王炎炎，翟鳳霞

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450462；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510504)

新型冠狀病毒肺炎(Corona virus disease 2019，COVID-19)傳染性強(qiáng)，傳播途徑廣泛，人群普遍易感，感染者易出現(xiàn)急性肺損傷，且出現(xiàn)多系統(tǒng)并發(fā)癥[1-3]。新型冠狀病毒肺炎屬于中醫(yī)“瘟疫”“疫病”范疇，病機(jī)為邪氣內(nèi)侵、正氣不足，病位在肺，基本病機(jī)特點(diǎn)為“濕、熱、毒、瘀”。我國(guó)預(yù)防COVID-19以中醫(yī)藥為主，實(shí)踐證明中醫(yī)藥對(duì)其有較好的防治作用[4-7]。經(jīng)河南省疾控中心實(shí)驗(yàn)室病毒測(cè)序，河南省本輪疫情主要為德?tīng)査局暌穑鋫鞑ツ芰υ诂F(xiàn)有毒株中最強(qiáng)，能更好的逃避宿主免疫系統(tǒng)，有傳播速度快、病毒載量高、發(fā)病時(shí)間短、治療時(shí)間長(zhǎng)、隱匿性強(qiáng)等特點(diǎn)[8]。

中醫(yī)“治未病”思想貫穿COVID-19預(yù)防、治療和康復(fù)的全過(guò)程，通過(guò)調(diào)理體質(zhì)、扶正祛邪等，未病先防，既病防變，是防疫的重要屏障之一，且能緩解患者癥狀，減少輕癥向重癥發(fā)展，提高治愈率，降低病死率，促進(jìn)恢復(fù)期患者康復(fù)[9-10]。從“三因制宜”學(xué)說(shuō)來(lái)看，河南省本次新冠肺炎發(fā)病在夏季和洪澇之后，“濕毒夾暑”的特征較為明顯。2021年8月，鄭州市新冠肺炎疫情防控領(lǐng)導(dǎo)小組辦公室發(fā)布新冠肺炎預(yù)防處方(成人方)，以期降低傳染風(fēng)險(xiǎn)，處方以健脾利濕、清熱解暑為治則，具體方藥：黃芪、白術(shù)、防風(fēng)、茯苓、陳皮、蒼術(shù)、藿香、薏苡仁、金銀花、連翹、貫眾。本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步探討河南省新冠肺炎預(yù)防方(成人方)預(yù)防COVID-19的作用機(jī)制，并運(yùn)用分子對(duì)接技術(shù)尋找配體與受體活性位點(diǎn)的低能結(jié)合模式[11-14]，為臨床及基礎(chǔ)科學(xué)研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究資料 本研究數(shù)據(jù)來(lái)源及運(yùn)算平臺(tái)包括中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)及分析平臺(tái)(Traditional Chinese medicine systems pharmacology，TCMSP)、人類(lèi)基因數(shù)據(jù)庫(kù)Gene Cards、人類(lèi)在線(xiàn)孟德?tīng)栠z傳學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(Online mendelian inheritance in man，OMIM)、String數(shù)據(jù)庫(kù)、Pub Chem數(shù)據(jù)庫(kù)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)(Protein data bank，PDB)、Uni Prot數(shù)據(jù)庫(kù)、Strawberry-Perl 5.30.2.1軟件、Cytoscape 3.8.2軟件、R 4.1.0軟件、ChemBio3D Ultra 14.0軟件、PyMOL軟件、Auto Dock 軟件、Vina軟件。

1.2 研究方法

1.2.1 河南省新冠肺炎預(yù)防方(成人方)有效成分及靶點(diǎn)收集：在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)以“黃芪、蒼術(shù)、白術(shù)、防風(fēng)、藿香、薏苡仁、茯苓、金銀花、連翹、陳皮、貫眾”11味藥物為檢索詞，并以口服生物利用度(OB)≥30%、藥物相似性(DL)≥0.18作為篩選條件[15-16]。在TCMSP靶點(diǎn)模塊查詢(xún)單味中藥活性成分靶點(diǎn)，通過(guò)Strawberry-Perl 5.30.2.1軟件和Uni Prot數(shù)據(jù)庫(kù)將靶點(diǎn)蛋白名稱(chēng)轉(zhuǎn)換為靶點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)基因名稱(chēng)。使用Cytoscape 3.8.2軟件進(jìn)行可視化處理，構(gòu)建“活性成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.2 COVID-19相關(guān)靶點(diǎn)收集：通過(guò)Gene Cards、OMMI數(shù)據(jù)庫(kù)，分別使用“Novel coronavirus pneumonia”“New coronavirus”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，以Execl文件導(dǎo)出，匯總整理COVID-19相關(guān)靶點(diǎn)，得到疾病相關(guān)靶點(diǎn)。

1.2.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及拓?fù)浞治觯和ㄟ^(guò)R 4.1.0軟件和Venn Diagram工具包，將疾病靶點(diǎn)和藥物活性成分對(duì)應(yīng)的靶蛋白取交集，生成韋恩圖及活性成分與疾病靶點(diǎn)的交集文件。利用String數(shù)據(jù)庫(kù)，將所得交集文件導(dǎo)入，設(shè)置檢索物種為“Homo sapiens”，Score值≥0.9進(jìn)行篩選。將篩選結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件，通過(guò)Cytoscape的CytoNCA插件篩選網(wǎng)絡(luò)中的重要節(jié)點(diǎn)。

1.2.4 GO功能富集和KEGG通路分析：將有效活性成分與疾病靶點(diǎn)的交集基因通過(guò)R 4.1.0軟件進(jìn)行GO功能富集和KEGG通路分析，結(jié)果導(dǎo)出后，以P≤0.01為條件篩選通路，使用R語(yǔ)言對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

1.2.5 分子對(duì)接：依據(jù)度值，選取排名前5位的多味中藥共有活性成分，與3C樣蛋白酶(3-chymotrypsin-like protease,3CLpro)和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶Ⅱ(Angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)進(jìn)行分子對(duì)接，從Pub Chem 數(shù)據(jù)庫(kù)下載關(guān)鍵化合物2D結(jié)構(gòu)，通過(guò)ChemBio3D Ultra 14.0構(gòu)建3D結(jié)構(gòu)，完成小分子配體文件準(zhǔn)備；從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)下載獲取3CLpro(PDB ID∶6LU7)及ACE2(PDB ID∶1R42)的3D結(jié)構(gòu)，使用PyMOL軟件對(duì) 6LU7、1R42去水、刪除小分子配體等，完成蛋白受體準(zhǔn)備。利用Auto Dock軟件將化合物及靶蛋白格式轉(zhuǎn)換為PDPQT格式，尋找活性口袋，最后運(yùn)行Vina將河南省新冠肺炎預(yù)防方(成人方)中核心活性成分與6LU7、1R42分別進(jìn)行分子對(duì)接。

2 結(jié) 果

2.1 河南省新冠肺炎預(yù)防方(成人方)活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖 在TCMSP中以 OB≥30%且 DL≥0.18為篩選條件，共得到活性化合物147個(gè)。從OMOM、Gene Cards中分別獲取到14、2559個(gè)COVID-19相關(guān)靶點(diǎn)，在Gene Cards中設(shè)定Relevancescore≥1.0基因共得到2431個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)，去重后共獲得2428個(gè)COVID-19相關(guān)靶點(diǎn)，將河南省新冠肺炎預(yù)防方(成人方)有效成分預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與COVID-19的靶點(diǎn)通過(guò)R軟件“Venn Diagram”取交集，最終得到165個(gè)河南省新冠肺炎預(yù)防方(成人方)預(yù)防COVID-19的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。將有效成分、靶點(diǎn)進(jìn)行整理，構(gòu)建河南省新冠肺炎預(yù)防方(成人方)預(yù)防COVID-19成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖(圖1)，共得到249個(gè)節(jié)點(diǎn)，775條邊。

圖1 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.2 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 藥物活性成分與疾病共有165個(gè)共同靶點(diǎn)，通過(guò)String軟件對(duì)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白互作分析，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape，借助CytoNCA插件進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，通過(guò)Degree、Closeness Centrality、Betweenness Centrality等節(jié)點(diǎn)參數(shù)進(jìn)行核心節(jié)點(diǎn)篩選，獲得河南省新冠肺炎預(yù)防方(成人方)預(yù)防COVID-19的16個(gè)核心靶點(diǎn)(圖2)。

圖2 核心靶點(diǎn)圖

2.3 GO功能富集和KEGG通路分析 通過(guò)R軟件進(jìn)行GO功能富集分析，得到GO條目2746個(gè)，其中生物過(guò)程(BP)條目2443個(gè)，細(xì)胞組成(CC)條目98個(gè)，分子功能(MF)條目205個(gè)，分別占88.9%、3.5%、7.4%，取排名前20位的條目(圖3)。KEGG通路篩選得到179條信號(hào)通路，涉及新型冠狀病毒肺炎、甲型流感、軍團(tuán)菌病、PI3K-Akt、MAPK、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、T細(xì)胞受體等信號(hào)通路，其中新型冠狀病毒肺炎涉及MAPK14、RELA、JUN、IL6ST、MMP1、CCL2、CXCL8、MAPK3、MAPK1、MAPK8、PRKCA、IKBKB、STAT1、MMP3、EGFR、FOS、NFKBIA、IL1B、IL2、CXCL10、CHUK，取排名前20位的條目(圖4)。

圖3 作用靶點(diǎn)GO功能分析圖

圖4 作用靶點(diǎn)KEGG富集分析圖

2.4 SARS-CoV-2 3CLpro及ACE2受體與活性化合物分子對(duì)接驗(yàn)證 河南省新冠肺炎預(yù)防方(成人方)11種中藥中度值位于前5名的活性成分為槲皮素、山萘酚、β-谷甾醇、漢黃芩素、木犀草素，分別與3Clpro、ACE2進(jìn)行對(duì)接。分子對(duì)接結(jié)果顯示核心活性化合物與3CLpro及ACE2 受體的分子對(duì)接親和力均<5.0 kJ/mol，提示核心活性化合物與3CLpro及ACE2 受體有較好的結(jié)合活性，見(jiàn)表1(圖5)。

表1 河南省新冠肺炎預(yù)防方(成人方)核心活性成分與3CLpro和ACE2的結(jié)合能

圖5 核心活性成分與3CLpro和ACE2分子對(duì)接圖

3 討 論

本研究共得到河南省新冠肺炎預(yù)防方(成人方)147個(gè)有效活性成分。通過(guò)“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)分析中發(fā)現(xiàn)槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、漢黃芩素、木犀草素等11個(gè)化合物的度值遠(yuǎn)高于平均度值，提示其為該方的關(guān)鍵活性成分。其中槲皮素是度值最高的有效成分，藥理研究顯示，槲皮素通過(guò)阻斷 MAPK信號(hào)通路活化，抑制炎癥細(xì)胞因子釋放，降低組織和機(jī)體的炎癥反應(yīng)，具有抗癌、抗氧化及清除自由基、抗炎、抗血栓、抗病毒、改善肺纖維化、心血管保護(hù)及免疫調(diào)節(jié)等重要的藥理學(xué)作用。木犀草素有抗炎、抗過(guò)敏、降尿酸、抗腫瘤、抗菌、抗病毒等藥理活性，在體外具有抗甲型流感病毒活性[17-18]。何黎黎等[19]發(fā)現(xiàn)，漢黃芩素通過(guò)抑制TNF-α、IL-6和IL-1β的表達(dá)，減少肺組織炎性病理?yè)p傷和炎癥。山奈酚有抗氧化、抗炎、抗癌、保護(hù)損傷細(xì)胞多種功能，體外研究已證明山奈酚具有體外抗氧化能力，其可通過(guò)抑制p38MAPK信號(hào)通路發(fā)揮抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用，且對(duì)急性肺損傷有一定的保護(hù)效應(yīng)，可顯著抑制急性肺損傷引起的氧化-抗氧化平衡失調(diào)[20-22]。β-谷甾醇在體外試驗(yàn)?zāi)苡行Ы档脱仔约?xì)胞因子的過(guò)表達(dá)，保護(hù)脂多糖所致的小鼠急性肺損傷，表現(xiàn)出良好的免疫調(diào)節(jié)和抗炎活性[23-24]。

在Cytoscape軟件CytoNCA插件進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，獲得河南省新冠肺炎預(yù)防方(成人方)預(yù)防COVID-19的關(guān)鍵靶點(diǎn)共16個(gè)，這些可能是該方的潛在靶點(diǎn)。SARS-CoV-2通過(guò)其表達(dá)的刺突蛋白結(jié)合ACE2進(jìn)入細(xì)胞，病毒侵入機(jī)體而致病[25]。有研究在感染SARS-CoV-2的細(xì)胞中分離出ACE2，證實(shí)細(xì)胞中ACE2的表達(dá)量與刺突蛋白的易感性呈正相關(guān)，當(dāng)宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)染ACE2后，病毒的復(fù)制能力增強(qiáng)[26]。3CLpro是病毒復(fù)制過(guò)程至關(guān)重要的蛋白酶，它能將兩個(gè)病毒翻譯過(guò)程中的多聚蛋白PPIA和PP1AB水解成單獨(dú)的功能成分，且3CLpro序列高度保守，目前在人體尚未發(fā)現(xiàn)其他相似的水解酶[27-29]。故將3CLpro、ACE2作為靶標(biāo)篩選蛋白受體。分子對(duì)接結(jié)果顯示，該方主要化學(xué)成分與3CLpro、ACE2結(jié)合能均遠(yuǎn)小于-5.0 kJ/mol，提示篩選所得化學(xué)成分均能和受體蛋白結(jié)合性好、親和力高，構(gòu)象穩(wěn)定。

GO功能富集分析結(jié)果顯示，其主要涉及活性氧生物合成過(guò)程，凋亡信號(hào)通路，細(xì)胞對(duì)外界刺激、化學(xué)應(yīng)激及藥物的反應(yīng)，炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、受體配體活性、趨化因子等生物過(guò)程，通過(guò)調(diào)控炎癥、細(xì)胞增殖、免疫、抑制氧化應(yīng)激狀態(tài)等預(yù)防COVID-19。KEGG通路分析結(jié)果顯示，該方在防治疾病中可能涉及COVID-19、甲型流感、軍團(tuán)菌病、PI3K-Akt、MAPK、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、T細(xì)胞受體等信號(hào)通路，證明其活性成分通過(guò)多途徑調(diào)節(jié)免疫及炎癥反應(yīng)，減少機(jī)體損傷，發(fā)揮治療作用。

本研究表明河南省新冠肺炎預(yù)防方(成人方)通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路對(duì)COVID-19的預(yù)防發(fā)揮作用，為臨床應(yīng)用及進(jìn)一步研究提供一定的理論依據(jù)和參考。但尚未對(duì)本研究預(yù)測(cè)的通路進(jìn)行驗(yàn)證，且河南省新冠肺炎預(yù)防方(成人方)的活性成分在體內(nèi)生物效應(yīng)復(fù)雜，需進(jìn)一步驗(yàn)證各成分間是否具有協(xié)同或拮抗作用。