陸小宇,羅 慧,何 鴛,胡鑫潔,周 瑞,朱虹麗,李 楠,陳 梅

(1.陜西中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，陜西 咸陽712021；3.陜西中醫(yī)藥大學 陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 咸陽 712083)

子宮內(nèi)膜癌(Endometrial carcinoma，EC)是原發(fā)于子宮內(nèi)膜的一組上皮性惡性腫瘤，以來源于子宮內(nèi)膜腺體的腺癌最常見[1]。EC沒有明確的中醫(yī)病名，因其主要癥狀為陰道異常出血、排液、經(jīng)期延長等，且大多數(shù)患者在絕經(jīng)后發(fā)病，因此本病屬中醫(yī)“崩漏”“五色帶”“經(jīng)斷復(fù)來”等范疇[2-3]。鳳香洗液是陜西省名中醫(yī)賀豐杰教授研發(fā)的中藥復(fù)方制劑，主要由丁香、苦參、地龍、蛇床子等7味中藥組成，在臨床上被廣泛用于治療陰道炎和宮頸病變，療效較好，且已有臨床實驗研究證明其對于人乳頭瘤病毒感染導(dǎo)致的宮頸上皮內(nèi)瘤變有抑制作用[4]，基于此本研究探討鳳香洗液對EC的干預(yù)機制。網(wǎng)絡(luò)藥理學是研究中藥的前沿學科，主要運用網(wǎng)絡(luò)學方法分析藥物與疾病、靶點之間“多成分、多靶點、多途徑”協(xié)同作用關(guān)系，探討藥物與疾病之間的關(guān)系與變化規(guī)律，從而闡明中藥活性成分及作用機制，預(yù)測中藥作用靶點，為中藥及復(fù)方制劑的進一步研究提供依據(jù)[5-6]。因此，本研究選用方中丁香-苦參兩味中藥，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學方法分析預(yù)測鳳香洗液干預(yù)EC的作用機制。

1 資料與方法

1.1 研究資料 本研究涉及的數(shù)據(jù)來源及分析平臺主要有中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺(Traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)數(shù)據(jù)庫、Gene Cards 數(shù)據(jù)庫、Uniprot 數(shù)據(jù)庫、OMIM 數(shù)據(jù)庫、Cytoscape 3.7.2 軟件、Venny 2.1在線平臺、String數(shù)據(jù)庫、DAVID 數(shù)據(jù)庫。

1.2 研究方法

1.2.1 丁香-苦參活性成分、靶點收集及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：以丁香、苦參為關(guān)鍵詞通過TCMSP數(shù)據(jù)庫搜索活性成分，篩選條件為類藥性(Drug like，DL)≥0.18，-2≤脂水分配系數(shù)(AlogP)≤4；最終篩選出符合條件的候選活性成分，然后將收集到的靶點在 Uniprot 數(shù)據(jù)庫中進行規(guī)范。利用 Cytoscape 3.7.2 軟件分析活性成分-靶點關(guān)聯(lián)信息，構(gòu)建出丁香-苦參活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，并分析候選活性成分和靶點間的度值(Degree)。

1.2.2 EC相關(guān)靶點收集：以“endometrial cancer”為關(guān)鍵詞在Gene Cards 數(shù)據(jù)庫和OMIM 數(shù)據(jù)庫中收集EC相關(guān)靶點。在 Gene Cards 數(shù)據(jù)庫中，靶點與疾病之間的相關(guān)性與Score值大小成正相關(guān)，值越高則代表該靶點與疾病相關(guān)性越大，設(shè)定Score值大于中位數(shù)的目標靶點為潛在疾病靶點[7]，將兩個數(shù)據(jù)庫收集到的靶點合并刪除重復(fù)靶點，最終得到疾病相關(guān)靶點。

1.2.3 活性成分-疾病靶點蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：將藥物活性成分靶點與疾病靶點取交集，使用Venny 2.1在線平臺繪制韋恩圖。將交集靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，選擇“Homo sapiens”物種，將“highest confidence”>0.9設(shè)定為最小互相作用閾值，構(gòu)建共同靶點PPI網(wǎng)絡(luò)，然后導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件，可視化處理得到 PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.4 GO功能注釋和KEGG通路富集分析：將丁香-苦參活性成分、疾病共同靶點導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫，將Select identifier設(shè)定為“Official gene symbol”，限定物種為“Homo sapiens”，List type設(shè)定為Gene list，進行GO功能分析和 KEGG 通路富集分析。

1.2.5 活性成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：運用 Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖，分析活性成分及靶點的網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù)，并根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓撲學參數(shù)判斷核心靶點及發(fā)揮藥效的主要活性成分。

2 結(jié) 果

2.1 丁香-苦參活性成分及靶點的獲取 利用 TCMSP 數(shù)據(jù)庫篩選得到31個活性成分，其中丁香活性成分6個，苦參活性成分25個，見表1。獲得225個丁香活性成分相應(yīng)靶點，465個苦參活性成分相應(yīng)靶點，運用 Cytoscape 3.7.2構(gòu)建活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，圖中深紫色六邊形代表活性成分；淺紫色菱形代表靶點(圖1)。

表1 丁香-苦參主要活性成分

2.2 EC相關(guān)靶點的獲取 從 Gene Cards 數(shù)據(jù)庫獲得EC相關(guān)靶點3249個，篩選后得到2754個；檢索OMIM數(shù)據(jù)庫后補充500個EC相關(guān)靶點，合并后刪除重復(fù)靶點，最終得到1627個EC相關(guān)靶點(圖1)。

2.3 活性成分-疾病靶點 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 通過 TCMSP 數(shù)據(jù)庫共收集31個活性成分，篩選去重后得到203個活性成分靶點，通過韋恩圖將篩選的丁香-苦參活性成分靶點與EC靶點取交集，得到活性成分-疾病共同靶點146個。將共同靶點提交至String數(shù)據(jù)庫，獲取相互作用關(guān)系的網(wǎng)絡(luò)，將TSV 文本導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件進行網(wǎng)絡(luò)拓撲學分析。結(jié)果顯示PPI網(wǎng)絡(luò)共包含138個節(jié)點，656條邊，根據(jù)Degree值>15篩選出27個重要靶點，分別是：AKT1、TP53、TNF、JUN、MAPK1、RELA、IL6、MAPK14、ESR1、MAPK8、VEGFA、FOS、RB1、CCND1、EGFR、NR3C1、RXRA、CASP8、INS、NCOA1、IL1B、CXCL8、MYC、CDKN1A、CASP3、IL4、STAT1，提示以上靶點在丁香-苦參干預(yù)EC過程具有重要意義(圖2)。

圖2 丁香-苦參干預(yù)EC核心靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 GO功能注釋和KEGG通路富集分析 將從上述研究中篩選得到的核心靶基因?qū)隓AVID數(shù)據(jù)庫中進行GO功能注釋和KEGG通路富集的分析。GO功能注釋共導(dǎo)出生物過程595個，以P<0.01且Count值≥20為條件進行篩選，得到GO生物過程12個，見表2。說明丁香-苦參可能通過RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、凋亡過程的負調(diào)控等生物過程發(fā)揮干預(yù)EC的作用。

表2 丁香-苦參活性成分與EC共同靶點GO功能注釋分析表

進一步進行KEGG分析，KEGG的分析共導(dǎo)出通路115條，再按照P<0.01且Count值≥25的條件選擇通路，得到KEGG通路8條，見表3。GO功能注釋和KEGG通路富集分析結(jié)果來看，丁香-苦參可能通過癌癥通路、PI3K-Akt信號通路等來發(fā)揮干預(yù)EC的治療作用。

表3 丁香-苦參活性成分與EC共同靶點KEGG富集分析

2.5 活性成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過 Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建活性成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)共包含 197個節(jié)點，1032條邊，綠色的六邊形節(jié)點代表藥物的活性成分，深綠色菱形節(jié)點代表核心靶點，藍色倒三角節(jié)點代表通路；節(jié)點的面積代表其度數(shù)，節(jié)點的重要程度與面積成正相關(guān)(圖3)。通過 Cytoscape 3.7.2 內(nèi)置的Network Analyzer 分析網(wǎng)絡(luò)拓撲學參數(shù)，得到核心成分及核心作用靶點。槲皮素連接度為107，介度為0.2451，緊密度為0.6049，預(yù)測槲皮素為丁香-苦參干預(yù)EC的最主要成分，見表4。前列腺素G/H合酶 2(PTGS2)在網(wǎng)絡(luò)中的連接度為30，介度為0.0818，緊密度為0.5065，預(yù)測PTGS2為丁香-苦參干預(yù)EC的最主要靶點；癌癥通路連接度為54，介度為0.057，緊密度為0.456，預(yù)測癌癥通路為丁香-苦參干預(yù)EC的最主要通路。

圖3 丁香-苦參活性成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖

表4 丁香-苦參主要成分網(wǎng)絡(luò)節(jié)點特征參數(shù)

3 討 論

EC在我國女性惡性腫瘤中發(fā)病率僅次于宮頸癌，且發(fā)病年齡逐漸年輕化，嚴重危害女性生命健康[8]。目前，EC早期多釆用手術(shù)聯(lián)合化療，晚期或無法手術(shù)的患者主要釆取放、化療及激素為主的治療方法，不良反應(yīng)較多，中醫(yī)藥在治療本病方面具有一定優(yōu)勢[9]。中藥具有多成分、多靶點、多通路的協(xié)同調(diào)控作用，作用機制復(fù)雜多樣，對于多種疾病的防治具有自身的特色和優(yōu)勢[10-11]。鳳香洗液經(jīng)過長期臨床實踐和實驗觀察，具有抗腫瘤、抗病毒及殺蟲作用，同時在調(diào)節(jié)局部免疫方面發(fā)揮著重要作用[12]。丁香性溫，味辛，歸脾胃、腎經(jīng)?，F(xiàn)代藥理研究表明，丁香屬植物具有抑制病毒生長、抗菌消炎、抗氧化等作用[13]。丁香所含酚苷類化合物紫丁香苷可以誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡信號通路，其抗氧化活性能有效減少和對抗自由基的傷害，從而發(fā)揮抗腫瘤的功效[14]?？鄥⑿院犊?，歸心、肝、胃、大腸和膀胱經(jīng)?，F(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)苦參能增加網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞的吞噬作用，具有殺蟲止癢、抗菌、抗病毒及抗腫瘤等功效[15]。另外，苦參可通過阻滯腫瘤細胞周期、誘導(dǎo)細胞凋亡和改善腫瘤炎癥微環(huán)境等多種途徑發(fā)揮抗癌作用[16]。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學研究方法，分析鳳香洗液中丁香和苦參兩味中藥干預(yù)EC的有效成分、潛在靶點、作用通路及潛在分子機制，為鳳香洗液治療EC提供理論依據(jù)?；钚猿煞?靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖顯示，槲皮素、芹菜素、木犀草素、山奈酚和芒柄花黃素5種活性成分關(guān)聯(lián)度較高，說明這5種成分可能是丁香-苦參干預(yù)EC的關(guān)鍵活性成分。丁香-苦參兩味中藥排名第一的活性成分均是槲皮素，槲皮素是廣泛存在于植物中的黃酮類化合物，其對多種腫瘤細胞具有明顯的抑制作用，可誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，阻滯細胞周期，調(diào)控細胞信號通路，通過抑制腫瘤細胞內(nèi)多種耐藥相關(guān)蛋白的活性及表達，起到逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞耐藥性的作用[17-20]。芹菜素屬于天然的黃酮類化合物，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等多種生物學作用[21]。芹菜素可通過PI3K/Akt信號通路激活凋亡蛋白Caspase-3，誘導(dǎo)細胞凋亡，同時下調(diào)周期蛋白Cyclin D1、D3和Cdk4阻滯細胞周期，抑制Hela細胞的增殖。芒柄花黃素及其衍生物因具有雌激素活性而發(fā)揮有效的抗癌作用。采用芒柄花黃素干預(yù)EC細胞HEC-1A荷瘤裸鼠，其通過下調(diào)內(nèi)源性FOXA1、GATA-3蛋白表達維持體內(nèi)的內(nèi)分泌平衡從而抑制EC[22]。

活性成分-靶點-信號通路的網(wǎng)絡(luò)拓撲屬性分析結(jié)果顯示，丁香-苦參干預(yù)EC的靶點主要包括前列腺素G/H合酶2(PTGS2)、AKT1、前列腺素G/H合酶1(PTGS1)、轉(zhuǎn)錄因子p65(RELA)、絲氨酸蛋白酶(PRSS1)及絲裂原活化蛋白激酶家族成員(MAPK1)等。PTGS2是生成前列腺素的關(guān)鍵酶，PTGS2基因的擴增與過表達與炎癥、心血管疾病、某些上皮腫瘤、消化系統(tǒng)良性癌前病變和惡性腫瘤關(guān)系密切[23-25]。同時PTGS2基因是包括宮頸癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等腫瘤疾病易感性和預(yù)后的生物標志物[26]。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，參與包括細胞增殖與代謝、周期與轉(zhuǎn)錄調(diào)控等多種生物學過程，并參與炎癥、腫瘤、糖尿病及心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[27]。AKT1在腫瘤細胞的存活與增殖過程中的作用舉足輕重，缺乏AKT1可導(dǎo)致乳腺上皮腫瘤細胞的增殖能力降低，抑制AKT1的表達可誘導(dǎo)肝癌細胞自噬死亡[28-30]。

GO功能注釋和KEGG信號通路富集分析發(fā)現(xiàn)丁香-苦參活性成分主要體現(xiàn)在RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、凋亡過程負調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞增殖的正調(diào)控、凋亡過程等生物過程。KEGG通路富集分析顯示主要涉及癌癥信號、PI3K/Akt、乙肝、癌癥蛋白聚糖信號通路等，其中癌癥通路的靶點富集數(shù)目最多。PI3K/Akt作為細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，介導(dǎo)多種細胞和分子功能，包括細胞的存活、增殖與代謝，多種類型癌癥中均存在此通路的表達失調(diào)，其可促進腫瘤的進展和耐藥。PI3K/Akt信號通路在EC的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，紫草素通過抑制PI3K/Akt信號通路中Akt的磷酸化，上調(diào)Akt下游靶蛋白Bax或下調(diào)Bcl-2誘導(dǎo)EC Ishikawa細胞凋亡，發(fā)揮抗EC作用[31]。

綜上所述，本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法分析得出鳳香洗液中丁香-苦參干預(yù)EC的主要活性成分可能是槲皮素、芹菜素、木犀草素、山奈酚及芒柄花黃素等，并可能通過作用于PTGS2、AKT1、PTGS1、RELA、PRSS1、MAPK1等靶點，調(diào)控癌癥、PI3K/Akt及癌癥蛋白聚糖等信號通路抑制腫瘤細胞增殖、阻礙其侵襲與轉(zhuǎn)移以及逆轉(zhuǎn)腫瘤的耐藥性等，從而達到干預(yù)EC的目的，體現(xiàn)了鳳香洗液多成分-多靶點-多途徑干預(yù)EC的特點。本研究結(jié)果初步驗證鳳香洗液中丁香-苦參配伍干預(yù)EC的作用機制，為后期的實驗研究方向提供了思路與參考。鳳香洗液由7種中藥組成，本文僅對方中丁香-苦參干預(yù)EC的主要活性成分及機制進行預(yù)測分析，未考慮藥物各成分、化合物之間的相互作用，藥物體內(nèi)代謝過程及給藥途徑的選擇等因素對結(jié)果的影響，因此具有一定的局限性，需要進一步通過藥理和臨床實驗驗證。