袁文婷,肖茂良,肖 鋒

(湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校附屬第一醫(yī)院 湖南省直中醫(yī)醫(yī)院，湖南 株洲412000)

胰腺癌主要臨床表現(xiàn)為乏力、黃疸、食欲不振、腹部疼痛，具有早期診斷率低、惡性程度高、治療難度大、病死率高、預(yù)后差的特點(diǎn)，對(duì)患者身體健康及生命造成嚴(yán)重威脅[1-4]。據(jù)相關(guān)流行病學(xué)調(diào)查顯示，近年來我國胰腺癌癥狀發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)[5-6]。有研究表明，胰腺癌治療難度較大，西醫(yī)治療胰腺癌的療效并不理想，因此越來越多的專家學(xué)者致力于中醫(yī)藥治療胰腺癌的研究[7]。有研究證實(shí)，中藥提取物干預(yù)胰腺癌細(xì)胞能夠抑制其增殖，促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞凋亡，但是關(guān)于中藥提取物干預(yù)胰腺癌動(dòng)物模型的研究鮮有報(bào)道[8-9]。本文采用半枝蓮提取物干預(yù)胰腺癌模型大鼠，觀察其對(duì)胰腺癌細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞亞群、Wnt/β-catenin通路及PI3K-Akt信號(hào)通路蛋白的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD健康雄性大鼠40只，由吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，年齡8～10個(gè)月，平均(9.0±0.8)個(gè)月；體重220～234 g，平均(226.9±4.7)g。在相對(duì)濕度50%～55%、溫度(24.1±2.1)℃的環(huán)境中喂養(yǎng)大鼠1周，光照12 h/d。

1.1.2 主要試劑：半枝蓮(亳州市億弘堂藥業(yè)有限公司)；小鼠抗大鼠Wnt3α抗體(批號(hào)H20181002，Hyclone公司)；兔抗大鼠β-catenin抗體(批號(hào)H20180901，Selleck公司)；小鼠抗兔PI3K抗體(批號(hào)H20181101,Dako公司)；兔抗小鼠Akt抗體(批號(hào)H20180801，BD公司)；大鼠抗小鼠mTOR抗體(批號(hào)H20181001，Gibco公司)；CD8+、CD4+、CD3+單克隆抗體(批號(hào)H20180302、H20180401、H20181001)；PBS(批號(hào)H20181102)；蛋白酶K(批號(hào)H20181001)；平衡緩沖液(批號(hào)H20181201)；SSC溶液(批號(hào)H20180701)；TdT酶反應(yīng)液(批號(hào)H20180802)；聚丙烯酰胺凝膠(批號(hào)H20181202)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 半枝蓮提取物制備：半枝蓮50 g粉碎得到半枝蓮粉，按照1∶20比例添加70%乙醇靜置24 h，70 ℃水浴處理4次，2 h/次，過濾，取濾液，按照1∶20比例向藥渣內(nèi)添加蒸餾水，加熱2 h，取濾液，合并2次所得濾液，按照1 g半枝蓮提取液=5.14 g半枝蓮生藥換算，添加0.9%的氯化鈉溶液配制不同濃度半枝蓮提取物溶液。

1.2.2 建模、分組與給藥：隨機(jī)選取10只大鼠為正常組，不做任何處理。其余30只大鼠建立胰腺癌模型，方法如下：對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉后固定，于腹部正中做10 mm小切口，顯露出胰腺組織，將胰腺被膜及胰腺實(shí)質(zhì)切開1 mm，植入9 mg DMBA(批號(hào)H20180901)后縫合切口，消毒。30 d后大鼠皮下出現(xiàn)1 cm左右結(jié)節(jié)為胰腺癌建模成功。30只大鼠共建模成功24只，隨機(jī)分為模型組、低濃度半枝蓮組、高濃度半枝蓮組各8只。正常組、模型組大鼠予0.9%的氯化鈉溶液灌胃處理，低濃度半枝蓮組、高濃度半枝蓮組大鼠分別使用20、60 mg/kg半枝蓮提取物溶液灌胃處理，每組均連續(xù)干預(yù)14 d，1次/d。

1.2.3 標(biāo)本的采集與處理：所有大鼠干預(yù)結(jié)束后，取尾部靜脈血2 ml，2000 r/min離心處理15 min后分離上清液，在-80 ℃環(huán)境中保存待檢。采用斷頭法處死大鼠，分離胰腺組織，測(cè)量胰腺腫瘤組織體積、重量后將其固定于4%甲醛溶液24 h。

1.2.4 組織病理學(xué)檢測(cè)：將標(biāo)本于甲醛溶液內(nèi)固定后予常規(guī)石蠟包埋并切片，切片烤干后脫蠟，順序置入不同濃度梯度酒精中各復(fù)水3 min，蘇木精染色15 min后清洗3次，鹽酸酒精分化處理30 s，充分清洗后予1%伊紅染色，酒精脫水，脫蠟，封片后顯微鏡下觀察。

1.2.5 T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)：待測(cè)標(biāo)本予抗凝處理后分為兩管，分別加入20 μl的CD8+、CD4+、CD3+單克隆抗體，室溫環(huán)境下孵育30 min后在各管內(nèi)加入融血?jiǎng)?，待其完全溶血后離心，3000 r/min，離心5 min，棄上清液，洗滌液洗滌后在各管內(nèi)加入150 μl固定劑，加入0.5 ml的PBS混合均勻制備為懸液，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD8+、CD4+、CD3+水平。

1.2.6 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡：細(xì)胞常溫下予20 μg/ml蛋白酶K培養(yǎng)0.5 h后去除蛋白，清洗后加入100 μl平衡緩沖液，室內(nèi)平衡10 min，滴入100 μl的TdT酶反應(yīng)液，避光、室溫孵育1 h后加入100 μl的SSC溶液，靜置20 min后清洗3次，DAPI復(fù)染，避光培養(yǎng)10 min后清洗、封片觀察。DAPI復(fù)染細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡細(xì)胞細(xì)胞核呈綠色，取每切片3個(gè)視野進(jìn)行觀察，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.2.7 蛋白印跡法檢測(cè)Wnt3α、β-catenin、PI3K、Akt、mTOR相對(duì)表達(dá)量：取Ripa裂解液，PMSF冰中孵育30 min，1500 r/min，離心15 min，取上清。每個(gè)樣品取15 g蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)入PDVF膜，5%脫脂牛奶常溫密封2 h，加入抗體過夜孵育，TBST液沖洗，加入二抗，60 min后清洗、顯色，計(jì)算Wnt3α、β-catenin、PI3K、Akt、mTOR相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠胰腺組織形態(tài)學(xué)比較 正常組大鼠胰腺組織細(xì)胞排列整齊，大小一致，界限清晰，細(xì)胞核均勻；模型組大鼠胰腺組織細(xì)胞細(xì)胞排列較為雜亂，且伴有嚴(yán)重炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象；高濃度半枝蓮組大鼠胰腺組織細(xì)胞排列較為整齊，大小相對(duì)一致，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象明顯緩解(圖1)。

圖1 各組大鼠胰腺組織形態(tài)圖(HE染色，×400)

2.2 各組大鼠腫瘤組織體積、重量比較 見表1。與模型組比較，低濃度半枝蓮組、高濃度半枝蓮組大鼠腫瘤組織體積小、重量均輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與低濃度半枝蓮組比較，高濃度半枝蓮組大鼠腫瘤組織體積小、重量均輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組大鼠腫瘤組織體積、重量比較

2.3 各組大鼠CD8+、CD4+、CD3+水平比較 見表2。與正常組大鼠比較，模型組、低濃度半枝蓮組、高濃度半枝蓮組大鼠CD8+水平較高，CD4+、CD3+水平較均低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，低濃度半枝蓮組、高濃度半枝蓮組大鼠CD8+水平較低，CD4+、CD3+水平均較高，且高濃度半枝蓮組大鼠CD8+水平低于低濃度半枝蓮組，CD4+、CD3+水平均高于低濃度半枝蓮組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各組大鼠CD8+、CD4+、CD3+水平比較(%)

2.4 各組大鼠腫瘤組織細(xì)胞凋亡率比較 低濃度半枝蓮組、高濃度半枝蓮組大鼠細(xì)胞凋亡率分別為(16.59±2.13)%、(25.71±2.96)%，均高于模型組(2.98±0.39)%的細(xì)胞凋亡率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且高濃度半枝蓮組大鼠細(xì)胞凋亡率高于低濃度半枝蓮組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.5 各組大鼠Wnt3α、β-catenin相對(duì)表達(dá)量比較 見表3。與正常組大鼠比較，模型組、低濃度半枝蓮組、高濃度半枝蓮組大鼠Wnt3α、β-catenin相對(duì)表達(dá)量均較高，且低濃度半枝蓮組、高濃度半枝蓮組大鼠Wnt3α、β-catenin相對(duì)表達(dá)量均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與低濃度半枝蓮組比較，高濃度半枝蓮組大鼠Wnt3α、β-catenin相對(duì)表達(dá)量均較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 各組大鼠Wnt3α、β-catenin相對(duì)表達(dá)量比較

2.6 各組大鼠PI3K、Akt、mTOR相對(duì)表達(dá)量比較 見表4。與正常組比較，模型組、低濃度半枝蓮組、高濃度半枝蓮組大鼠PI3K、Akt、mTOR相對(duì)表達(dá)量均較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且低濃度半枝蓮組、高濃度半枝蓮組大鼠PI3K、Akt、mTOR相對(duì)表達(dá)量均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與低濃度半枝蓮組比較，高濃度半枝蓮組大鼠PI3K、Akt、mTOR相對(duì)表達(dá)量均較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表4 各組大鼠PI3K、Akt、mTOR相對(duì)表達(dá)量比較

3 討 論

胰腺癌作為臨床上惡性程度極高的腫瘤，5年生存率低于5%，其發(fā)病原因及發(fā)病機(jī)制尚未闡明[10-11]。西醫(yī)抗腫瘤藥物具有較多的不良反應(yīng)，中醫(yī)藥治療惡性腫瘤則具有細(xì)胞毒性小的優(yōu)勢(shì)[12]。半枝蓮有悠久的藥用歷史，具有化瘀、解毒、清熱、調(diào)節(jié)免疫等功效。有研究表示，半枝蓮能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、自噬，抑制細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移，具有一定的抗腫瘤作用[13-14]。本研究顯示，半枝蓮提取物干預(yù)的胰腺癌大鼠腫瘤組織體積減小、重量減輕，且隨半枝蓮提取物濃度升高，腫瘤組織體積、重量下降幅度越大，說明半枝蓮提取對(duì)胰腺癌組織的生長(zhǎng)具有一定的抑制作用，且呈濃度依賴性，其原因可能是半枝蓮提取物能夠有效促進(jìn)胰腺癌大鼠癌細(xì)胞凋亡，抑制癌組織的生長(zhǎng)。胰腺癌的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞增殖、凋亡關(guān)系密切，其可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞凋亡，抑制胰腺癌細(xì)胞增殖，抑制進(jìn)一步擴(kuò)散[15-17]。本研究對(duì)胰腺癌大鼠癌細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示，半枝蓮提取物干預(yù)胰腺癌模型后，胰腺癌細(xì)胞凋亡率明顯上升。說明半枝蓮提取物具有促進(jìn)胰腺癌組織細(xì)胞凋亡的作用，且呈濃度依賴性。

胰腺癌的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體免疫功能水平密切相關(guān)，調(diào)節(jié)胰腺癌患者免疫功能是治療及改善其預(yù)后的關(guān)鍵[18]。T淋巴細(xì)胞亞群是評(píng)價(jià)機(jī)體細(xì)胞免疫功能的指標(biāo)，本文研究結(jié)果顯示，與正常大鼠比較，胰腺癌模型大鼠T淋巴細(xì)胞亞群CD8+、CD4+、CD3+水平明顯異常，半枝蓮提取物干預(yù)的胰腺癌大鼠CD8+、CD4+、CD3+水平明顯改善，且隨半枝蓮提取物濃度升高，CD8+、CD4+、CD3+水平改善更明顯，說明胰腺癌可導(dǎo)致機(jī)體免疫功能異常，半枝蓮提取物具有調(diào)節(jié)免疫的作用，且呈濃度依賴性。

Wnt/β-catenin通路參與癌細(xì)胞分化、自噬等生物學(xué)行為，Wnt3α、β-catenin是Wnt/β-catenin通路的主要配體，二者表達(dá)的變化與細(xì)胞自噬、凋亡密切相關(guān)[19-20]。本研究結(jié)果顯示，胰腺癌模型大鼠癌組織Wnt3α、β-catenin表達(dá)異常升高，半枝蓮提取干預(yù)后胰腺癌大鼠癌組織Wnt3α、β-catenin表達(dá)明顯下調(diào)，隨半枝蓮提取物濃度升高，Wnt3α、β-catenin表達(dá)下調(diào)更顯著，說明半枝蓮提取物干預(yù)胰腺癌模型大鼠，能夠通過Wnt/β-catenin通路調(diào)控胰腺癌細(xì)胞分化、自噬能力，從而抑制胰腺癌進(jìn)展。PI3K-Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白P13K、Akt、mTOR表達(dá)變化與細(xì)胞凋亡能力密切相關(guān)，參與胰腺癌的發(fā)病[21-22]。本研究結(jié)果顯示，胰腺癌模型大鼠癌組織P13K、Akt、mTOR異常高表達(dá)，半枝蓮提取物干預(yù)的胰腺癌大鼠癌組織P13K、Akt、mTOR蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，隨半枝蓮提取物濃度的升高，P13K、Akt、mTOR表達(dá)下調(diào)更顯著，說明半枝蓮提取物干預(yù)胰腺癌模型大鼠通過調(diào)控PI3K-Akt信號(hào)通路，促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞凋亡，抑制胰腺癌進(jìn)展。

綜上所述，半枝蓮提取物可抑制胰腺癌模型大鼠腫瘤組織，調(diào)控胰腺癌大鼠T淋巴細(xì)胞亞群水平，調(diào)控Wnt/β-catenin通路及PI3K-Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)，促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞自噬、凋亡。