孫 明，任巧云，漆晶晶，聶 英，馬 超，趙 鑫，潘 麗，仲富萍

（1.甘肅省民勤縣畜牧獸醫(yī)工作站，甘肅武威 733000；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省動(dòng)物寄生蟲病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730046；3.甘肅省武威市畜牧獸醫(yī)總站，甘肅武威 733000）

小亞璃 眼 蜱（Hyalomma anatolicum anatolicum）是我國目前僅報(bào)道分布于新疆維吾爾自治區(qū)半荒漠地區(qū)和草原地區(qū)的人畜共患病的重要傳播媒介，特別在地方性血液原蟲病方面危害更為嚴(yán)重[1-2]。據(jù)吳永紅等[3]在南疆部分散養(yǎng)戶牛場(chǎng)收集的蜱種統(tǒng)計(jì)，小亞璃眼蜱占收集蜱總數(shù)的20%～30%，且在當(dāng)?shù)刂饕獋鞑ヅ－h(huán)形泰勒蟲病，是制約當(dāng)?shù)啬羺^(qū)畜牧業(yè)發(fā)展，危害人畜健康的重要因素。隨著人們對(duì)公共衛(wèi)生、食品安全等問題的關(guān)注，化學(xué)藥物防治蜱類所引起的環(huán)境污染、蜱蟲耐藥性提升、動(dòng)物產(chǎn)品中藥物殘留等問題日益突出，因而實(shí)現(xiàn)蜱的無害化長效控制是當(dāng)前該研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

利用蜱的自然生物天敵研制生防制劑，這一防控模式在植物病蟲害上已經(jīng)發(fā)揮了顯著作用。在蜱生物防治方面，為建立和改進(jìn)蜱的防治模式，國內(nèi)外研究學(xué)者對(duì)其病原微生物，特別是棲息在土壤環(huán)境中的昆蟲真菌類病原微生物進(jìn)行了廣泛采集、篩選和研究[4-5]，取得了可喜成效，如中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所研制的白僵菌與苦皮藤素的殺蜱新制劑、綠僵菌與溴氰菊酯的殺蜱新制劑正在推廣應(yīng)用。

毒力測(cè)定是評(píng)價(jià)高毒力菌株應(yīng)用潛力的基礎(chǔ)。為探索一種比較快捷的方法替代目前繁瑣的生物測(cè)定，人們一直嘗試?yán)蒙椒ǎ富钚缘臏y(cè)定）來篩選強(qiáng)毒菌株[6]。St leger 等[7]在昆蟲體壁離體培養(yǎng)時(shí)，首次發(fā)現(xiàn)了蛋白酶的活性，并指出其與入侵昆蟲表皮存在聯(lián)系。在孢子萌發(fā)、入侵和完成侵染過程中，蛋白酶和幾丁質(zhì)酶被認(rèn)為是與毒力相關(guān)的主要酶類，尤其孢外蛋白酶在侵染宿主過程中降解宿主表皮成分，并在宿主血腔中使血淋巴酚原氧化酶超量表達(dá)，導(dǎo)致宿主因中毒而死亡[8]。馮明光[6]研究也認(rèn)為，孢外蛋白酶對(duì)血黑蝗的毒力相關(guān)性達(dá)到0.67，就可以作為菌株初期篩選的指標(biāo)。李建慶等[9-10]用過濾除去小分子毒素的球孢白僵菌全蛋白提取液進(jìn)行了生物測(cè)定，4 d 內(nèi)可將6 頭試蟲全部毒死，首次提取出了球孢白僵菌大分子毒蛋白；通過進(jìn)一步試驗(yàn)從蟲生真菌中提取對(duì)松墨天牛有致死作用的代謝物進(jìn)行研究，可以確定是毒蛋白導(dǎo)致了昆蟲死亡，為研究高毒力蛋白和菌株篩選工作奠定了基礎(chǔ)。昆蟲病原真菌對(duì)寄主的入侵是機(jī)械壓力和酶共同作用的結(jié)果，對(duì)蜱病原真菌的毒力測(cè)定卻一直停留在以蜱死亡率為基礎(chǔ)的生物測(cè)定上，與蜱病原真菌毒力相關(guān)的水解酶及其酶活性研究極少。因此，為填補(bǔ)酶類及其活性研究作為蜱致病性真菌篩選的補(bǔ)充指標(biāo)，進(jìn)行了以下研究，以期為有效利用球孢白僵菌對(duì)蜱蟲的生物防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株和蜱種 供試菌株，為本實(shí)驗(yàn)室分離保藏的球孢白僵菌菌株（B.bAT03、B.bAT11、B.bAT14、B.bAT17 和B.bAT25）；供試蜱蟲為小亞璃眼蜱，采自新疆維吾爾自治區(qū)莎車縣牛和羊的體表，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室人工繁育后，選擇飽血雌蜱用于試驗(yàn)。

1.1.2 培養(yǎng)基 基礎(chǔ)培養(yǎng)基為PDA 培養(yǎng)基，明膠瓊脂培養(yǎng)基（GA）和殼聚糖培養(yǎng)基（CA）配制方法參考文獻(xiàn)[11]，蛋白酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基和幾丁質(zhì)酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基配制方法參考文獻(xiàn)[12]，幾丁質(zhì)酶完全培養(yǎng)基配制方法參考文獻(xiàn)[13]。

1.2 方法

1.2.1 菌株接種、培養(yǎng)和觀察 配制各菌株孢子懸浮液，含孢量約為1×107個(gè)/mL，用移液器各吸取2 μL 分別點(diǎn)接于GA 和CA 平板上，每個(gè)培養(yǎng)皿點(diǎn)接3～4 個(gè)菌落，使菌落間相隔呈正三角形或正方形，接種后置于26 ℃恒溫保濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，GA 和CA 培養(yǎng)基平板各做3 個(gè)重復(fù)。各菌株在GA 平板上培養(yǎng)6 d 后，將適量15%升汞溶液滴加在GA 平板上使其完全覆蓋平板，待透明圈顯露穩(wěn)定時(shí)倒去升汞溶液，然后用十字交叉法測(cè)量各菌落直徑和透明圈直徑并記錄。CA 平板用5% NaOH溶液處理，透明圈的測(cè)量方法同上。

1.2.2 胞外蛋白酶誘導(dǎo)培養(yǎng)和活性測(cè)定 將孢子懸液（107個(gè)/mL）按1% 的量接種到蛋白酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，26 ℃、180 r/min 培養(yǎng)96 h，用滅菌雙層紗布過濾，所得濾液即為酶液。采用Folin-酚法測(cè)定蛋白酶活性，以每分鐘催化分解生成1 μg 酪蛋白的酶量，定義為1 個(gè)蛋白酶活力單位（IU/mL），重復(fù)測(cè)定3 次[13]。

1.2.3 幾丁質(zhì)酶誘導(dǎo)培養(yǎng)和活性測(cè)定 將孢子懸液（107個(gè)/mL）按1%的量接種到幾丁質(zhì)酶完全培養(yǎng)基中，26 ℃、180 r/min 培養(yǎng)96 h，用滅菌雙層紗布過濾，無菌水洗滌菌體；相同條件下接入幾丁質(zhì)酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)24 h；用滅菌雙層紗布過濾菌體，所得濾液即為酶液。采用DNS 法測(cè)定幾丁質(zhì)酶活性，以每分鐘水解膠體幾丁質(zhì)產(chǎn)生1 μg還原糖所需的酶量，定義為1 個(gè)蛋白酶活力單位（IU/mL），重復(fù)測(cè)定3 次[14]。

1.2.4 不同菌株對(duì)小亞璃眼蜱毒力測(cè)定 將球孢白僵菌菌株分別接種于PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 d，將所產(chǎn)孢子粉用含0.05%吐溫-80 的無菌水配制成108個(gè)/mL 的孢子懸液；將小亞璃眼蜱飽血雌蜱隨機(jī)分組，每組15 只；采用浸漬法，每組供試蜱分別單個(gè)浸漬于孢子懸液5 min 后單獨(dú)置入一次性無菌培養(yǎng)皿中，在26 ℃、相對(duì)濕度為80%的條件下觀察小亞璃眼蜱死亡情況，以含0.05%吐溫-80 的無菌水作對(duì)照，做好記錄，并對(duì)死亡蟲體進(jìn)行保濕培養(yǎng)（相對(duì)濕度大于90%），觀察其是否變?yōu)榻┫x。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)所有測(cè)定數(shù)據(jù)利用DPS 數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和處理。

2 結(jié)果

2.1 不同菌株在GA 平板上透明圈和菌落直徑測(cè)定

不同菌株在GA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)6 d 后，用適量15%升汞溶液處理GA 平板，平板上均出現(xiàn)明顯的透明圈。由表1 直徑比可見，菌株蛋白酶分泌量差異明顯，球孢白僵菌B.bAT17 和B.bAT11 菌株差異不顯著，但其直徑比均大于其他菌株，球孢白僵菌B.bAT17 菌株較B.bAT03、B.bAT14 和B.bAT25 菌株差異顯著。

表1 不同菌株在GA 平板上培養(yǎng)6 d 后的透明圈和菌落直徑

2.2 不同菌株在CA 平板上透明圈和菌落直徑測(cè)定

不同菌株在CA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)6 d 后，用適量5% NaOH 溶液處理CA 平板，平板上均出現(xiàn)明顯的透明圈。由表2 可見，在幾丁質(zhì)酶活性上，球孢白僵菌B.bAT03、B.bAT14、B.bAT25 菌株間直徑比差異不明顯，B.bAT17 菌株產(chǎn)酶量低于B.bAT11且差異顯著。

表2 不同菌株在CA 平板上培養(yǎng)6d 后的透明圈和菌落直徑

2.3 不同菌株對(duì)蜱毒力測(cè)定

如圖1 所示，在孢子密度為108個(gè)/mL 時(shí)，各菌株對(duì)小亞璃眼蜱飽血雌蜱均有不同程度的侵染性，菌株對(duì)蜱的累計(jì)致死率為40%～100%，其中球孢白僵菌B.bAT17 菌株顯示了較高的毒力，致死率達(dá)到100%。試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)中，被生防真菌侵染的飽血雌蜱初期行動(dòng)呆滯，呈萎縮狀態(tài)，體壁出現(xiàn)黑色小點(diǎn)，隨著病情發(fā)展，黑點(diǎn)逐漸擴(kuò)張。在感染后期，蜱開始出現(xiàn)死亡，全身變成深黑色，部分蜱表皮破裂，血液外滲，體表長出白色絮狀菌絲，隨后菌絲布滿全身，產(chǎn)生分生孢子。

圖1 不同菌株侵染小亞璃眼蜱的累計(jì)致死率變化趨勢(shì)

2.4 不同菌株孢外水解酶活性與其對(duì)小亞璃眼蜱侵染毒力的相關(guān)性分析

不同菌株孢外蛋白酶活性和幾丁質(zhì)酶活性見表3。采用DPS 數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)菌株孢外水解酶活性與其毒力之間進(jìn)行相關(guān)性分析和構(gòu)建毒力方程。校正死亡率（Y）與蛋白酶活性（X1）間毒力方程為Y=9.202 5X1+0.852 5，相關(guān)系數(shù)R為0.671 9（P=0.225），球孢白僵菌5 個(gè)菌株的蛋白酶活性與其對(duì)小亞璃眼蜱飽血雌蜱侵染毒力無相關(guān)性（P＞0.05）。校正死亡率（Y）與幾丁質(zhì)酶活性（X2）間毒力方程為Y=1.676 1-1.165 6X2，相關(guān)系數(shù)R為0.935 1（P=0.020），5 個(gè)球孢白僵菌菌株的幾丁質(zhì)酶活性與其對(duì)小亞璃眼蜱飽血雌蜱侵染毒力呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，且差異顯著（P＜0.05）。

表3 不同菌株孢外水解酶的活性測(cè)定 單位：IU/mL

3 討論

球孢白僵菌作為一種廣譜性的微生物型殺蟲劑，在農(nóng)、林害蟲的生防領(lǐng)域中受到極大重視，科研工作者對(duì)其殺蟲機(jī)理和制劑的生產(chǎn)進(jìn)行了大量研究和創(chuàng)新，通過基因工程的超量表達(dá)、基因敲除等方法，對(duì)其毒力因子進(jìn)行驗(yàn)證，菌株“孢外水解酶”假說被科研人員所公認(rèn)[15]。對(duì)于節(jié)肢動(dòng)物蜱，國外學(xué)者研究已表明，真菌侵染的早期蛋白酶——類枯草桿菌蛋白酶（Pr1）由于具有氨基酸疏水性基團(tuán)的結(jié)構(gòu)特征，對(duì)蜱表皮蛋白延伸的疏水肽鍵有比較高的活性，在真菌孢子入侵蜱的早期對(duì)蜱表皮具有很強(qiáng)的降解能力，被認(rèn)為是與真菌致病性有關(guān)的主要毒力因子之一[16]。Fang 等[17]構(gòu)建了編碼孢外蛋白酶和幾丁質(zhì)酶的融合基因（CDEP1:Bbchit1），菌株融合基因酶的表達(dá)量符合蛋白酶和幾丁質(zhì)酶的交互協(xié)同作用且增強(qiáng)了菌株毒力。

在蜱生物防治研究領(lǐng)域，國外學(xué)者通過掃描顯微鏡研究發(fā)現(xiàn)，在真菌感染蜱時(shí)，其分泌的孢外水解酶（蛋白酶、幾丁質(zhì)酶和酯酶等）在孢子芽管穿透體壁，降解蜱表皮角質(zhì)層方面起著重要作用[18-19]。在菌株孢外蛋白酶和幾丁質(zhì)酶平板透明圈法測(cè)定中，各菌株表現(xiàn)出較高的孢外水解酶分泌量（表1～2）。孢外水解酶的產(chǎn)量多少與活性大小關(guān)系到菌株侵染力，人們甚至試圖將其作為菌株毒力的參考指標(biāo)。胡景江等[20]用GA 平板法測(cè)量的各球孢白僵菌菌株以及各世代胞外蛋白酶產(chǎn)酶水平與其對(duì)馬尾松毛蟲的毒力之間存在著明顯線性關(guān)系，可以用定量的產(chǎn)酶水平來指示球孢白僵菌菌株對(duì)目標(biāo)昆蟲的毒力大小。本次試驗(yàn)也證實(shí)高毒力菌株B.bAT17 在GA 平板固體培養(yǎng)基上產(chǎn)生較大的蛋白酶水解圈，且菌株直徑比與B.bAT03、B.bAT14、B.bAT25 相比差異顯著。

在孢外水解酶活性與菌株毒力的相關(guān)性研究中，用DPS 分析軟件處理數(shù)據(jù)表明，蛋白酶活性與菌株毒力間相關(guān)系數(shù)R=0.671 9（P＞0.05），而幾丁質(zhì)酶活性與菌株毒力間相關(guān)系數(shù)R=0.935 1（P＜0.05），具有相關(guān)性（表3），這可能是因?yàn)閹锥≠|(zhì)酶屬于誘導(dǎo)酶，待早期蛋白酶將宿主表皮蛋白降解后，幾丁質(zhì)酶才開始大量分泌。不過，也有資料顯示菌株產(chǎn)酶能力高低與其致病力之間不一定具有必然聯(lián)系。馮明光[6]曾報(bào)道孢外蛋白酶活性作為毒力的參考指標(biāo)需謹(jǐn)慎使用，St leger 報(bào)道球孢白僵菌無毒菌株比毒性菌株產(chǎn)生更多蛋白酶[7-8]。

生物防治研究在國內(nèi)蜱生物防控中剛剛起步，對(duì)其酶制劑的研究極少，對(duì)酶的種類研究也比較單調(diào)，尚未將其水解酶的協(xié)同作用完全考慮。在蜱生防真菌的菌株篩選工作中，平板透明圈法是有效且快速便捷的初步篩選高毒力菌株的方法，克服了評(píng)價(jià)菌株繁瑣的毒力測(cè)定步驟。同時(shí)，為進(jìn)一步研究菌株水解酶活性對(duì)蜱蟲的毒力，也可考慮通過基因工程等分子生物學(xué)方法，對(duì)病原真菌降解宿主體壁的幾丁質(zhì)酶和蛋白質(zhì)酶進(jìn)行分子改良，以期獲得產(chǎn)酶活性高、性質(zhì)穩(wěn)定、應(yīng)用潛力大、易于培養(yǎng)的蜱生防高毒力菌株。本研究結(jié)果為蜱生防高毒力菌株的篩選以及酶活性的初步分析提供了理論依據(jù)。