朱明了， 鄭 珍， 樓恩哲， 趙凱婷， 何施燕， 陳佳玉

(紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院， 浙江 紹興 312000)

胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一。在我國，胃癌的發(fā)病率和死亡率均居于癌癥的第二位[1]。每年，全球有723 000名患者死于胃癌[2]，晚期胃癌患者的5年生存率低[3]。由于缺乏早期胃癌特異性診斷指標(biāo)，且胃癌早期臨床癥狀不明顯，胃癌患者確診時(shí)往往已到了腫瘤進(jìn)展晚期[1]，而現(xiàn)有治療方案和藥物因其具復(fù)發(fā)率高、副作用大、治療成本高等缺點(diǎn)，無法實(shí)現(xiàn)對(duì)胃癌患者真正意義上的治療，因此，尋找對(duì)胃癌有治療作用、毒副作用低的藥物一直是胃癌防治研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

大蒜是一種重要的藥食兼用植物，具有抗心血管疾病、抗腫瘤、殺菌等功效[4-6]，價(jià)格低廉，無毒副作用。大蒜阿霍烯為大蒜的成份之一，有研究資料已證明它可抑制多種腫瘤如食管癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等細(xì)胞的增殖，并可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7-10]，但該成分對(duì)胃癌細(xì)胞MGC-803的作用尚未見報(bào)道。據(jù)報(bào)道，胃癌細(xì)胞可通過PI3K-AKT-mTOR、RAS-RAF-MEK-ERK通路發(fā)生凋亡[11,12]，為研究大蒜阿霍烯抗胃癌的分子機(jī)制提供了思路。本文擬通過研究大蒜阿霍烯對(duì)胃癌細(xì)胞MGC-803的增殖、凋亡和周期的影響，證實(shí)大蒜阿霍烯對(duì)胃癌的治療作用，并揭示其作用的相關(guān)分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

CCK-8染色液(同仁，日本)；FITC/PI apoptosis assays kit(BD，美國)；細(xì)胞線粒體膜電位JC-1檢測(cè)試劑盒(天晶公司，上海)；RPMI 1640培養(yǎng)液、 0.25% Trypsin、和Fetal Bovine serum(FBS)(Gibco，美國)；TRIzol? Reagent、SuperScript? III First-Strand(Invitrogen，美國)；Hoechst 33342(Solarbio，上海)；乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒、(29∶1)聚丙烯酰胺(Acrylamide)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、四甲基二乙胺(TEMED)、pH 8.8 Tris-HCL溶液、pH 6.8 Tris-HCL溶液、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、超敏ECL化學(xué)發(fā)光顯色液(碧云天，上海)；其他的試劑均為國產(chǎn)分析純。實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞來源于上海中科院細(xì)胞所；BALB/C小鼠購自浙大實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。大蒜阿霍烯購自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

用含10% FBS的RPMI 1640完全細(xì)胞培養(yǎng)液在37℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)胃癌細(xì)胞株MGC-803。待其處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段時(shí)，0.25%胰酶消化細(xì)胞， 1 000 r/min離心5 min, 回收細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞2次，棄上清，用含有10% FBS的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞密度為1×104cells/ml，將其加到96孔培養(yǎng)板中，100 μl/well，于37℃ 5% CO2培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，于培養(yǎng)液中加入大蒜阿霍烯，使其終濃度分別為0 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、25 μmol/L和125 μmol/L，設(shè)三復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h和72 h時(shí)，用CCK8染色試劑盒染色后，通過酶標(biāo)儀(490 nm)檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。

1.3 JC-1染色法分析細(xì)胞膜電位

取上述細(xì)胞密度為1×104cells/ml的MGC-803，置于96孔板中，100 μl/well，設(shè)兩復(fù)孔，5% CO237℃條件下培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到80%。棄上清，分別加入含有0 μmol/L、25 μmol/L大蒜阿霍烯的細(xì)胞完全培養(yǎng)液100 μl, 37℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。棄上清，用PBS洗滌細(xì)胞2次，每孔加入50 μl細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液和50 μl JC-1染色工作液，混勻。37℃ 5% CO2條件下孵育20 min。用冰上預(yù)冷的JC-1染色緩沖液洗滌細(xì)胞2次，每孔加入100 μl細(xì)胞培養(yǎng)液，置于熒光倒置顯微鏡下觀察。

1.4 Hoechst染色觀察細(xì)胞核型

取融合度為80%的MGC-803細(xì)胞六孔板，加入含有0 μmol/L、25 μmol/L、125 μmol/L大蒜阿霍烯的細(xì)胞完全培養(yǎng)液2 ml，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。棄上清，PBS洗滌細(xì)胞3次。每孔加入1 ml 10 ng/ml Hoechst 33342，37℃避光孵育10 min，棄上清，PBS洗滌細(xì)胞3次，置于熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞核型的變化。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期

取融合度為80%的MGC-803細(xì)胞，分別加入含有0 μmol/L、25 μmol/L、125 μmol/L大蒜阿霍烯的細(xì)胞完全培養(yǎng)液，37℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。胰酶消化細(xì)胞后用4℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每次于4℃條件下300 g離心5 min，回收細(xì)胞。取1×105的細(xì)胞，F(xiàn)ITC和PI雙染并洗滌后，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，具體操作見試劑說明書。取1×105的細(xì)胞，冰浴預(yù)冷的70%乙醇4℃條件固定2 h，4℃ 1 000 r/min離心5 min，棄上清。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，棄上清。加入100 μl 含有RNase A 的PI染液，避光孵育20 min。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，分析細(xì)胞周期變化。

1.6 LDH釋放法分析細(xì)胞毒性

將1×104cells/ml的MGC-803細(xì)胞接種6孔板，2 ml/well，37℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到80%，加入大蒜阿霍烯，使其最終濃度為 0 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、25 μmol/L、125 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，設(shè)3復(fù)孔。按照LDH檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行樣本檢測(cè)。

1.7 RT-qPCR分析基因轉(zhuǎn)錄水平的改變

用含有0 μmol/L和25 μmol/L大蒜阿霍烯作用于80%融合度的MGC-803細(xì)胞24 h，按照Trizol試劑說明書提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)Nanodrop定量。取5 μg總RNA，用SuperScript? III First-Strand Synthesis System 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，在12.5 μl Power SYBR? Green PCR Master Mix(2×)反應(yīng)體系中檢測(cè)、上下游引物各2 μl(10 μmol/L)、模版1 μl，加ddH2O補(bǔ)至25 μl，混勻。置于熒光定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)參數(shù)為95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 60 s，共40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，采用2-△△CT法分析大蒜阿霍烯作用后基因轉(zhuǎn)錄水平的變化。

1.8 Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)

用0 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、25 μmol/L、125 μmol/L的大蒜阿霍烯分別作用于80%融合的MGC-803細(xì)胞24 h，收集細(xì)胞，加入含有1 mmol/L PMSF的RIPA裂解液500 μl，作用5 s，4℃ 12 000 r/min離心5 min。取上清，BCA法進(jìn)行蛋白定量。取20 μg蛋白樣本進(jìn)行Western blot，Image Quant LAS 4 000 mini超靈敏化學(xué)發(fā)光成像儀分析細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)水平的變化。

1.9 小鼠抑瘤實(shí)驗(yàn)

取PBS洗滌3次后的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MGC-803細(xì)胞，調(diào)整其細(xì)胞濃度為2×107cells/L，腹股溝皮下接種100只4周齡雄性BALB/C鼠，0.1 ml/只。接種兩天后，將動(dòng)物分組，每組20只，分別經(jīng)皮下注射濃度為0 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、25 μmol/L、125 μmol/L的大蒜阿霍烯，0.1 ml/次，隔天注射一次，并于首次注射腫瘤細(xì)胞的第20日每組殺10只，取瘤組織，稱重。記錄剩余小鼠的存活期。

2 結(jié)果

2.1 大蒜阿霍烯對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響

濃度為0 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、25 μmol/L、125 μmol/L的大蒜阿霍烯作用于MGC-803細(xì)胞0 h、24 h、48 h、72 h，MTS法檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性。結(jié)果如圖1，大蒜阿霍烯能顯著抑制胃癌MGC-803細(xì)胞增殖活性(P<0.01)，其作用效果與藥物作用時(shí)間和濃度相關(guān)。

Fig. 1 Theeffects of Z Ajoene on proliferation activity of MGC-803 cells(n=3)

2.2 大蒜阿霍烯對(duì)MGC-803細(xì)胞線粒體膜電位的影響

胃癌細(xì)胞MGC-803經(jīng)25 μmol/L的大蒜阿霍烯作用24 h，JC-1染色，結(jié)果如圖2，MGC-803細(xì)胞線粒體膜電位下降。

Fig. 2 The effects of Z Ajoene on cell mitochondrial membrane potential of MGC-803 cells by JC-1 staining(×10)(n=3)

2.3 大蒜阿霍烯對(duì)細(xì)胞核型的影響

不同濃度大蒜阿霍烯作用MGC-803細(xì)胞24 h，經(jīng)Hoechst 33342染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大量細(xì)胞發(fā)生核濃縮、染色質(zhì)凝集，并形成了凋亡小體(圖3)。

Fig. 3 The effects of Z Ajoene on nucleus of MGC-803 cells by 33342 staining(n=3)

2.4 大蒜阿霍烯對(duì)細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期的影響

如圖4A所示，MGC-803細(xì)胞經(jīng)25 μmol/L和125 μmol/L大蒜阿霍烯作用24 h后，早期細(xì)胞凋亡比例分別為31.4%和44.1%，較未用藥的對(duì)照組(0.1%)明顯增加。如圖4B所示，經(jīng)25 μmol/L大蒜阿霍烯處理后，MGC-803細(xì)胞處于G2期的細(xì)胞所占比例(8.2%)較未用藥處理組(19.05%)明顯降低，且處于sub-G1期的細(xì)胞所占比例(11.63%)較未用藥處理組(0.53%)明顯增加。說明大蒜阿霍烯可將MGC-803細(xì)胞阻滯于G1期，并能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

Fig. 4A The apoptosis results detected by flow cytometry(n=3)

Fig. 4B The cell cycle results detected by flow cytometry(n=3)

2.5 大蒜阿霍烯對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)LDH活性的影響

如圖5所示，MGC-803細(xì)胞經(jīng)不同濃度的大蒜阿霍烯作用24 h后，細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)LDH的活性均較未用藥組明顯升高，且與藥物作用的濃度相關(guān)，差異有顯著意義(P<0.01)，大蒜阿霍烯具有一定細(xì)胞毒作用。

Fig. 5 The effects of Z Ajoene on LDH release of MGC-803 cells(n=3)

2.6 大蒜阿霍烯對(duì)某些基因表達(dá)的影響

MGC-803細(xì)胞經(jīng)25 μmol/L大蒜阿霍烯作用24 h后， Western blot和RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示(圖6A和6B)，基因P53、Caspase-3、BAX的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平均較未用藥組顯著上調(diào)(P<0.01)，而RAS、ERK1、BCL-2、AKT、mTOR和PI3K基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平均明顯受抑(P<0.01)，其藥物作用效果與用藥濃度有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明25 μmol/L大蒜阿霍烯可上調(diào)P53、Caspase-3、BAX的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平，而下調(diào)RAS、ERK1、BCL-2、AKT、mTOR和PI3K基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平。

Fig. 6A The RT-qPCR results(n=3)

Fig. 6B The Western blot results(n=3)

2.7 大蒜阿霍烯對(duì)腫瘤生長(zhǎng)及小鼠存活期的影響

荷有MGC-803細(xì)胞瘤的BALB/C小鼠經(jīng)0 mg/kg、1 mg/kg、5 mg/kg、25 mg/kg和125 mg/kg的大蒜阿霍烯給藥20 d，取瘤組織，稱重。結(jié)果見表1，大蒜阿霍烯可抑制胃癌的生長(zhǎng)，且抑制效果與大蒜阿霍烯作用濃度有關(guān)。同時(shí)大蒜阿霍烯可明顯延長(zhǎng)荷瘤小鼠的存活期(P<0.01)，尤其25 mg/kg大蒜阿霍烯給藥組延長(zhǎng)更為明顯。

Tab. 1 The tumor suppression test n=10)

3 討論

目前許多研究表明，PI3K/AKT/mTOR、RAS/RAF/MEK/ERK信號(hào)通路在胰腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、治療及轉(zhuǎn)歸中起到重要作用[13-15]。資料證實(shí)，當(dāng)細(xì)胞受到外界某些藥物刺激時(shí)，位于細(xì)胞膜上的酪氨酸蛋白激酶受體可被激活，并可通過PI3K的激活，使3，4-二磷酸脂酰肌醇(PIP2)轉(zhuǎn)化為3，4，5-三磷酸脂酰肌醇(PIP3)，PIP3作為第二信使，將信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)。AKT為PIP3的下游關(guān)鍵蛋白，可以調(diào)控多個(gè)與細(xì)胞凋亡有關(guān)的家族，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用?；罨腁KT (p-AKT)可使其下游蛋白mTOR磷酸化，p-mTOR可以通過影響pS6K等核轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化而促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成及細(xì)胞生長(zhǎng)，并通過使細(xì)胞周期抑制劑失活調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖[16]。p-AKT也可以促進(jìn)MDM2蛋白的磷酸化而使P53發(fā)生降解，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖[17]。P53可直接或間接地促進(jìn)BAX活化[18]，活化后的BAX可促進(jìn)線粒體CytC的釋放[19]，進(jìn)而引起Caspase-3活化，對(duì)細(xì)胞凋亡發(fā)揮樞紐作用[20]。而BCL-2的作用則相反，它可通過穩(wěn)定線粒體內(nèi)外膜或與凋亡蛋白酶激活因子1(Apaf-1)結(jié)合，使線粒體外膜透化(MOMP)引起細(xì)胞色素C向胞質(zhì)釋放，結(jié)合并激活胞質(zhì)內(nèi)的銜接蛋白Apaf-1，促發(fā)細(xì)胞凋亡，而引起細(xì)胞死亡[19]。同時(shí)，激活的酪氨酸蛋白激酶受體，將使RAS激酶磷酸化，磷酸化的RAS(p-RAS)可以激活RAS/RAF/MEK/ERK信號(hào)通路，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖[21]。

在本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)不同濃度大蒜阿霍烯作用后的MGC-803細(xì)胞，其細(xì)胞增殖活性和線粒體膜電位均顯著下降，細(xì)胞凋亡率明顯增加。細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果亦證實(shí)，25μM的大蒜阿霍烯可以將MGC-803細(xì)胞阻滯在G2期之前，從而抑制MGC-803細(xì)胞的增殖。Western blot和RT-qPCR結(jié)果證實(shí)P53、Caspase-3、RAS、ERK、BCL-2、AKT、mTOR、PI3K基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)水平均較未用藥組明顯降低，而P53、Caspase-3、BAX等基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)水平均明顯升高。上述蛋白為PI3K/AKT/mTOR和RAS/RAF/MEK/ERK信號(hào)通路中的重要蛋白，因此大蒜阿霍烯可能是通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR和RAS/RAF/MEK/ERK信號(hào)通路蛋白的表達(dá)而抑制MGC-803細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)，大蒜阿霍烯可抑制胃癌生長(zhǎng)，并可延長(zhǎng)荷瘤小鼠生存期。

綜上所述，大蒜阿霍烯可通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR、RAS/RAF/MEK/ERK信號(hào)通路而抑制胃癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。為大蒜阿霍烯抗胃癌的進(jìn)一步研究打下了基礎(chǔ)。