黃燕云， 高 潔， 張利娜， 杜相欣， 張雨彤， 郭 霞， 郝 娜， 李建國， 張 宇△

(1. 細胞生理學教育部重點實驗室， 2. 山西醫(yī)科大學生理學系， 太原 030001)

膜片鉗技術在1976年由德國科學家Nether和Sakmann 發(fā)明，他們首次在青蛙肌細胞上用雙電極鉗制膜電位的同時記錄到乙酰膽堿激活的單通道離子電流[1]。這種技術通過記錄細胞膜上單個或幾個離子通道開放或關閉引起的電流變化來研究細胞生理功能，已被廣泛應用于生命科學領域，尤其是神經科學的許多方面。如記錄在腦內功能活動時神經元興奮性的變化，神經信號的產生和傳導，神經環(huán)路中突觸的傳遞過程等研究中[2-6]。全細胞記錄模式下可以獲得細胞膜上所有離子通道的綜合特性，能夠揭示細胞的電生理狀態(tài)，進而為研究細胞之間信號傳遞提供有力的參考信息[7]。由于膜片鉗實驗在操作時存在一定的技術難度，初學者在實驗時總是會遇到各種各樣的問題，需要一些經驗交流。因有關膜片鉗技術的原理和應用在文獻和書籍中多有展示，本文將不復贅述，這里主要將筆者記錄腦片NMDA電流時的一些經驗體會在這里與大家分享。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

取出生2～3周的雄性SD大鼠(購自山西醫(yī)科大學動物實驗中心)，飼養(yǎng)在溫度為(23±1)℃，濕度(50±5)%，自由進食、進水，12 h～12 h晝夜循環(huán)光照的動物房內，大鼠領養(yǎng)后在實驗室的動物飼養(yǎng)室適應3 d后開始進行實驗。

1.2 實驗試劑及材料

NMDA受體激動劑NMDA(Abcam公司)，NMDA受體拮抗劑AP-V(Abcam公司)、非NMDA受體(AMPA/KA)拮抗劑CNQX(Abcam公司)、GABA受體拮抗劑Bicuculine(碧云天公司)、NaHCO3、KCl、NaH2PO4、CaCl2、MgSO4、HEPES、Glucose、EGTA、K-Gluconate、Na2-phosphocreatine、Na2-ATP、Na3-GTP和Mg-ATP產自美國Sigma公司，帶芯微電極玻璃管GBF150-86-10HP產自美國Sutter公司，一次性使用針灸針0.35mm × 68mm (批號121160120)產自北京中研太和醫(yī)療器械有限公司。

1.3 誘發(fā)腦片神經元NMDA電流的方法

1.3.1 配置誘導NMDA電流的灌流液： NMDA灌流液(內含100 μmol/L NMDA的孵育液)

1.3.2 自制誘導NMDA電流的刺激電極：將兩根針灸針(直徑0.35 mm，長68 mm)刷上絕緣漆，晾干后用砂紙打磨掉兩尖端的絕緣漆，等高并排固定于熱縮管中，兩尖端平行間隔約1 mm左右，從電極尾部分別引出2根導線連接至隔離器，然后將刺激電極固定于一鉛筆粗細的塑料桿上，夾持于微操送達至目標區(qū)域附近(圖1)。

Fig. 1 A homemade stimulation electrode

1.4 試劑配制

對于出生2～3周的未成年實驗動物，離體腦組織可用含蔗糖的ACSF。

切片液蔗糖ACSF配方(mmol/L)： NaHCO326，KCl 2.5，NaH2PO41.25，CaCl20.5，MgSO47，HEPES 5，Glucose 10，Sucrose 210，滲透壓為300～305 mmHg，pH 7.3～7.4。

孵育液配方(mmol/L)： KCl 2.5，CaCl22，NaH2PO41.25，NaCl 124，NaHCO326，Glucose 10，滲透壓為300～305 mmHg，pH 7.3～7.4。

電極內液配方(mmol/L)： K-Gluconate 120，KCl 5，HEPES-K 10，EGTA 5，CaCl20.5，MgSO42，Na2-phosphocreatine 5，Na2-ATP 5，Na3-GTP 4，Mg-ATP 4，滲透壓為290～300 mmHg，pH 7.35～7.45。

1.5 組織切片制備

切片液，孵育液均需提前通入混合氣(95% O2+ 5% CO2)至飽和。取切片液200 ml左右，置于孵育盒中預先冰凍至冰水混合狀(內含小冰晶)，另取一個孵育盒倒入適量孵育液室溫放置并持續(xù)通氣。用1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉后斷頭，快速取腦組織放到提前準備好的冰凍切片液中。培養(yǎng)皿中放濾紙，滴加切片液，腦組織放在濾紙上，吸干水分的同時用刀片修整腦組織，切取實驗需要部位，周圍用溶好的瓊脂包埋，切片厚度為200～300 μm。切片過程中持續(xù)通氣。腦片切出后立刻轉移至ACSF中，室溫孵育1 h即可記錄。

1.6 腦片膜片鉗記錄方法

制備好大鼠腦片后，在全細胞模式下進行電生理記錄。用水平電極拉制儀(P-97，Sutter Instrument Co，Novato，CA)將硼硅酸鹽玻璃電極拉伸(電阻最好小于6 MΩ)。取一腦片置于浴槽中，用蓋網將其壓住。封接前先在低倍物鏡下找到腦片中的所需細胞，然后在高倍浸水物鏡下，通過圖像采集軟件觀察鏡下胞體形態(tài)、軸突走行。選擇合適的目標細胞后，在電腦屏幕上標記定位。在低倍物鏡下通過微電極操縱器調整玻璃電極的位置，并使其帶有正壓入水，記錄入水電阻；在高倍浸水物鏡下，通過圖像采樣逐步引導電極到達細胞中。在可視條件下，結合記錄軟件提供的電極阻抗圖形，適時釋放正壓，并輕施負壓，借助鉗制膜電位水平獲得高阻抗(GΩ級)封接，成功破膜后即可形成全細胞記錄方式。通過膜片鉗放大器(Axopatch 200B，USA)收集數(shù)據(jù)，膜電流以10 kHz數(shù)字化，以2 kHz下濾波，并存儲在個人計算機中用于隨后的分析。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 記錄大鼠腦片神經元的EPSC和AP

制備好腦片后，選擇前扣帶皮層吻側部(rostral anterior cingulate cortex, rACC)腦區(qū)合適的神經元進行記錄。破膜后，在電壓鉗模式下，將細胞鉗制在-60 mV下，記錄神經元的自發(fā)放電活動，興奮性突觸后電流(excitatory postsynaptic current, EPSC)，而后在電流鉗模式下，I=0時記錄神經元的動作電位(action potential, AP)。此步可在正式記錄前判斷神經元的狀態(tài)(圖2)。

Fig. 2 A showed the recorded EPSC on a neuron, B showed the AP

2.2 直接灌流含NMDA孵育液與給予電刺激誘發(fā)NMDA電流幅度的比較

本文比較了在灌流液中直接給予激動劑NMDA與自制刺激電極兩種方式來誘發(fā)NMDA電流。選擇rACC腦區(qū)的神經元，將其鉗制在+40 mV，通過重力給藥系統(tǒng)灌流NMDA(100 μmol/L)得到的電流，給予NMDA受體拮抗劑AP-V(50 μmol/L)后，電流受到明顯抑制，孵育液洗脫后電流幅度明顯恢復(圖3A)；刺激電極給予電壓3 V，間隔10 s發(fā)放一次刺激誘發(fā)的電流，給予NMDA受體性拮抗劑AP-V(50 μmol/L)后，電流受到明顯抑制，孵育液洗脫后電流恢復(圖3B)。實驗證明二者誘發(fā)的電流都為NMDA電流，且二者誘發(fā)的NMDA峰值電流幅度分別為NMDA組(282.0±24.3)pA VS 自制刺激電極組(261.4±40.1)pA，統(tǒng)計學無明顯差異(P>0.05，n=4)。

Fig. 3 Comparison of two ways to generate NMDA currentsA: The curves of the induced NMDA current were shown after an agonist NMDA (100 μmol/L) administration; B: The curves of the excited NMDA current were shown after electrical stimulation

2.3 兩種刺激電極誘發(fā)的NMDA電流幅度的比較

自制刺激電極通過利用一次性使用針灸針改造而成，為了檢測自制刺激電極的可靠性，將其與進口刺激電極進行了對比。每組腦片均在rACC腦區(qū)選擇大小形態(tài)類似的神經元各4個，記錄給予電刺激前后NMDA電流的變化。刺激電壓3 V，間隔10 s發(fā)放一次刺激。結果顯示兩種刺激電極誘發(fā)的NMDA電流幅度大小分別為進口刺激電極組(267.2± 36.5)pA VS自制刺激電極組 (239.2±41.0)pA，無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖4，n=4)。

Fig. 4 Comparison to the NMDA currents were respectively stimulated at +40 mV potential by an electrode from abroad (A) and a homemade one (B) in incubation fluid withBicuculine (100 μmol/L) and CNQX (20 μmol/L)

3 討論

與單細胞膜片鉗相比較，腦片膜片鉗有前者無法比擬的優(yōu)點。由于腦片中保存了部分的神經纖維聯(lián)系，它在一定程度上為神經元提供了接近生理狀態(tài)下的環(huán)境，這樣記錄的實驗結果也更接近于真實。另外，在腦片上確定目標神經元，也從視覺上可以識別或明確它在大腦中的具體位置。

目前全細胞膜片鉗技術已廣泛應用于各種器官或細胞的科學研究[8,9]，例如心肌成纖維細胞以及腦片神經元，但對該技術掌握還有一定的難度。對于腦片膜片鉗實驗，首要是保證腦片的活性。本實驗發(fā)現(xiàn)：(1)年齡較大的動物(4周齡以上)需先在30℃左右的混合液中孵育30 min，之后移到室溫的灌流液中孵育90 min，細胞的狀態(tài)較好，而鼠齡較小的，如小于3周的動物切片后直接在室溫孵育1 h即可記錄。(2)腦片孵育過程中，氣流不應過大，以免將腦片吹起，造成腦片翻滾；但氣流也不宜過小，過小會導致腦片供氧量不足；腦片之間切忌相互重疊，更不能讓氣泡直接接觸腦片。在腦片放入孵育盒后，也不要隨意移動腦片的位置。(3)在孵育過程中，如果發(fā)現(xiàn)腦片變白(正常應為淡黃色)、腦片打卷不易舒展，說明腦片活性較低。腦片變白可能為缺氧時間過長，即混合氣中O2的比例偏低或氣流過小。腦片打卷可能是因為腦片厚度較薄或厚薄不均勻所致。腦片不易舒展可能是孵育液的滲透壓不合適。(4)腦片孵育盒中的液體量不必太多，液面可沒過腦片3～5 mm高度即可，這樣既可以保證腦片的供氧，維持液體的pH，也不浪費液體。

在給藥方式上，本研究先后嘗試了重力灌流給藥和局部微量給藥兩種方式。結果發(fā)現(xiàn)，局部微量給藥的優(yōu)點是快速、節(jié)省試劑。該方法雖然可以快速將設定濃度的藥物送至靶細胞附近發(fā)揮作用，但是由于受到目標細胞周圍組織的影響，藥物擴散至細胞發(fā)揮作用的穩(wěn)定性不佳，因此局部微量給藥更適合急性分離或培養(yǎng)細胞的膜片鉗實驗。重力灌流給藥具有藥物可對細胞充分作用、細胞有更穩(wěn)定反應的優(yōu)點，但是它有藥物發(fā)揮作用時間長、比較浪費昂貴試劑的缺點，而且由于藥物作用的影響，一張腦片只能記錄一個細胞在藥物干預前后的電流變化。

研究中在記錄NMDA電流時[10,11]，嘗試了電刺激誘導NMDA電流的方法。該方法具有細胞反應快速、穩(wěn)定，節(jié)省試劑，避免了藥物灌流誘導電流時對腦片其它神經元的影響，這樣一張腦片就可記錄多個神經元的NMDA電流。實驗中要注意需將刺激電極置于靠近目標區(qū)域的位置。在實驗初期因本實驗室無刺激電極，就利用針灸針自制了刺激電極，成功誘導出穩(wěn)定的NMDA電流。后期獲得了國外的刺激電極，其誘導出的NMDA電流與我們自制電極誘導的NMDA電流大小比較無統(tǒng)計學意義。從我們的實驗結果來看，自制的刺激電極也可以成功的誘發(fā)NMDA電流，自制的刺激電極具有更加方便、廉價、易獲得的優(yōu)點。刺激電極制作時要注意，兩根針灸針靠近的部位要刷絕緣漆，防止接入刺激器正負極時發(fā)生短路；而電極的尖端，即給腦片施加電刺激的尖端則要避免被絕緣漆包裹，正負極尖端之間的間隔大約1 mm。由于進口刺激電極價格昂貴且不易購買到，本實驗室通過多次嘗試摸索出一種自制腦片刺激電極的方法。通過自制電極誘發(fā)的NMDA電流與受體激動劑誘發(fā)的電流以及進口電極誘發(fā)的電流相比，結果高度一致且穩(wěn)定性好，說明自制電極的制作是成功的。這為經費不很充足的實驗室記錄NMDA電流或開展類似實驗提供了可行途徑。

隨著技術的發(fā)展與進步，將膜片鉗技術與其它技術，尤其是一些新興技術相結合來解決科學問題已是未來研究的趨勢。例如將膜片鉗與原子力顯微鏡、激光掃描共聚焦顯微鏡、雙光子顯微鏡、熒光探針、分子生物學技術等其他檢測技術結合應用。這些技術不僅提高了細胞電生理探測的分辨率及靈敏度，還可以同時獲取細胞的電生理信息和各種與之相對應的力學或分子生物學信息，極大地彌補了膜片鉗技術檢測信號單一的缺點[12-14]。因此，膜片鉗技術仍然是生命科學研究中具有獨特作用的必備手段。