黃德發(fā)，陳 杰，楊 通，李正哲，張文娟，焦志剛，鐘田雨，

（1. 贛南醫(yī)學(xué)院第一臨床醫(yī)學(xué)院，江西贛州 341000；2.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗科，江西贛州 341000）

外泌體是一種由細胞分泌的雙層膜結(jié)構(gòu)小囊泡，直徑40～150 nm，它們廣泛存在于血液、尿液、母乳、腹腔積液、羊水、唾液和腦脊液等[1-2]。外泌體通過攜帶蛋白質(zhì)和核酸等多種生物分子參與細胞間通訊，從而調(diào)節(jié)機體的生理、病理過程[3]。越來越多的研究表明外泌體可以用于疾病的診斷和治療[4-5]。外泌體的分離和鑒定對于研究其生物學(xué)及臨床應(yīng)用功能是最基礎(chǔ)也是最關(guān)鍵的步驟。目前，外泌體常用的分離方法包括超速離心法、密度梯度離心法、免疫吸附法、沉淀法及尺寸排阻色譜法等[6-8]。本研究擬選擇超速離心法、沉淀法和尺寸排阻色譜法提取并鑒定血清外泌體，旨在驗證采用不同方法提取血清外泌體的得率和純度，為后續(xù)外泌體的研究和應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對象 隨機選取2021年1月～3月贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院健康體檢者8 例，其中男性4 例、女性4 例，年齡20～40 歲，所有體檢者體檢結(jié)果均在參考區(qū)間內(nèi)。使用普通真空采血管采集受試者靜脈血10 ml，室溫靜置30 min 使血液凝集。將采集血液在4℃ 1 500×g 離心20 min，取上清，上清液在4℃ 3 000×g 離心15 min，收集上清（血清）每管1 ml，-80℃保存。所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑 外泌體提取試劑盒（MA0404）（沉淀法）購自大連美侖生物技術(shù)有限公司，尺寸排阻色譜柱（EXOSEC1.0-3）購自遼寧潤基生物科技有限公司，Millipore 超濾管(UFC810096)購自北京華力德科技有限公司，Pierce? BCA 蛋白檢測試劑盒（23227）購自Thermo Fisher Scientific 公司，Triton X-100（T8200）購自北京索萊寶科技有限公司。一抗抗體：CD9，CD63 和HSP70（ab275018）購自美國Abcam 公司；二抗抗體：羊抗兔IgG 抗體（SA00001-2）購自武漢Proteintech 公司。貝克曼超速離心機（Optima-Max-Tl）購自美國貝克曼庫爾特公司，納米流式檢測儀（N30E）購自廈門福流生物科技有限公司，透射電子顯微鏡（JEM1200EX）購自日本JEOL 公司。

1.3 方法

1.3.1 外泌體提?。撼匐x心法：將1 ml 血清在4℃ 12 000×g 離心30 min，棄沉淀吸取上清，4℃ 110 000 ×g 離心2 h，吸棄上清，沉淀重懸在PBS中；4℃ 110 000×g 離心2 h，吸棄上清，沉淀重懸在100 μl PBS 中。沉淀法：按照試劑盒說明書，取1 ml 血清加入0.2 ml 提取試劑，上下顛倒混勻，4℃孵育30 min，孵育結(jié)束后，4℃ 10 000×g 離心10 min，吸棄上清，沉淀重懸在100 μl PBS 中。尺寸排阻色譜法：按照說明書，向柱子內(nèi)加入40 ml PBS 沖洗柱子；柱內(nèi)上方加入1 ml 血清，繼續(xù)用PBS 洗脫柱子并在下方收集含有外泌體餾分。將收集的外泌體餾分加入超濾管中，4℃ 2 000×g 離心，將樣品濃縮至100 μl。

1.3.2 透射電子顯微鏡成像：取20 μl 外泌體樣本置于銅網(wǎng)上靜置1 min，濾紙將銅網(wǎng)上的液體吸干；吸取20 μl 2g/dl 醋酸雙氧鈾染色液室溫染色1 min，濾紙將銅網(wǎng)上的染液吸干，置于60 W 白熾燈下烤3 min，鏡下觀察拍照。

1.3.3 外泌體的顆粒與直徑：將已知濃度的二氧化硅納米顆粒質(zhì)控球與粒徑標準品混合硅球，在納米流式檢測儀上檢測，PBS 作為空白對照，將外泌體樣本混勻后進行檢測，得到外泌體的顆粒數(shù)與直徑。

1.3.4 蛋白印跡實驗：采用Pierce BCA 蛋白定量試劑盒進行外泌體蛋白定量，向外泌體懸液中添加蛋白上樣緩沖液，100℃加熱10 min 變性；隨后進行12g/dl 丙烯酰胺凝膠電泳2 h，電泳后用電轉(zhuǎn)移將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5g/dl 脫脂奶粉搖床封閉1 h，4℃條件下一抗孵育過夜，第二天加入二抗室溫孵育1 h，在蛋白成像系統(tǒng)中曝光成像。

1.3.5 Triton X-100 破膜實驗：外泌體具有雙層膜結(jié)構(gòu)囊泡，容易被去污劑破膜溶解，而脂質(zhì)、雜蛋白不易破壞，通過檢測經(jīng)去污劑處理與未經(jīng)去污劑處理外泌體顆粒數(shù)來評估其純度。取外泌體10 μl加入10 μl 2g/dl Triton X-100，另一管10 μl 外泌體中加入10 μl PBS 作為對照組，冰上孵育1 h，納米流式檢測儀檢測1min 內(nèi)外泌體顆粒數(shù)。外泌體破膜純度百分比定義為（1-對照組外泌體顆粒數(shù)/Triton X-100 處理組外泌體顆粒數(shù)）×100%[9]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用GraphPad Prism 8.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析, 各處理組數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（±s）表示,多組間比較采用單因素方差分析。當P<0.05，認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外泌體粒徑分析 見圖1。采用納米流式檢測儀檢測外泌體的直徑。超速離心法、沉淀法和尺寸排阻色譜法提取的外泌體顆粒直徑分別為70.26±0.27，73.09±0.24，69.97±0.75nm。兩兩比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

2.2 外泌體電鏡分析 見圖2。透射電鏡結(jié)果顯示，三種方法所提取的外泌體在電鏡下均呈一側(cè)凹陷半球形雙層膜囊泡，囊泡直徑在 30～200 nm 之間，但沉淀法提取的外泌體混有聚乙二醇聚合物及蛋白顆粒。

2.3 外泌體蛋白標志物的鑒定 免疫印跡法檢測結(jié)果表明，超速離心法、沉淀法和尺寸排阻色譜法提取的血清外泌體均表達外泌體蛋白標志物CD9，CD63 和HSP70（見圖3）。

圖3 免疫印跡法鑒定外泌體蛋白標志物

2.4 外泌體提取得率及純度評估 外泌體顆粒數(shù)是評價外泌體提取得率的重要指標，顆粒數(shù)越多表明得率越高，沉淀法提取血清外泌體顆粒數(shù)為（1.11±0.07）×1011particles/ml，高于超速離心 法（2.54±0.04）×1010particles/ml（t=20.79，P<0.001）和尺寸排阻色譜法（7.51±0.89）×1010particles/ml（t=5.39，P= 0.014），尺寸排阻色譜法提取血清外泌體顆粒數(shù)高于超速離心法（t=9.62，P< 0.001），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。以外泌體顆粒數(shù)與蛋白總量比值表示外泌體的提取純度，比值越高表明外泌體純度越高。尺寸排阻色譜法提取外泌體顆粒數(shù)與蛋白總量比值為（5.66±0.45）×107particles/μg，高于超速離心法（7.65±0.42）×106particles/μg（t=18.79，P<0.001）和沉淀法（3.18±0.45）×106particles/μg（t=20.40，P<0.001），超速離心法提取外泌體顆粒數(shù)與蛋白總量比值高于沉淀法（t=4.45，P=0.046），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。以Triton X-100 處理外泌體前后顆粒數(shù)變化表示外泌體破膜純度百分比，百分比越高表明外泌體純度越高。尺寸排阻色譜法提取外泌體破膜純度百分比為（87.06±2.20）%，高于超速離心法（42.13±2.21）%（t=24.92，P<0.001）和沉淀法（26.46±5.37）%（t=18.09，P< 0.001），超速離心法提取外泌體破膜純度高于沉淀法（t=4.67，P=0.042），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

外泌體作為一種新型診斷標志物，具有快速、高效和經(jīng)濟等多方面優(yōu)點，在臨床診斷和治療中具有重要的潛在應(yīng)用價值。但是由于其形成環(huán)境復(fù)雜，直徑小等原因，理想的分離技術(shù)一直是限制外泌體研究和應(yīng)用的關(guān)鍵。

超速離心法是第一種用于外泌體分離的技術(shù)，并且仍然是文獻中最常見的技術(shù)[10]。盡管它已被認為是外泌體分離的“金標準”，但該方法仍然存在一些缺點[11-12]。它費時、費力，并且需要專用的超速離心機，此外，過高的離心速度可能會對外泌體完整性產(chǎn)生影響[13-14]。沉淀法是一種廣泛用于外泌體分離的方法，這種方法大多數(shù)都應(yīng)用了基于聚乙二醇通過離心沉淀獲得外泌體。由于其得率高、操作簡單、成本低廉等優(yōu)點而廣受歡迎。盡管沉淀法得率高，但分離的外泌體純度通常很低，因為幾乎所有可溶性顆粒也會被沉淀下來[15-16]。近年來，尺寸排阻色譜法被越來越廣泛地用作外泌體分離的第二常規(guī)選擇，它高效、操作簡單且耗時短。此外，尺寸排阻色譜法使用重力流原理對外泌體結(jié)構(gòu)及功能損害最小[17]。本研究通過超速離心法、沉淀法和尺寸排阻色譜法提取血清外泌體，并比較其得率與純度。實驗結(jié)果表明，三種方法均能提取出外泌體，超速離心法步驟繁瑣,耗時較長，提取外泌體得率與純度較低；沉淀法操作簡單，耗時短，提取外泌體得率最高，但外泌體純度最低；尺寸排阻色譜法操作簡單，耗時短，提取外泌體得率與純度最高；相比而言，尺寸排阻色譜法優(yōu)于超速離心法和沉淀法。

隨著對外泌體研究的深入，外泌體分離方法也越來越多，不同的分離方法各有特點。本文從得率和純度兩個方面比較了目前常用的超速離心法，沉淀法和尺寸排阻色譜法提取血清外泌體的優(yōu)缺點，希望能為后續(xù)外泌體的研究和應(yīng)用提供參考依據(jù)。研究人員應(yīng)該根據(jù)樣本類型、實驗條件等選擇合理的分離方法，盡可能地在外泌體得率和純度之間找到平衡。