徐淑菲，林雙慶，陳信忠，劉啟霖，蔡紹鑫，曾韻穎，朱黃鑫，方成俊，孔凡德

（1.廈門海關(guān)技術(shù)中心，福建廈門 361026；2.東山海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心，福建東山 363401；3.廈門海關(guān)，福建廈門 361000）

羅非魚是全球第二大重要的養(yǎng)殖魚類。我國為世界第一羅非魚養(yǎng)殖大國，養(yǎng)殖產(chǎn)量約占世界總產(chǎn)量的50%，主要集中于廣東、廣西、海南和福建等地，以出口為主。2009 年夏天，以色列某養(yǎng)殖場羅非魚突然大量死亡，同年，自然生長的野生羅非魚也出現(xiàn)大量死亡。經(jīng)證明，死亡魚感染了羅湖病毒（tilapia lake virus，TiLV）。隨后，厄瓜多爾、埃及、馬來西亞、哥倫比亞、泰國、印度以及中國臺(tái)灣等相繼發(fā)現(xiàn)TiLV 感染病例[1-6]。2017 年雷燕等[7]研究報(bào)告稱，從海南省養(yǎng)殖的羅非魚中檢測出TiLV。2019 年雷燕等[8]再次研究稱，從廣東、海南、福建等省的羅非魚樣品中均檢出TiLV。然而，官方和其他研究團(tuán)隊(duì)目前均未有我國檢出TiLV 的報(bào)道。

LAMP 技術(shù)即環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loopmediated isothermal amplification，LAMP），由于不需要PCR 儀和昂貴的試劑，目前已被廣泛應(yīng)用于腫瘤篩選、植物病毒檢測、轉(zhuǎn)基因食品檢測、動(dòng)物胚胎性別鑒定、水生陸生動(dòng)物的細(xì)菌性及病毒性疫病檢測等方面[9-10]。與普通PCR、熒光定量PCR相比，LAMP 優(yōu)點(diǎn)突出，具有效率高、特異性好、肉眼可觀察結(jié)果等特點(diǎn)。

目前，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）和我國尚未將TiLV 列入檢疫名錄，也無相應(yīng)檢測標(biāo)準(zhǔn)。因此，建立TiLV 檢測方法，對(duì)于了解國內(nèi)TiLV 的流行病學(xué)，建立對(duì)應(yīng)的檢測標(biāo)準(zhǔn)具有重要意義。TiLV為分段、單鏈的負(fù)鏈RNA 病毒，由10 個(gè)基因片段組成。本研究根據(jù)編碼RNA 聚合酶的片段1，設(shè)計(jì)LAMP 引物，采用Genie II 等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測系統(tǒng)，應(yīng)用等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)原理，結(jié)合熒光檢測技術(shù)，建立了檢測TiLV 的RT-LAMP 方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集和處理 羅非魚臨床樣品，一部分從福建省養(yǎng)殖場采集，具體包括詔安縣梅川雙田水庫養(yǎng)殖場、漳州市常山基祥水產(chǎn)養(yǎng)殖場、詔安縣紅坑水庫養(yǎng)殖場、福建銘興食品冷凍有限公司四都水庫養(yǎng)殖場、三姑娘水庫養(yǎng)殖場、嶺下溪水庫養(yǎng)殖場、石厝底水庫養(yǎng)殖場、梅州水庫養(yǎng)殖場。另一部分為廈門海關(guān)每年進(jìn)行TiLV 監(jiān)控采集的樣品。采集羅非魚成魚的肝、脾、腎和腦組織，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要病毒核酸及濃度 真鯛虹彩病毒（red sea bream iridovirus，RSIV）、錦鯉皰疹病毒（koi herpesvirus，KHV）、流行性造血器官壞死病病毒（epizootic haematopoietic necrosis virus，EHNV）、金魚造血器官壞死病病毒（goldfish haematopoietic necrosis virus，GFHNV）、流 行性潰瘍綜合征（epizootic ulcerative syndrome，EUS）病原、鯉春病毒血癥病毒（spring viremia of carp virus，SVCV）、傳染性造血器官壞死病病 毒（infectious haematopoietic necrosis virus，IHNV）、傳染性鮭魚貧血病病毒（infectious salmonid alphavirus，ISAV）、鮭魚甲病毒（salmonid alphavirus，SAV）、病毒性出血性敗血癥病毒（viral haemorrhagic septicaemia virus，VHSV）等病原核酸，由深圳海關(guān)技術(shù)中心提供，上述病毒核酸濃度依次為20、20、20、30、22、20、23、15、20、20 μg/mL。

1.1.3 主要試劑及儀器 MagSi Total RNA Kit（貨號(hào)M7930-02），為OMEGA 公司產(chǎn)品；2×Master Mix（IMM 產(chǎn)品號(hào)ISO-001），由北京晟泰勃科技有限公司提供；Evo M-MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（產(chǎn)品號(hào)AG11705），由艾科瑞生物有限公司提供。磁珠純化系統(tǒng)（型號(hào)Auto-Pure32A），為杭州奧盛公司產(chǎn)品；臺(tái)式冷凍離心機(jī)（型號(hào)Allegra64R），為Beckman 公司產(chǎn)品；等溫?cái)U(kuò)增核酸檢測系統(tǒng)（型號(hào)Genie Ⅱ），為OptiGene 公司產(chǎn)品。

1.1.4 TiLV 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒和慢病毒 合成的TiLV 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒和慢病毒序列相同，均為976 bp，包含本試驗(yàn)RT-LAMP 方法擴(kuò)增的TiLV 片段序列（269 bp）。TiLV 質(zhì)粒（5 ng/μL），由廈門普諾普和生物技術(shù)有限公司合成；TiLV 慢病毒（25 ng/μL），由廈門安提海拉生物科技有限公司合成，用以模擬真病毒。

1.1.5 相關(guān)引物 根據(jù)TiLV 毒株EC-2012 片段1（Genbank 登錄號(hào)：MK392372），運(yùn)用LAMP 引物設(shè)計(jì)軟件PrimerExplorer，設(shè)計(jì)檢測TiLV 的RTLAMP 引物，并送廈門普諾普和生物技術(shù)有限公司合成。

表1 引物序列

1.1.6 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件（1）反轉(zhuǎn)錄10.00 μL 反應(yīng)體系：gDNA Clean Reagent 1.00 μL，5×gDNA Clean Buffer 2.00 μL，Total RNA 7.00 μL。（2）LAMP 20.00 μL 反應(yīng)體系：2×Master Mix 10.00 μL，TiLV-FIP/BIP（20 μmol/L）各1.25 μL，TiLV-F3/B3（10 μmol/L）各0.25 μL，TiLV-LoopF/B（5 μmol/L）各0.25 μL，模板1.00 μL，補(bǔ)充RNase-free water至總體積20.00 μL。若無特殊說明，均按照此反應(yīng)體系進(jìn)行試驗(yàn)。（3）反應(yīng)條件：反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)為42 ℃，20 min；Genie II 等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測系統(tǒng)默認(rèn)的LAMP 反應(yīng)條件（擴(kuò)增65 ℃，30 min；退火從98 ℃到80 ℃，0.05 ℃/s），若無特殊說明，均按照此反應(yīng)條件進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 RNA 提取

按照MagSi Total RNA Kit 操作說明書進(jìn)行RNA 提取。

1.3 RT-LAMP 方法建立及優(yōu)化

取8 個(gè)熒光PCR 管，每管均加入2×Master Mix 10.00 μL、TiLV-LoopF/R 各0.25 μL、質(zhì)量濃度為5.0×10-2ng/μL 的TiLV 質(zhì) 粒1.00 μL 以 及TiLV-F3/B3 各0.25 μL（對(duì)應(yīng)終濃度為0.25 μmol/L），然后第1～8 管依次加入TiLV-FIP/BIP 各1.75 μL（對(duì)應(yīng)終濃度為1.75 μmol/L）、1.50 μL（對(duì)應(yīng)終濃度為1.50 μmol/L）、1.25 μL（對(duì)應(yīng)終濃度為1.25 μmol/L）；1.00 μL（對(duì)應(yīng)終濃度為1.00 μmol/L）；0.75 μL（對(duì)應(yīng)終濃度為0.75 μmol/L）、0.50 μL（對(duì)應(yīng)終濃度為0.50 μmol/L）、0.25 μL（對(duì)應(yīng)終濃度為0.25 μmol/L）、1.25×10-1μL（對(duì)應(yīng)終濃度為1.25×10-1μmol/L），最后將每管反應(yīng)體系用RNase-free water 補(bǔ)足至總體積20.00 μL。

1.4 RT-LAMP 方法靈敏度檢測

將原始質(zhì)量濃 度 為5.0 ng/μL 的TiLV 質(zhì) 粒10 倍梯度稀釋為5.0×10-1～5.0×10-8ng/μL。按照1.1.6 的RT-LAMP 反應(yīng)體系（20.00 μL）配制試劑，分裝到8 個(gè)熒光PCR 反應(yīng)管中。第1～8 管分別加入經(jīng)過梯度稀釋的5.0×10-1～5.0×10-8ng/μL TiLV質(zhì)粒各1.00 μL。按照1.1.6 的反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增。

1.5 RT-LAMP 方法重復(fù)性檢測和熔解試驗(yàn)

將原始質(zhì)量濃度為5.0 ng/μL 的TiLV 質(zhì)粒10倍梯度稀釋為5.0×10-1～5.0×10-8ng/μL。第1 組，按照1.1.6 的RT-LAMP 反應(yīng)體系配制試劑，分裝到8 個(gè)熒光PCR 反應(yīng)管中，第1～8 管分別加入經(jīng)過梯度稀釋的5.0×10-1～5.0×10-8ng/μL TiLV 質(zhì)粒各1.00 μL（對(duì)應(yīng)終質(zhì)量濃度為2.5×10-2～2.5×10-9ng/μL）。第2組為重復(fù)試驗(yàn)。按照1.1.6 的反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增和熔解試驗(yàn)。

1.6 RT-LAMP 方法特異性檢測

按照1.1.6 反轉(zhuǎn)錄程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)，再按照1.1.6 的LAMP 反應(yīng)體系配制試劑，平均分裝到13 個(gè)熒光PCR 反應(yīng)管中，第1～13 管分別加入初始質(zhì)量濃度為5.0×10-2ng/μL 的TiLV 質(zhì)粒、TiLV慢病毒、RSIV、KHV、EHNV、GFHNV、EUS 病原、SVCV、IHNV、ISA、SAV、VHSV、RNasefree water 各1.00 μL。按照1.1.6 的反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。

1.7 臨床樣品檢測

用建立的TiLV RT-LAMP 方法對(duì)300 份羅非魚樣品開展檢測，反應(yīng)體系和條件按照1.1.6 進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-LAMP 方法建立及優(yōu)化

檢測TiLV 的RT-LAMP 試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果見圖1。1～8 管反應(yīng)結(jié)果對(duì)應(yīng)圖1 的曲線1～8，TiLVFIP/BIP 與TiLV-F3/B3 終濃度比例分別為14:1、12:1、10:1、8:1、6:1、4:1、2:1、1:1。隨著引物TiLV-FIP/BIP 與TiLV-F3/B3 終濃度比例的減小，即TiLV-FIP/BIP 濃度的減少，擴(kuò)增曲線所需時(shí)間逐漸變長（即Ct 值逐漸變大），曲線4～7 甚至在30 min 內(nèi)擴(kuò)增不出目的產(chǎn)物。曲線1～3 均出現(xiàn)典型的“S”型擴(kuò)增曲線，曲線4～8 均未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線；曲線1～3 Ct 值比較接近，根據(jù)節(jié)約試劑材料原則，選擇3 號(hào)曲線即第3 管的引物濃度和比例。

圖1 RT-LAMP 引物最佳濃度探究結(jié)果

2.2 RT-LAMP 靈敏度檢測

RT-LAMP 靈敏度檢測結(jié)果如圖2。第1～8 管分別對(duì)應(yīng)圖2 中的曲線1～8。曲線1～8，模板濃度逐漸遞減，Ct 值越來越大，總反應(yīng)時(shí)間為30 min。本試驗(yàn)可檢測到第6 管，對(duì)應(yīng)的是圖2 中曲線6，終質(zhì)量濃度為2.5×10-7ng/μL。因此，檢測TiLV 的RT-LAMP 方法的靈敏度為2.5×10-7ng/μL。

圖2 RT-LAMP 靈敏度檢測結(jié)果

2.3 RT-LAMP 重復(fù)性檢測和熔解曲線

RT-LAMP 方法的重復(fù)性和熔解曲線試驗(yàn)結(jié)果如圖3。第1 組試驗(yàn)是圖3 中實(shí)線所示擴(kuò)增曲線，第2 組是虛線所示擴(kuò)增曲線。實(shí)線/虛線1～8 分別對(duì)應(yīng)第1/2 組的第1～8 管。由圖片可見，兩組試驗(yàn)的重復(fù)性較好；兩組試驗(yàn)熔解曲線均在84.5～85.0 ℃之間，略有差異，屬于試驗(yàn)誤差，最大誤差是0.5 ℃，誤差率0.6%，不影響整體熔解曲線的一致性，重復(fù)性較好，可判定擴(kuò)增的是同一產(chǎn)物。

圖3 RT-LAMP 重復(fù)性和熔解曲線檢測結(jié)果

2.4 特異性試驗(yàn)

特異性分析試驗(yàn)結(jié)果見圖4。圖4 顯示，建立的檢測TiLV 的RT-LAMP 方法僅能夠?qū)iLV 質(zhì)粒及慢病毒進(jìn)行特異性擴(kuò)增，擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)典型的“S”型，而對(duì)RSIV 等其他病毒均無擴(kuò)增曲線，說明該方法特異性良好。

圖4 RT-LAMP 特異性檢測結(jié)果

2.5 臨床樣品檢測

對(duì)300 份羅非魚樣品應(yīng)用本試驗(yàn)建立的RTLAMP 方法進(jìn)行檢測，結(jié)果均未檢出TiLV。綜合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[1-8]及每年海關(guān)、水產(chǎn)技術(shù)推廣站的監(jiān)測結(jié)果，推測目前國內(nèi)羅非魚感染TiLV 的可能性極低。

3 討論

Del-Pozo 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，TiLV 具有正黏病毒超微結(jié)構(gòu)特征，因此推測TiLV 可能是一種新的正粘病毒。TiLV 基因組共有10 個(gè)片段，最大的是基因片段1。此片段有一個(gè)開放閱讀框，與丙型流感病毒PB1 亞基序列同源性較低[12]。但LAMP 設(shè)計(jì)引物比較難，設(shè)計(jì)雙重引物更難，雙重LAMP 的建立相比雙重PCR 和雙重qPCR 更難。本團(tuán)隊(duì)后續(xù)還會(huì)嘗試建立檢測TiLV 和病毒性神經(jīng)壞死病病毒（VNNV）的雙重RT-LAMP。

LAMP 是2000 年由日本研究人員Notomi[13]等發(fā)明的一種新型體外等溫?cái)U(kuò)增特異核酸片段的技術(shù)。其特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6 個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物，在鏈置換DNA 聚合酶（Bst DNA polymerase）的作用下，60～65 ℃恒溫?cái)U(kuò)增，15～60 min即可實(shí)現(xiàn)109～1010倍的核酸擴(kuò)增。與普通PCR、熒光定量PCR 相比，LAMP 的優(yōu)點(diǎn)突出：LAMP 不需要昂貴的精密儀器，恒溫狀態(tài)即可；LAMP 擴(kuò)增效率高，能夠獲得大量擴(kuò)增產(chǎn)物，具有高特異性；通過添加loop 引物，可以加快反應(yīng)，縮短一半時(shí)間（常規(guī)LAMP 反應(yīng)大約需要1.0 h，加入loop 引物后可縮短為0.5 h）；擴(kuò)增可產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物焦磷酸鎂白色沉淀，肉眼即可觀察結(jié)果，也可借助于斑點(diǎn)雜交或橫向流動(dòng)試紙條等方法輔助結(jié)果檢測。本研究建立的RT-LAMP 方法，采用Genie II等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測系統(tǒng)，可以實(shí)時(shí)監(jiān)控?cái)U(kuò)增反應(yīng)，通過擴(kuò)增曲線進(jìn)行結(jié)果判定，克服了傳統(tǒng)靠肉眼觀察結(jié)果的盲目性。但LAMP 方法也有其缺點(diǎn)，就是更容易污染，因此在試驗(yàn)過程中要特別謹(jǐn)慎小心。

等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測系統(tǒng)已在疫病檢測中得到應(yīng)用。史秀杰等[14]、何俊強(qiáng)等[15]在Genie II 實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增檢測系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，建立了檢測ISA、IHNV 的LAMP 方法。安元龍等[16]運(yùn)用Genie II 實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增檢測系統(tǒng)，建立了對(duì)VHSV 進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測方法。侯東君等[17]選定了一套可在牛羊肉中特異并靈敏檢測出摻雜肉成分的引物對(duì)，以動(dòng)物細(xì)胞色素b 基因組為模板可在恒溫63 ℃特異性擴(kuò)增出豬等基因片段而無其他擴(kuò)增片段影響。徐淑菲等[18-20]建立了檢測牛、豬、羊、雞、鴨等動(dòng)物源性成分的LAMP 方法。等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測系統(tǒng)，結(jié)合熒光檢測技術(shù)，比傳統(tǒng)LAMP 方法更為完善，克服了感官判定的不確定因素，使結(jié)果更加準(zhǔn)確可信，且可以實(shí)時(shí)監(jiān)控。

本研究建立的檢測TiLV 的RT-LAMP 方法，檢測靈敏度是2.5×10-7ng/μL，靈敏度較高。其原因在于LAMP 方法有6 條引物，而且FIP 由F2 區(qū)和F1C 區(qū)域組成、BIP 由B1C 和B2 區(qū)域組成，且堿基長度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過普通PCR 引物。但LAMP 試驗(yàn)極易受氣溶膠等污染，因此操作過程要非常小心。本研究成功建立了檢測TiLV 的RT-LAMP 方法，為快速診斷、監(jiān)測TiLV 提供了技術(shù)支撐。