譚 坤，張麗琳

（天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津300072）

病毒樣顆粒（VLPs）是由病毒的結(jié)構(gòu)蛋白組裝形成的，與自然病毒結(jié)構(gòu)相似的一類蛋白粒子，具有良好的生物活性和與病毒相同的免疫原性，是疫苗制備的良好選擇。疫苗一直是控制和預(yù)防傳染病最有效的方法之一。

傳統(tǒng)的疫苗主要是減毒疫苗和滅活疫苗，這些疫苗可以很好地激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)，抵御疾病的傳播［1］，但是這些傳統(tǒng)疫苗也有一些明顯的缺陷，比如其安全性以及制作的困難性制約了疫苗在某些疾病上的使用。20世紀(jì)80年代以來，VLPs逐漸替代傳統(tǒng)疫苗成為疫苗制備的首選［2］。VLPs是一種多蛋白分子，大部分由幾個相同的蛋白質(zhì)組成二十面體或螺旋結(jié)構(gòu)，在與活病毒結(jié)構(gòu)相似的同時缺失病毒的基因組，因此十分安全。迄今為止，已有多種VLPs疫苗實(shí)現(xiàn)商業(yè)化，證明是一種已經(jīng)被大家承認(rèn)的安全有效的疫苗。

1 VLPs疫苗的分類

根據(jù)原始病毒的結(jié)構(gòu)，VLPs疫苗可以分為有包膜和無包膜兩類。無包膜的VLPs疫苗只包含由病毒的蛋白形成的顆粒［1］，如諾瓦克病毒和戊型肝炎病毒。有包膜的病毒除了病毒本身的蛋白外，還包含宿主的細(xì)胞膜［3］，比如A型流感病毒和乙型肝炎病毒［4，5］。

根據(jù)制備的VLPs疫苗的結(jié)構(gòu)，可以將VLPs疫苗分為四類：VLPs疫苗、嵌合VLPs疫苗、VLPs交聯(lián)疫苗以及VLPs沖擊的樹突狀細(xì)胞（DCs）疫苗。VLPs疫苗是最簡單的VLPs疫苗，它利用了病毒蛋白組裝形成與病毒結(jié)構(gòu)相似的顆粒，激起機(jī)體的免疫反應(yīng)，達(dá)到預(yù)防疾病的效果。嵌合VLPs疫苗是在VLPs疫苗的基礎(chǔ)上，在VLPs的外部連接一些關(guān)鍵的抗原蛋白，從而提高疫苗的免疫原性［6］。但是嵌合VLPs疫苗的成功表達(dá)和組裝是一個需要耐心探究的過程，同時還需要限制插入蛋白的大小。VLPs交聯(lián)疫苗也是將外來抗原連接到VLPs外部，方法是將一個或多個賴氨酸添加到VLPs的免疫反應(yīng)區(qū)，同時將半胱氨酸添加到外來抗原上，然后利用化學(xué)交聯(lián)劑把外來抗原連接到VLPs表面［7］。VLPs沖擊的樹突狀細(xì)胞（DCs）疫苗利用機(jī)體特異性產(chǎn)生的樹突狀細(xì)胞，將樹突狀細(xì)胞與VLPs結(jié)合，使疫苗具有很好的靶向性和免疫治療效果［7］。

根據(jù)VLPs疫苗的功效，可以將VLPs疫苗分為預(yù)防型疫苗和治療型疫苗兩類。

2 VLPs疫苗的優(yōu)勢

從20世紀(jì)80年代以來，VLPs逐漸成為了一種安全有效的疫苗。VLPs是由病毒蛋白組成的具有和病毒結(jié)構(gòu)十分相似結(jié)構(gòu)的粒子，包含病毒的很多特征，因此可以很好地用于疫苗的開發(fā)。VLPs可以形成獨(dú)特的重復(fù)表面結(jié)構(gòu)，這種剛性的重復(fù)表面結(jié)構(gòu)是一種強(qiáng)有力的促進(jìn)B細(xì)胞交聯(lián)的幾何結(jié)構(gòu)，可以很大地激起機(jī)體的免疫反應(yīng)［8，9］。體液免疫過程中包含很多多聚體，促進(jìn)了與VLPs的結(jié)合，從而提高了抗原提呈細(xì)胞對VLPs的定位和攝?。?0］，增強(qiáng)了免疫系統(tǒng)的適應(yīng)性［11］。因此，VLPs作為疫苗具有很多傳統(tǒng)疫苗的特點(diǎn)，同時本身并不具有病毒核酸，不會在機(jī)體內(nèi)復(fù)制，提高了疫苗的安全性［10］。VLPs疫苗的研發(fā)時間較傳統(tǒng)疫苗相比時間較短，可以迅速應(yīng)對流行病的爆發(fā)。目前，有很多VLPs疫苗已經(jīng)商品化，包括乙型病毒肝炎疫苗［12］、人乳頭瘤病毒疫苗［13］以及戊型肝炎病毒疫苗［14］等，證明VIPs疫苗具有很好的免疫性和安全性。

3 VLPs疫苗的表達(dá)系統(tǒng)

VLPs的表達(dá)系統(tǒng)有很多，總計有170多種，常用的是5種表達(dá)系統(tǒng)：細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)，使用率為28%；昆蟲表達(dá)系統(tǒng)，使用率為28%；酵母表達(dá)系統(tǒng)，使用率為20%；哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，使用率為15%；植物表達(dá)系統(tǒng)，使用率為9%。不同表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)比較見表1。

表1 不同表達(dá)系統(tǒng)的比較

3.1 細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)

細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)是VLPs表達(dá)過程中最常用的表達(dá)系統(tǒng)。在利用細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)制備VLPs時，可以將病毒的結(jié)構(gòu)蛋白基因優(yōu)化為細(xì)菌喜好的密碼子，同時將病毒基因插入到具有強(qiáng)啟動子的載體上，從而顯著增加外源蛋白的表達(dá)量［15，16］。作為目前使用最廣泛的表達(dá)系統(tǒng)之一，細(xì)菌的遺傳背景清晰，可以適應(yīng)不同的載體和宿主菌，同時它又具有繁殖速度快、培養(yǎng)價格低、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)。但是細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn)也很明顯，細(xì)菌缺乏轉(zhuǎn)錄后剪切、翻譯后修飾的能力，在VLPs表達(dá)方面具有一定的局限性［17］。目前用細(xì)菌表達(dá)的VLPs疫苗有人乳頭瘤病毒疫苗和豇豆褪綠斑駁病毒疫苗等。

3.2 昆蟲表達(dá)系統(tǒng)

昆蟲表達(dá)系統(tǒng)利用桿狀病毒作為穿梭載體，通過轉(zhuǎn)座作用將表達(dá)所需的元件連接到載體上，然后將載體轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，得到包含外源蛋白完整轉(zhuǎn)錄單位載體的重組病毒。然后用病毒感染細(xì)胞，培養(yǎng)后即可獲得重組蛋白。昆蟲表達(dá)系統(tǒng)可以進(jìn)行良好的翻譯后修飾，如糖基化、乙酰化、磷酸化等，從而讓蛋白進(jìn)行正確的折疊，使重組蛋白的結(jié)構(gòu)和功能與天然蛋白更加相似，同時表達(dá)大分子量的外源蛋白（0~200 kDa）也是昆蟲表達(dá)系統(tǒng)的一項優(yōu)點(diǎn)。但是昆蟲表達(dá)系統(tǒng)也有細(xì)胞生長緩慢、培養(yǎng)基昂貴以及病毒感染會導(dǎo)致宿主死亡等缺點(diǎn)［18］。HPV的雙價VLPs疫苗以及藍(lán)舌病病毒疫苗都是用昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)生產(chǎn)的。

3.3 酵母表達(dá)系統(tǒng)

酵母表達(dá)系統(tǒng)是一種常用的表達(dá)系統(tǒng)，相較于原核生物表達(dá)系統(tǒng)，酵母表達(dá)系統(tǒng)可以進(jìn)行較好的轉(zhuǎn)錄翻譯后的修飾，使表達(dá)的蛋白更加接近于天然蛋白，同時它又具有原核生物生長速度快、培養(yǎng)簡單和價格低廉的優(yōu)點(diǎn)，是一種普遍使用的真核表達(dá)系統(tǒng)［19］。酵母的種類有很多，畢赤酵母和釀酒酵母是常用的兩種。畢赤酵母具有強(qiáng)啟動子——AOX［20］，利用甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)可以明顯提高外源基因的表達(dá)。釀酒酵母用于食品加工已經(jīng)有悠久歷史，因此十分安全可靠。同時，釀酒酵母進(jìn)行了全基因組測序，遺傳背景清晰，方便遺傳操作［21，22］。目前，市面上銷售的HPV九價疫苗就是利用釀酒酵母表達(dá)生產(chǎn)的。

3.4 哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)

哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)可以準(zhǔn)確且復(fù)雜地轉(zhuǎn)錄翻譯后修飾，使組裝的VLPs的分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物功能與天然病毒蛋白最接近，能夠保證免疫原性。但是，哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)條件復(fù)雜、價格昂貴以及表達(dá)量較低等缺點(diǎn)也制約其在工業(yè)上的應(yīng)用［23］。中國長春生物制品所利用哺乳動物細(xì)胞制備的乙肝疫苗已經(jīng)投入生產(chǎn)，具有良好的效果。利用哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的VLPs可以準(zhǔn)確進(jìn)行復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄翻譯后修飾，使表達(dá)產(chǎn)物在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物功能上最接近天然病毒蛋白，具有很好的免疫原性。但是哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)條件復(fù)雜、價格昂貴以及表達(dá)量較低等缺點(diǎn)也制約其在工業(yè)上的應(yīng)用［23］。

3.5 植物表達(dá)系統(tǒng)

植物表達(dá)系統(tǒng)主要利用植物病毒載體和農(nóng)桿菌將要表達(dá)的基因轉(zhuǎn)染到植物細(xì)胞內(nèi)，使其大量表達(dá)外源蛋白［24］。最先利用植物表達(dá)系統(tǒng)研制的疫苗主要是口服疫苗，后來開始轉(zhuǎn)向注射疫苗，使疫苗的生產(chǎn)使用更加準(zhǔn)確［25］。在轉(zhuǎn)基因植物中，VLPs疫苗研究較好的是諾瓦克病毒疫苗［20］。

4 VLPs疫苗的純化與組裝

病毒樣顆粒的純化主要包括4個步驟，分別是裂解、粗提、濃縮和精制［26］。在制備VLPs的過程中，需要在保證質(zhì)量的同時，選擇簡單高效的方法。

裂解：在進(jìn)行蛋白表達(dá)的時候，很多時候在蛋白的前端添加信號肽，將蛋白分泌到細(xì)胞外。但是在某些情況下，組裝VLPs的蛋白無法分泌到胞外，純化這類的VLPs就需要進(jìn)行細(xì)胞裂解［27］。處理不同的細(xì)胞會選擇不同的方法，對于哺乳動物和昆蟲細(xì)胞來說，去污劑處理是細(xì)胞裂解最常用的方法，而高壓、超聲、研磨以及凍融等方法［28，29］則多用于細(xì)菌、酵母和植物細(xì)胞。在這個過程中，最重要的是防止蛋白降解，所以需要根據(jù)蛋白特性配置不同的緩沖液，并在其中加入蛋白酶抑制劑和蛋白穩(wěn)定劑［30］。

粗提：裂解細(xì)胞之后進(jìn)行粗提，在這一步將細(xì)胞碎片和大聚合物去掉［31］。離心是蛋白粗提過程中常用的方法，一般使用低速離心機(jī)或者連續(xù)流離心機(jī)［27］。連續(xù)流離心機(jī)的分離效果比較好，而且可以將細(xì)胞裂解液連續(xù)導(dǎo)入，方便快捷。另外使用0.45 μm的濾膜也可以有效去除細(xì)胞碎片，達(dá)到粗提的效果。

濃縮：濃縮在粗提之后，主要的目的是去除雜蛋白和提高目的蛋白濃度。濃縮的方法有很多，包括硫酸銨沉淀、聚乙二醇沉淀、蔗糖氯化銫梯度超速離心、離子交換層析等［32］。近些年來，利用Monoliths制作的離子交換柱、疏水層析柱或親和層析柱也成為濃縮蛋白的良好工具［27］。

精制：當(dāng)VLPs應(yīng)用于臨床時，濃縮后的VLPs需要精制。精制的主要目的是去除表達(dá)系統(tǒng)宿主本身的蛋白質(zhì)和DNA，同時去除純化相關(guān)雜物。精制主要采取離子交換層析、膜裝置和分子排阻等方法。

經(jīng)過純化處理后，對于表達(dá)的單體蛋白還需要進(jìn)行正確的組裝，不完全或者不規(guī)則的組裝會導(dǎo)致VLPs疫苗效果的下降，因此，需要對VLPs進(jìn)行去組裝和重組裝處理，以提高VLPs的穩(wěn)定性、均一性和免疫原性［33］。不同的VLPs需要不同的緩沖液進(jìn)行去組裝和重組裝，需要不斷地研究與探索。HPV16 L1 VLPs的去組裝需要在高pH、低鹽和還原劑的溶液下進(jìn)行，重組裝需要在低pH、高鹽和去還原劑的條件下進(jìn)行［31］。

5 病毒樣顆粒的鑒定

在制備VLPs的過程中，要對VLPs的制備情況進(jìn)行檢測，因此必須要有良好的檢測與鑒定VLPs的方法。檢測VLPs主要通過4個方面：性質(zhì)、含量、效果和純度。

性質(zhì)：VLPs性質(zhì)的檢測主要包括VLPs的形態(tài)、大小、氨基酸序列、相對分子質(zhì)量、降解修飾情況、中和表位、抗原特異性等方面［34］。性質(zhì)檢測的方法有很多，比如SDS/PAGE法、Western Blot法、ELISA法、表面等離子體共振技術(shù)、投射電子顯微鏡法、免疫電鏡法、蛋白質(zhì)測序法、質(zhì)譜法等。

含量：含量是VLPs檢測中很重要的一步，關(guān)系到VLPs疫苗使時的用量。主要的方法有ELISA法、BCA法、Bradford法、紫外分光光度法等。

效力：VLPs的效力檢測是證明VLPs疫苗效果的關(guān)鍵。主要包括體外試驗(yàn)，如血凝抑制試驗(yàn)；體內(nèi)試驗(yàn)，如免疫試驗(yàn)、攻毒試驗(yàn)等。

純度：VLPs純度是檢測純化和精制效果的關(guān)鍵，同時也與能否用于臨床試驗(yàn)相關(guān)。純度檢測主要檢測VLPs結(jié)構(gòu)蛋白的純度、VLPs的組裝率、宿主DNA和蛋白的殘余、蛋白核酸復(fù)合物的多少等。主要的方法有ELISA法、SDS/PAGE法、DNA染色方法、瓊脂糖凝膠電泳遲滯試驗(yàn)、透射電鏡檢測法等［30］。

使用透射電鏡觀察VLPs是檢測VLPs大小、形態(tài)和分布最快捷、最有效的方法，在投射電鏡下可以很清晰地看到VLPs的形態(tài)與大小，并可以通過形態(tài)和大小推測VLPs的效力［35］。VLPs的效力主要通過3個試驗(yàn)證明：體外中和抗體結(jié)合試驗(yàn)，檢測VLPs的抗原性；病毒中和試驗(yàn)，檢測VLPs誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體的病毒中和活性；動物免疫試驗(yàn)，檢測血清中的抗體和抵御病毒的能力［34］。

6 VLPs疫苗激發(fā)的免疫通路

VLPs的大小在20~200 nm，因此可以很自由地通過存在200 nm大小孔壁的淋巴管，在淋巴系統(tǒng)內(nèi)穿梭。最新的研究顯示，在小鼠腳墊部位注射20~30 nm的VLPs，10 min內(nèi)可以在淋巴細(xì)胞內(nèi)檢測到積累［36］。一般來說，VLPs進(jìn)入細(xì)胞通過兩步：首先通過內(nèi)皮細(xì)胞壁的血管孔自由擴(kuò)散到淋巴細(xì)胞內(nèi)，然后通過被動運(yùn)輸進(jìn)入淋巴結(jié)的被膜下竇［37］。

VLPs的表面排列著大量重復(fù)的抗原表位，因此可以很好地激起機(jī)體的免疫反應(yīng)。VLPs在進(jìn)入機(jī)體后，憑借與病原體分子的相似結(jié)構(gòu)，可以被宿主的模式受體識別（Toll樣受體）并且被抗原提呈細(xì)胞捕獲［38］，然后通過MCHⅠ類分子通路交叉呈遞活化CD8+T細(xì)胞。VLPs也可以作為外源性抗原被樹突狀細(xì)胞識別，然后通過MCHⅡ類分子呈遞，直接促進(jìn)樹突狀細(xì)胞的遷移與成熟，刺激先天性免疫反應(yīng)，刺激免疫模式與原病毒相同［39-42］?；畈《驹诟腥緳C(jī)體后在樹突狀細(xì)胞內(nèi)繁殖時，會表達(dá)一些特定的蛋白阻止細(xì)胞的活化和成熟，而VLPs可以很好地避免這一問題［43］。

7 VLPs疫苗的修飾

為了使疫苗可以有效地誘導(dǎo)抗體反應(yīng)，在設(shè)計疫苗時應(yīng)考慮以下幾點(diǎn)：①疫苗的目標(biāo)抗原要以真實(shí)自然的狀態(tài)呈遞給B細(xì)胞［44］。②設(shè)計的疫苗可以有效地通過B細(xì)胞受體成功激活B細(xì)胞［45，46］。③疫苗可以使用不同的Toll樣受體裝配VLPs，作為佐劑來增強(qiáng)機(jī)體免疫反應(yīng)［47-49］。這些設(shè)計都可以通過不同的修飾方法實(shí)現(xiàn)。

化學(xué)修飾技術(shù)主要是通過化學(xué)方法修飾VLPs表面的氨基、羧基、磺?；约傲u基，其中賴氨酸殘基是VLPs表面最常用的修飾靶點(diǎn)，主要通過將N-羥基琥珀酰亞胺脂與游離的賴氨酸反應(yīng)形成穩(wěn)定的酰胺鍵，在VLPs表面連接其他抗原蛋白。肼連接化學(xué)［50］和點(diǎn)擊化學(xué)［51］是2種常用的修飾表面氨基酸的方法。點(diǎn)擊化學(xué)以及最近開發(fā)的無銅點(diǎn)擊化學(xué)已經(jīng)廣泛用于VLPs修飾，比如VLPs與腫瘤相關(guān)抗原的偶聯(lián)［52-54］。在工業(yè)上VLPs化學(xué)修飾主要通過雙功能交聯(lián)劑實(shí)現(xiàn)，可以在VLPs表面連接任何抗原。比如通過碳亞二胺可以將豇豆花葉病毒表面的180個羧基鹽與抗癌藥阿霉素偶聯(lián)［55］。

當(dāng)連接抗原特別大時，化學(xué)修飾就不能使用了，這時可以利用基因修飾的方法來改變VLPs的結(jié)構(gòu)?；蛐揎椀闹饕硎且胪庠炊嚯暮涂乖譃橹苯右煤屯ㄟ^改造基因組引入。高免疫原性的乙型肝炎核心抗原就是利用了基因修飾加入了特定序列，從而提高了疫苗的免疫效果［56］。這項技術(shù)最開始的時候用于在表達(dá)蛋白的末端加入短肽，最近已經(jīng)發(fā)展為可以在其他部位加入長的肽段。這主要利用了分離蛋白核心的技術(shù)，在特定的部位人為加入終止子和啟動子，使蛋白分離成為多個不同的核心，從而在核心之間插入抗原，這項技術(shù)可以表達(dá)300個氨基酸以上的偶聯(lián)蛋白［57，58］。另一種相似的方法稱為串聯(lián)核技術(shù)，在已經(jīng)穩(wěn)定組裝連接的VLPs中加入主要免疫核心［59］。最后一種基因修飾技術(shù)是在VLPs中插入或突變氨基酸，可以提高在表達(dá)宿主中的穩(wěn)定性和表達(dá)效率。將煙草馬賽克病毒衣殼蛋白中的天冬氨酸和谷氨酸突變?yōu)樘於０泛凸劝滨０?，可以提高蛋白在宿主?xì)胞內(nèi)的組裝能力［60］。

病毒顆粒的內(nèi)部本來是病毒的核酸，在表達(dá)病毒蛋白組裝成VLPs時，其內(nèi)部的核酸被去除，提高了疫苗的安全性。后來發(fā)現(xiàn)，可以通過在VLPs的內(nèi)部加入相應(yīng)的佐劑，從而提高疫苗的免疫效果。在VLPs內(nèi)部加入的大部分是激活樹突狀細(xì)胞的佐劑，包括dsRNA、ssRNA和非甲基化CPGs，分別激活TLR3、TLR7/8和TLR9。將這些佐劑包裹到VLP中，可以很好地將佐劑運(yùn)輸?shù)娇乖岢始?xì)胞，然后VLPs的蛋白外殼被降解，Toll樣配體釋放刺激相應(yīng)受體［8，61］。

8 VLPs疫苗的研發(fā)

8.1 乙型肝炎（HBV）VLP疫苗

乙型肝炎的VLP疫苗已經(jīng)研發(fā)了3代，是一款比較成熟的疫苗。1965年巴魯克·布隆伯格從乙肝感染者血液中分離出來抗原性物質(zhì)Aa，這一發(fā)現(xiàn)，使得乙肝疫苗的研制成為可能［62］。第一代疫苗出現(xiàn)于20世紀(jì)80年代，第二代疫苗利用釀酒酵母表達(dá)乙肝病毒的SHBs小蛋白制備，它為母體感染乙肝病毒的新生兒提供了有效的保護(hù)，并在世界范圍內(nèi)顯著降低了乙肝病毒的感染率［63］。最近，基于乙型肝炎表面抗原的第三代疫苗已經(jīng)在以色列以及其他14個東亞國家使用，在30萬人中顯示了很好的安全性和有效性，它在免疫低下的老年人和腎衰竭的人群中具有更好的效果。它利用了中國倉鼠卵巢細(xì)胞表達(dá)的S、Pre-S1和Pre-S2 3種乙型肝炎表面抗原組裝而成。該疫苗可以在2.5~10.0 μg范圍劑量下誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的抗體，有人認(rèn)為可以作為治療性疫苗用于慢性乙型肝炎病毒感染。

8.2 人乳頭瘤病毒（HPV）VLP疫苗

2006年，第一個HPV VLP疫 苗Gardasil?在美國批準(zhǔn)使用，它由6、11、16、18型HPV病毒的主要衣殼蛋白L1和中性鹽羥基鋁硫酸磷酸鹽佐劑組成。到2014年，Gardasil?已經(jīng)被覆蓋范圍更廣的Garda?sil9?替代，它增加了31、33、45、52和58型的HPV病毒蛋白，研究表明，20%的宮頸癌是由這些新增加的HPV病毒感染引起的［63］。

9 展望

利用VLPs開發(fā)疫苗是近些年來迅速發(fā)展的一門學(xué)科，它結(jié)合了免疫學(xué)、微生物學(xué)、病毒學(xué)和疫苗學(xué)的相關(guān)知識，已經(jīng)成為制備疫苗的熱門選擇。VLPs以其簡單、穩(wěn)定、安全以及獨(dú)特的結(jié)構(gòu)吸引著眾多科學(xué)家的目光。在當(dāng)今的研究中，VLPs已經(jīng)不僅單純作為疫苗而使用，更成為疫苗研究以及更多研究的優(yōu)秀工具。隨著對VLPs研究的加深，VLPs將會給疫苗研發(fā)帶來更多的機(jī)遇。