例數(shù)尤其明顯，且12 Gy輻射后4 h及8 h脫險(xiǎn)的兩組無(wú)明顯區(qū)別(表1)。

Tab. 1 Incidence of DCS and mortality in rats (n=10)

2.4 大鼠輻射對(duì)快速上浮脫險(xiǎn)肺W/D、脾指數(shù)以及血漿IL-1β濃度的影響

與空白對(duì)照組比較，脫險(xiǎn)對(duì)照組大鼠肺W/D、脾指數(shù)以及血漿IL-1β濃度無(wú)顯著性變化，而各輻射干預(yù)組大鼠肺W/D和血漿IL-1β濃度變化呈上升趨勢(shì)，脾指數(shù)變化呈下降趨勢(shì)。

2.4.1 肺W/D顯示：和空白對(duì)照組比較，4 Gy、6 Gy輻射后4 h脫險(xiǎn)組及12 Gy輻射后4 h、8 h脫險(xiǎn)組的肺W/D明顯增高(P<0.05，P<0.01，表 2)，而4 Gy、6 Gy輻射后8 h脫險(xiǎn)組的肺W/D有增高趨勢(shì)，但無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。該結(jié)果和病理組織損傷及減壓病的發(fā)病率及死亡率相一致。

2.4.2 脾指數(shù)顯示：和空白對(duì)照組比較，4 Gy輻射后4 h，6 Gy、12 Gy輻射后4 h及8 h脫險(xiǎn)組的脾指數(shù)均明顯下降(P<0.01)，其中6 Gy輻射后8 h、12 Gy輻射后4 h及8 h脫險(xiǎn)組的脾指數(shù)下降尤其明顯。和脫險(xiǎn)對(duì)照組比較，6 Gy輻射后8 h脫險(xiǎn)及12 Gy輻射后4 h、8 h脫險(xiǎn)組的脾指數(shù)明顯下降(P< 0.01)。

2.4.3 IL-1β結(jié)果顯示：和空白對(duì)照組及脫險(xiǎn)對(duì)照組相比較，4 Gy、6 Gy、12 Gy輻射后4 h、8 h脫險(xiǎn)組血漿IL-1β濃度顯著上升(P<0.05，P<0.01，表 2)。

Tab. 2 Lung W/D, spleen index and plasma IL-1 β levels in rats n=10)

3 討論

機(jī)體不同組織對(duì)核輻射損傷敏感性差異很大，各組織的輻射敏感性與其細(xì)胞的增殖能力成正比，與其分化程度成反比[9]。免疫系統(tǒng)對(duì)輻射非常敏感，較高劑量的輻射會(huì)導(dǎo)致免疫系統(tǒng)功能急劇下降。作為機(jī)體的重要免疫器官，脾臟對(duì)輻射損傷極為敏感[10]。在本研究中，幾乎所有輻射后脫險(xiǎn)組大鼠均出現(xiàn)了脾指數(shù)明顯降低的現(xiàn)象，分析其原因在于較高劑量核輻射會(huì)造成脾臟結(jié)構(gòu)功能的破壞，故數(shù)小時(shí)內(nèi)便可出現(xiàn)脾臟明顯萎縮。相對(duì)于空白對(duì)照組，4 Gy照射后4 h脫險(xiǎn)組的脾指數(shù)明顯下降，而8 h組不明顯，而6 Gy、12 Gy照射后4 h及8 h脫險(xiǎn)組的脾指數(shù)均明顯下降，12 Gy的尤其明顯。該部分結(jié)果也和減壓病的發(fā)病率、死亡率及肺損傷相一致。該部分結(jié)果提示，較低劑量(4 Gy)照射導(dǎo)致的脾損傷可隨時(shí)間延長(zhǎng)自身有所恢復(fù)，但較高劑量，如6 Gy以上的照射，則機(jī)體無(wú)法恢復(fù)。由于脾臟是淋巴細(xì)胞成熟、分化、再循環(huán)的重要場(chǎng)所，能分泌干擾素、補(bǔ)體、細(xì)胞因子等重要免疫活性物質(zhì)，與體液免疫和細(xì)胞免疫均有密切的關(guān)系，在機(jī)體的免疫功能中具有重要作用[11-13]，因此核輻射后脾指數(shù)下降所反映的機(jī)體免疫機(jī)能下降，對(duì)核潛艇核事故后脫險(xiǎn)艇員并發(fā)癥預(yù)后的影響不可忽視。

肺屬于對(duì)核輻射中度敏感的器官，較高劑量的核輻射易造成放射性肺損傷，放射性肺損傷早期表現(xiàn)為組織充血水腫、滲透增加等炎癥反應(yīng)[14]。同時(shí)肺也是減壓病的重要靶器官，學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)為減壓病是機(jī)體高氣壓暴露時(shí)間超過(guò)一定時(shí)限后，減壓速度過(guò)快造成體內(nèi)溶解的惰性氣體大量析出而引起的[15,16]?？焖偕细∶撾U(xiǎn)過(guò)程肺內(nèi)壓力變化劇烈，前期核輻射造成的肺損傷會(huì)導(dǎo)致氣體交換功能下降，不利于惰性氣體脫飽和，更易加劇快速上浮脫險(xiǎn)減壓病的風(fēng)險(xiǎn)。故核輻射和減壓病在肺損傷上有可能出現(xiàn)疊加效應(yīng)，放射性肺損傷有可能增加后續(xù)快速上浮脫險(xiǎn)減壓病的風(fēng)險(xiǎn)。在本研究結(jié)果中，使用相同的快速上浮脫險(xiǎn)方案，與空白對(duì)照組相比，無(wú)輻射的脫險(xiǎn)對(duì)照組大鼠肺W/D無(wú)顯著性改變，而4 Gy、6 Gy、12 Gy輻射后4 h脫險(xiǎn)組大鼠肺濕干重比卻升高顯著(P<0.05，P<0.01)，證明核輻射與快速上浮脫險(xiǎn)減壓病對(duì)肺損傷的確存在復(fù)合效應(yīng)。4 Gy、6 Gy輻射后4 h組大鼠肺W/D較空白組明顯增高，而4 Gy、6 Gy輻射后8 h組無(wú)顯著性差異，而12 Gy輻射后4 h、8 h脫險(xiǎn)組大鼠肺W/D均顯著高于空白組。這部分結(jié)果提示輻射劑量不超過(guò)6 Gy的輻射，對(duì)大鼠造成的肺損傷，在4 h～8 h之間可得到部分緩解，而12 Gy輻射造成的大鼠肺損傷過(guò)于嚴(yán)重，很難自愈。同時(shí)我們觀測(cè)到各組肺W/D指數(shù)與減壓病發(fā)病率、死亡率及肺組織病理?yè)p傷呈一致性。該現(xiàn)象提示肺組織損傷與快速上浮脫險(xiǎn)減壓病發(fā)病率之間存在顯著相關(guān)性，證明放射性肺損傷的確會(huì)增加快速上浮脫險(xiǎn)減壓病的風(fēng)險(xiǎn)。該部分結(jié)果也與我們前期發(fā)現(xiàn)的快速上浮脫險(xiǎn)減壓病以心肺損傷為主相一致[17]。

放射性肺炎的分子學(xué)機(jī)制很復(fù)雜，大量研究表明多種細(xì)胞因子(IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、TGF-β、TNF-α等)在放射性肺炎發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用[18-20]。IL-1β是出現(xiàn)在局部或全身炎癥反應(yīng)早期的一種重要的促炎細(xì)胞因子，由激活的單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、表皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等分泌，受Toll樣受體/Nod樣受體通路及Caspase-1通路進(jìn)行調(diào)節(jié)和激活，可以通過(guò)誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)和活性自由基的釋放擴(kuò)大炎癥反應(yīng)[21]。血漿IL-1β增加，會(huì)進(jìn)一步誘導(dǎo)其它炎性介質(zhì)的釋放，加劇炎癥反應(yīng)，更易誘發(fā)減壓病。在我們的實(shí)驗(yàn)中，所有輻射干預(yù)組大鼠快速上浮脫險(xiǎn)后血漿IL-1β濃度較無(wú)輻射的脫險(xiǎn)對(duì)照組均顯著升高且各輻射脫險(xiǎn)組之間IL-1β的值無(wú)明顯區(qū)別。說(shuō)明輻射對(duì)快速上浮脫險(xiǎn)后機(jī)體的炎癥反應(yīng)有疊加效應(yīng),且低劑量輻射對(duì)炎癥因子就有很強(qiáng)的誘導(dǎo)反應(yīng)。在本實(shí)驗(yàn)中，因時(shí)間及研究經(jīng)費(fèi)問(wèn)題，未檢測(cè)其余和肺損傷相關(guān)的炎癥因子，如TNF-α、TGF-β等，該部分炎癥因子也是肺損傷導(dǎo)致的炎癥因子風(fēng)暴中重要組成部分，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將進(jìn)一步探討。

綜上所述，核輻射引起放射性肺損傷、免疫功能下降及血漿炎癥因子濃度升高會(huì)增加大鼠快速上浮脫險(xiǎn)減壓病的風(fēng)險(xiǎn)。在較低劑量照射(4 Gy)以下，輻射引起的肺損傷、脾指數(shù)下降將隨著暴露后時(shí)間的延長(zhǎng)，機(jī)體有所恢復(fù)，但在較高劑量(6 Gy)以上，機(jī)體將無(wú)法自行恢復(fù)，加重快速上浮脫險(xiǎn)減壓病的發(fā)病率及死亡率。