白藝蘭，劉 健，鞠厚斌，常曉靜，徐 鋒，沈莉萍，龔國華，朱曉英，王曉旭，王 建，趙洪進(jìn)

（上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103）

貓杯狀病毒（feline calicivirus，F(xiàn)CV）屬杯狀病毒科、水皰疹病毒屬，無囊膜，基因組為單股正鏈RNA，包含180 拷貝的VP1和1～10 拷貝的VP2基因。FCV 除引起貓呼吸道癥狀外，還可引起貓慢性牙齦炎（feline chronic gingivostomatitis，F(xiàn)CGS），嚴(yán)重危害貓的健康[1]。

FCGS 是一種發(fā)生于牙齦、口腔黏膜的慢性炎癥，常由多種病原引起，使患病貓出現(xiàn)厭食、口腔分泌物增多等癥狀，引起動(dòng)物極大痛苦[2]。2020年11 月，上海市某寵物醫(yī)院接診一例疑似貓F(tuán)CV感染病例。該病例近半年以來，口腔一直產(chǎn)生大量唾液，并出現(xiàn)潰瘍以及牙齦腫脹、出血、增生等癥狀，其間曾用抗生素治療，開始有些效果，但幾日后便會(huì)復(fù)發(fā)，后期鼻腔也開始出現(xiàn)分泌物。為了解病因，采集眼、口、鼻拭子進(jìn)行病原分離鑒定，結(jié)果顯示為FCV 繼發(fā)大腸桿菌和多殺性巴氏桿菌感染。為了解FCV 的變異特點(diǎn)，對(duì)FCV 分離株進(jìn)行了序列分析。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液、胰酶消化液（0.25%），均購自GIBCO 公司；胎牛血清（FBS），購自SIGMA 公 司；PrimeScript? One Step RT-PCR Kit Ver.2（Dye Plus）試劑，購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；哥倫比亞瓊脂，購自美國BD 公司；脫纖維羊血，購自上?？片敿挝⑸锛夹g(shù)有限公司。質(zhì)譜儀配套材料：裂解試劑VITEK MS-FA、基質(zhì)液VITEK MS-CHCA 等，均購自法國梅里埃公司；強(qiáng)力霉素、壯觀霉素、林可霉素、阿米卡星、慶大霉素、卡那霉素等13 種藥敏紙片，購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 采集發(fā)病貓的眼、口、鼻拭子并放入微生物采集管中。

1.2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng) 將微生物采集管中的液體，接種于哥倫比亞羊血瓊脂，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)18 h，然后挑取可疑菌落純化培養(yǎng)。

1.2.3 VITEK MS 質(zhì)譜儀鑒定 從純化平板上，挑取待測(cè)菌涂布在質(zhì)譜條上的檢測(cè)孔中，室溫下干燥；加入0.5 μL VITEK MS-FA 裂解試劑，待干燥后再加入1.0 μL 基質(zhì)液VITEK MS-CHCA；干燥后上機(jī)檢測(cè)，取檢測(cè)結(jié)果。

1.2.4 藥敏試驗(yàn) 將細(xì)菌純培養(yǎng)物，采用K-B 紙片法進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。試驗(yàn)方法及判讀標(biāo)準(zhǔn)，參照杭州濱和微生物試劑有限公司提供的抗生素類藥敏紙片說明書、紙片法藥敏試驗(yàn)抑菌環(huán)直徑判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.5 FCV 分離培養(yǎng) 將含有棉拭子的微生物采集管置于-80 ℃冰箱中凍融，12 000 r/min 離心5 min并收集上清，用0.22 μm 濾器過濾，接種于長(zhǎng)滿單層的F81 細(xì)胞培養(yǎng)并每日觀察細(xì)胞病變。若未出現(xiàn)細(xì)胞病變，則取細(xì)胞培養(yǎng)的上清連續(xù)盲傳2～3 代直至出現(xiàn)細(xì)胞病變；若出現(xiàn)細(xì)胞病變則反復(fù)凍融3次，分裝至凍存管，保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.2.6 FCVVP1基因擴(kuò)增 采用濾膜提取核酸方法提取細(xì)胞培養(yǎng)物中的核酸，根據(jù)文獻(xiàn)[3] 中的方法，使用One Step RT-PCR 試劑進(jìn) 行RT-PCR 擴(kuò)增。上游引物VP1-F 序列為ATGTGCTCAACCTGCGC，下游引物VP1-R 序列為TCATAATTTAGTCATTGAGC。產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.7VP1序列分析與遺傳進(jìn)化分析 將分離株的VP1基因及氨基酸序列與GenBank 上載錄的參考株序列（表1）進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，并用MegAlign（MEGA）軟件構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹。

表1 國內(nèi)外FCV 參考序列

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離鑒定

2.1.1 分離株培養(yǎng)特性 拭子涂板后，分離到2株不同的菌株：1 株于哥倫比亞羊血瓊脂上呈現(xiàn)β溶血環(huán)、灰白色、圓形，菌落直徑為1.0～1.5 mm（圖1-A）；另1 株不溶血，呈灰色、圓形，菌落直徑為0.5～1.0 mm（圖1-B）。

圖1 哥倫比亞血瓊脂上分離菌菌落形態(tài)

2.1.2 分離株的MS 鑒定 通過VITEK MS 鑒定分析，在瓊脂上呈現(xiàn)β 溶血環(huán)的分離株為大腸桿菌，另1 株不溶血的分離株為多殺性巴氏桿菌。

2.1.3 分離株藥敏試驗(yàn) 分離的大腸桿菌和多殺性巴氏桿菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果（表2）顯示：大腸桿菌分離株對(duì)紅霉素、林可霉素耐藥，多殺性巴氏桿菌對(duì)阿米卡星、慶大霉素、壯觀霉素、林可霉素耐藥。

表2 分離株對(duì)抗菌藥物的耐藥情況

2.2 病毒分離培養(yǎng)

樣本經(jīng)濾器過濾后接種F81 細(xì)胞6 h、24 h 后觀察到典型細(xì)胞病變（圖2-A、B），細(xì)胞變圓皺縮，聚成葡萄串狀，逐漸脫落。

圖2 F81 細(xì)胞病毒分離培養(yǎng)結(jié)果（100×）

2.3 病毒RT-PCR 鑒定

收集細(xì)胞培養(yǎng)物提取核酸后使用特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，約在2 000 bp 處出現(xiàn)特異性條帶，大小與理論值相符（圖3），將其命名為FCV20-2。

圖3 FCV20-2 VP1 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.4 VP1 基因測(cè)序及序列分析

2.4.1 同源性分析 利用MEGA 軟件將獲得的FCV20-2 分離毒株VP1 核苷酸序列與表1 中的序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)：分離株VP1序列與18 株序列的核苷酸同源性為74.2%～81.0%（圖4），其中與美國2280（VSD 株）同源性最低，與中國GD 株同源性最高，與其他7 株中國株的核苷酸同源性為74.3%～78.1%；與國內(nèi)FCV 疫苗株255 的核苷酸同源性較低，為75.9%，與F9、2024、F4 等其他國家疫苗株的同源性也較低，為75.1%～75.8%（圖4）。氨基酸同源性分析結(jié)果（圖5）顯示：分離株與其他18 株同源性為82.2%～88.1%，其中與日本F9 株同源性最低，與中國GD 株同源性最高，與國內(nèi)使用的疫苗株255 同源性為85.1%。上述結(jié)果表明，F(xiàn)CVVP1基因變異程度較大。

圖4 FCV20-2 毒株與其他毒株VP1 基因核苷酸序列同源性分析結(jié)果

圖5 FCV20-2 毒株與其他毒株VP1 蛋白氨基酸序列同源性分析結(jié)果

2.4.2 基因進(jìn)化樹分析 將FCV20-2 株VP1基因序列與其他毒株VP1基因進(jìn)行比對(duì)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果（圖6）顯示：FCV 遺傳關(guān)系較復(fù)雜，其中FCV20-2 株VP1序列與中國株HB-S4 同屬于一個(gè)分支，與其共處同一大分支的5 株毒株均為中國株，但與另一分離自上海的中國株SH2014 遺傳距離較遠(yuǎn)，并且該毒株與目前臨床上使用的疫苗株255、F9、F4 等處于不同的進(jìn)化分支，提示疫苗免疫可能存在失敗風(fēng)險(xiǎn)。

圖6 VP1 基因遺傳進(jìn)化樹分析結(jié)果

2.4.3 D、E 區(qū)重要氨基酸位點(diǎn)分析 對(duì)VP1線性表位（402～524 aa）的分析結(jié)果（圖7）顯示：比對(duì)的19 株序列D 區(qū)較為保守，E 區(qū)變異較大，其中D 區(qū)線性表位（415～421aa）及conE 區(qū)（475～479aa）高度保守，而E 區(qū)線性表位5'HRV（445～457aa）高度變異；與抗體反應(yīng)有關(guān)的第439～441 位氨基酸同樣變異較大。

圖7 VP1 蛋白D 區(qū)和E 區(qū)氨基酸比對(duì)結(jié)果

3 討論

FCGS 是一種貓常見的慢性疾病，對(duì)貓可造成嚴(yán)重的疼痛和困擾，被認(rèn)為是患病貓對(duì)一系列口腔病原產(chǎn)生的不當(dāng)免疫反應(yīng)[3]，因此治療較為困難和有限。到目前為止，還沒有有效消除該病所有癥狀的辦法，但是將口腔衛(wèi)生、拔牙和輔助醫(yī)療結(jié)合起來，可減輕大多數(shù)患病貓的病癥[4]。本研究中病例的癥狀表現(xiàn)為典型的FCGS，患病貓出現(xiàn)口腔潰瘍、口腔分泌物增多、牙齦腫脹等臨床癥狀，且病情持續(xù)超過半年，其間使用過抗生素治療，并進(jìn)行拔牙術(shù)，僅有少許好轉(zhuǎn)，病原分離鑒定為FCV 混合細(xì)菌感染。FCV 被確認(rèn)為是引起貓上呼吸道感染和口腔潰瘍性病變的重要病原體。研究[5]表明，F(xiàn)CV 感染與FCGS 嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，F(xiàn)CV 在刺激宿主對(duì)FCGS 的免疫反應(yīng)中可能很重要。

細(xì)菌同樣是引起FCGS 的重要病原。研究[6]報(bào)道，多殺性巴氏桿菌是FCGS 病例中常見的病原菌。本病例中同樣分離得到一株多殺性巴氏桿菌。對(duì)于FCV 感染較為嚴(yán)重的口腔和呼吸道疾病，一般建議采用廣譜抗生素治療，以盡量減少與繼發(fā)性細(xì)菌感染相關(guān)的潛在并發(fā)癥。但大量研究表明，不同國家及地區(qū)的分離菌已對(duì)臨床常用藥物產(chǎn)生了不同的耐藥性，對(duì)治療產(chǎn)生了不利影響[7]。為此，本研究進(jìn)行了耐藥性分析，根據(jù)病原菌及其對(duì)臨床常用藥物產(chǎn)生的耐藥性特點(diǎn)，使用氧氟沙星、諾氟沙星對(duì)該病例進(jìn)行針對(duì)性治療。另外研究[8]表明，口服重組貓干擾素-ω（rFeIFN-ω）可成功治療頑固性FCGS。

FCV 感染在貓科動(dòng)物中廣泛存在，除家貓外還有虎、獅等大型貓科動(dòng)物[9]。該病毒易變異，病毒衣殼蛋白VP1 序列的變異尤為突出[10]。疫苗仍是預(yù)防FCV 感染的主要途徑，但目前FCV 疫苗保護(hù)力下降時(shí)有報(bào)道[11]。一項(xiàng)對(duì)我國近年來貓接種FCV 疫苗后的血清學(xué)調(diào)查顯示，抗體陽性率僅為58.3%[12]。本研究對(duì)分離的FCV20-2 株的VP1 序列進(jìn)行了測(cè)序及分析，發(fā)現(xiàn)該毒株VP1與其他18株序列的核苷酸同源性為74.2%～81.0%，氨基酸同源性為82.2%～88.1%，變異程度較高。由于FCV VP1 E 區(qū)包含主要的B 細(xì)胞表位，因此該區(qū)域是病毒中和抗體的靶位點(diǎn)。對(duì)VP1 D 區(qū)和E 區(qū)分析發(fā)現(xiàn)，比對(duì)的19 株序列D 區(qū)較為保守，而E 區(qū)變異較大，且E 區(qū)線性表位5'HRV（445～457 aa）高度變異，與之前相關(guān)報(bào)道[13-15]相符。與抗體反應(yīng)有關(guān)的第439～441 位氨基酸同樣變異較大，并且構(gòu)建進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，其與目前臨床上使用的疫苗株255、F9、F4 等處于不同的進(jìn)化分支，提示當(dāng)前的疫苗可能不能對(duì)FCV 感染提供較好的保護(hù)。該變異對(duì)VP1 蛋白抗原性的改變還需進(jìn)一步驗(yàn)證。