丁茂鵬， 韋凌霞， 王志旺， 程小麗， 龐亞蓉

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué), 蘭州 730000)

在中醫(yī)理論中，肝有“體陰而用陽(yáng)”的生理特點(diǎn)與“陽(yáng)常有余陰常不足”的病理特點(diǎn)，所以“體陰而陰不足”當(dāng)屬肝病的基本病機(jī)[1, 2]。在以上中醫(yī)藥理論的指導(dǎo)下擬定的鱉甲育肝顆粒具有軟肝散積、育陰調(diào)肝之效，臨床上對(duì)肝纖維化有明顯療效。慢性肝病發(fā)展至肝硬化過(guò)程中，肝細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的合成與降解失衡是肝纖維化發(fā)生的主要機(jī)制[3]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)是促肝纖維化的關(guān)鍵因子，可通過(guò)Smads通路激活肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell, HSC)而分泌細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展[4]。本實(shí)驗(yàn)在復(fù)制肝纖維化大鼠模型的基礎(chǔ)上，研究鱉甲育肝顆粒對(duì)肝纖維化的治療作用及對(duì)TGF-β1/Smads信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥理學(xué)教研室提供的鱉甲育肝顆粒(Biejia Yugan Granule, BYG)，由鱉甲、山茱萸、柴胡、黃芩等中藥制成，批號(hào)：20181206；西雙版納版納藥業(yè)責(zé)任有限公司生產(chǎn)的秋水仙堿片(Colchicine)，國(guó)藥準(zhǔn)字：H53021369，批號(hào)：20190203。南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase, AST)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase, ALT)；北京北方生物技術(shù)研究所生產(chǎn)板層素(laminin, LN)、Ⅲ型前膠原(Ⅲprocollagen, PCⅢ)、Ⅳ型膠原(type IV collagen, C-Ⅳ)以及透明質(zhì)酸(hyaluronic acid, HA)ELISA試劑盒；武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)TGF-β1抗體免疫組化試劑盒。其余試劑均為分析純。

1.2 儀器

BI-2000型醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，成都泰盟科技有限公司產(chǎn)品；CFX型Peal-Time熒光定量PCR儀，美國(guó)伯樂(lè)公司產(chǎn)品；S1000TM逆轉(zhuǎn)錄儀，美國(guó)BIO-RAD公司產(chǎn)品；Chemi DOC XRS+凝膠成像分析系統(tǒng)，美國(guó)BIO-RAD公司產(chǎn)品；日本Olympus生產(chǎn)的CH-212型光學(xué)顯微鏡。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠，雌雄各半，體重200～230 g，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所生產(chǎn)，SCXK(甘)2015-0001為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證。飼養(yǎng)在甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SYXK(甘)2015-0005為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施使用許可證。

1.4 造模、給藥

將大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、秋水仙堿組(1.0×10-4g/kg)、鱉甲育肝顆粒各劑量組(1.85、3.70、7.40 g/kg，n=8)。結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)[5]，采用灌胃乙醇并皮下注射四氯化碳的方法來(lái)復(fù)制大鼠肝纖維化模型，在每天灌胃5%乙醇15 ml/kg的基礎(chǔ)上，每周皮下注射40%四氯化碳橄欖油2次，第一次5.0 ml/kg，以后各次3.0 ml/kg，連續(xù)造模6周。從造模開(kāi)始灌胃給藥，每日一次，連續(xù)給藥6周。

1.5 取材、指標(biāo)測(cè)定

實(shí)驗(yàn)第43日，大鼠稱重、麻醉，股靜脈取血后處死，手術(shù)摘取肝臟，稱重，在固定位置取肝組織3份，第1份肝組織精密稱重，干燥至恒重后再稱重，計(jì)算含水量；第2份肝組織經(jīng)多聚甲醛固定，切片經(jīng)免疫組化染色，觀測(cè)肝組織TGF-β1表達(dá)特點(diǎn)并進(jìn)行半定量分析；第3份肝組織采用PCR法測(cè)定Smad3、Smad7基因表達(dá)水平。肝組織含水量(%)=[(濕重-干重)/濕重]×100%。

1.6 PCR法測(cè)定肝組織Smad3、Smad7基因表達(dá)

取大鼠肝組織加RNAico Plus于冰上勻漿，經(jīng)提取、沉淀、洗滌等步驟得總RNA。紫外分光光度法測(cè)定其濃度后，在反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中合成第一鏈cDNA，作為實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分析的模板，檢測(cè)目標(biāo)基因Smad3、Smad7與GAPDH表達(dá)的熒光強(qiáng)度，以模型對(duì)照組為對(duì)照計(jì)算△△Ct，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目標(biāo)基因相對(duì)表達(dá)量，比較各組目標(biāo)基因表達(dá)的差異性。引物為生工生物工程(上海)股份有限公司生產(chǎn)，Smad3(153 bp)：上游5'-CGTCCGATCCTCCCTTCAC-3'，下游5'-CCAAGCTCTTGCCCGCCTTC-3'；Smad7(276 bp)：上游5'-AACTGCAGACTGTGCAGACG-3'，下游5'-TTGGGAATCTGAAAGCCCCC-3'；GAPDH(217)：上游5'-GGCAAGTTCAACCGGCACAG-3'，下游5'-CGCCAGTAGACTCCACGACAT-3'。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 鱉甲育肝顆粒對(duì)大鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)的影響

肝組織TGF-β1免疫組化染色后，高倍鏡下空白對(duì)照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整、肝細(xì)胞排列整齊，期間偶有灰色TGF-β1表達(dá)，著色較淺；模型對(duì)照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)不完整，期間夾雜大量膠原纖維沉積，TGF-β1廣泛表達(dá)于匯管區(qū)、纖維間隔及肝竇壁等細(xì)胞核周圍的胞漿內(nèi)，著色較深。在鱉甲育肝顆粒的干預(yù)下，大鼠肝小葉及肝細(xì)胞上述病理變化出現(xiàn)明顯改善，TGF-β1的表達(dá)出現(xiàn)不同程度減輕(圖1)。

Fig. 1 Effects of BYG on TGF-β1expression in HF rats (×40)A: Control group; B: Model group; C: Colchicine group; D: BYG-L group; E: BYG-M group; F: BYG-H group

2.2 鱉甲育肝顆粒對(duì)肝纖維化大鼠肝功能的影響

表1結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中ALT、AST及ALP的活性顯著升高(P< 0.01)。與模型組比較，秋水仙堿組和不同劑量鱉甲育肝顆粒干預(yù)組，ALT、AST及ALP的活性均顯著下降(P<0.01)；與鱉甲育肝顆粒中劑量組比較，高劑量組大鼠血清中ALP活性顯著下降(P<0.01)。

Tab. 1 Effects of BYG on liver functions in HF rats (U/L, n=8)

2.3 鱉甲育肝顆粒對(duì)肝纖維化大鼠肝指數(shù)及其含水量的影響

表2結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠肝組織含水量與肝指數(shù)顯著升高(P<0.01)；秋水仙堿和不同劑量鱉甲育肝顆粒干預(yù)組大鼠肝組織含水量與肝指數(shù)均顯著下降(P<0.01)。

Tab. 2 Effects of BYG on liver index and water content in HF rats (%, n=8)

2.4 鱉甲育肝顆粒對(duì)肝纖維化大鼠血清肝纖維化相關(guān)指標(biāo)的影響

表3結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠血清HA、PCⅢ、C-Ⅳ及LN質(zhì)量濃度均顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，秋水仙堿組和不同劑量鱉甲育肝顆粒干預(yù)組大鼠血清中HA、PCⅢ、C-Ⅳ及LN質(zhì)量濃度均顯著下降(P<0.01)。

Tab. 3 Effects of BYG on liver fibrosis related indexes in HF rats (μg/L, n=8)

2.5 鱉甲育肝顆粒對(duì)肝纖維化大鼠肝組織Smad3、Smad7基因表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠肝組織中Smad3與Smad7基因表達(dá)顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，秋水仙堿組和不同劑量鱉甲育肝顆粒干預(yù)組Smad3 mRNA表達(dá)明顯下降，而Smad7 mRNA表達(dá)持續(xù)升高(P<0.01)；與鱉甲育肝顆粒中劑量比較，低、高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表4)。

Tab. 4 Effects of BYG on expressions of Smad3 mRNA and Smad7 mRNA in HF rats n=8)

2.6 鱉甲育肝顆粒對(duì)肝纖維化大鼠肝組織TGF-β1表達(dá)的影響

半定量分析顯示，與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠肝組織中TGF-β1表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，秋水仙堿和不同劑量大鼠肝組織中TGF-β1表達(dá)的平均光密度值顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，秋水仙堿和不同劑量鱉甲育肝顆粒干預(yù)組TGF-β1表達(dá)水平顯著下降(P<0.01)；與鱉甲育肝顆粒中劑量比較，低劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表5)。

Tab. 5 Effects of BYG on TGF-β1 expression in HF rats n=8)

3 討論

肝纖維化是肝臟對(duì)多種慢性損傷的修復(fù)過(guò)程中，肝組織細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成增加或降解減少、纖維組織大量沉積的病理過(guò)程。肝纖維化是慢性肝病向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)階段，肝臟病理學(xué)專家Hans Popper指出：“誰(shuí)能阻止或延緩肝纖維的發(fā)生，誰(shuí)就將治愈大多數(shù)慢性肝病”，因此緩解肝纖維化進(jìn)程在整個(gè)肝病的治療中有重要意義[6]。鱉甲育肝顆粒是在肝“體陰而陰不足”等中醫(yī)理論的指導(dǎo)下配制的，由鱉甲、山茱萸、柴胡、黃芩等中藥制成，具有育陰調(diào)肝、軟肝散積的功效，臨床上主要用于慢性肝炎之肝纖維化以及肝硬化的治療[7]。四氯化碳、乙醇具有肝毒性，是目前常用的復(fù)制肝纖維化動(dòng)物模型的化學(xué)藥物，本次研究采用四氯化碳、乙醇來(lái)復(fù)制肝纖維化動(dòng)物模型[8]。ALT、AST及ALP是評(píng)價(jià)肝功能的重要指標(biāo)，ALT主要存在于肝細(xì)胞漿中，在肝內(nèi)酶活性明顯高于血清，因此，少量肝細(xì)胞壞死即可導(dǎo)致血清ALT水平明顯增高；AST主要分布在肝細(xì)胞線粒體內(nèi)，當(dāng)肝細(xì)胞壞死，AST可從線粒體中釋放出來(lái)，進(jìn)而導(dǎo)致血清AST明顯升高[9]；ALP升高是由于肝細(xì)胞受損、微膽管梗阻所致，故這些指標(biāo)的含量可反映肝細(xì)胞的受損情況[10]。血清中HA，LN，C-Ⅳ和PCⅢ與肝纖維化程度密切相關(guān)，PCⅢ可反映肝Ⅲ型膠原的合成，并且血清含量與肝纖維化程度一致；Ⅳ-C是構(gòu)成基底膜的主要成份，是反映基底膜膠原更新的靈敏指標(biāo)；LN是基底膜總特有的非膠原性結(jié)構(gòu)蛋白，與肝纖維化活動(dòng)呈正相關(guān)；HA由間質(zhì)細(xì)胞合成可較準(zhǔn)確反映肝內(nèi)生成纖維量及肝細(xì)胞受損情況，也是衡量肝纖維化的敏感指標(biāo)[11, 12]。此外，研究表明慢性肝炎及肝纖維過(guò)程中，炎癥反應(yīng)可引起肝組織充血、水腫，而肝組織含水量也能間接反映肝組織炎癥反應(yīng)的程度[13]。本研究結(jié)果顯示，在乙醇與四氯化碳的影響下，大鼠血清肝功能指標(biāo)(ALT、AST、ALP)、肝纖維化指標(biāo)(HA，LN，C-Ⅳ、PCⅢ)及肝組織含水量均顯著升高，表明肝纖維化造模成功。在給予鱉甲育肝顆粒后，肝組織含水量及肝指數(shù)、血清ALT、ALP及AST含量均顯著降低，HA、LN、C-Ⅳ及PCⅢ含量降低提示鱉甲育肝顆粒對(duì)肝纖維化有明顯的降酶保肝作用。

TGF-β1是公認(rèn)的最強(qiáng)致肝纖維化的細(xì)胞因子之一，TGF-β1/Smads通路是目前發(fā)現(xiàn)的最經(jīng)典的參與肝纖維化的信號(hào)通路，主要由細(xì)胞膜外TGF-β1、膜上TβR受體與膜內(nèi)Smads組成[14]。當(dāng)肝臟受到外界刺激而發(fā)生損傷時(shí)，TGF-β1與細(xì)胞膜表面的TβRII結(jié)合，激活TβRI的絲氨酸/蘇氨酸激酶，磷酸化后的TβRI激活Smad3并與Smad4形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物進(jìn)入核內(nèi)，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)的合成，促進(jìn)HSC轉(zhuǎn)化并加速ECM的合成[15, 16]。Smad7是TβRI型受體絲氨酸/蘇氨酸激酶的拮抗蛋白，Smad7與TβRI受體結(jié)合后可干擾Smad3的磷酸化，從而在TGF-β1/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中構(gòu)成負(fù)反饋調(diào)節(jié)環(huán)路，抑制纖維化的發(fā)生與發(fā)展[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，在鱉甲育肝顆粒的干預(yù)下，肝組織中TGF-β1、Smad3 mRNA的表達(dá)水平下調(diào)，而Smad7 mRNA的表達(dá)上調(diào)，提示抑制TGF-β1/Smads信號(hào)通路是鱉甲育肝顆粒抗肝纖維化的作用機(jī)制之一。