方錦穎,王一沖,神原優(yōu)滋(日本)，李文歌，3

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京100029；2.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部，北京100191；3.中日友好醫(yī)院腎病科，北京100029)

糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常見微血管并發(fā)癥，以高血壓、蛋白尿、腎功能下降，最終導(dǎo)致腎衰竭為主要表現(xiàn)。目前DN是導(dǎo)致終末腎臟病(End-stage renal disease，ESRD)的首要原因[1-2]。中醫(yī)藥在DN治療中起著重要作用[3]。中醫(yī)理論中，DN病機(jī)以氣陰兩虛為本，“瘀”是其重要致病因素，益氣養(yǎng)陰、活血化瘀已成為治療DN的重要原則[4]。腎康注射液由黃芪、丹參、大黃、紅花的提取物組成，具有通腑泄?jié)?、活血化瘀、補(bǔ)氣利濕等功效[5]。近年來，臨床常應(yīng)用腎康注射液延緩DN進(jìn)展，療效較好。現(xiàn)代藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)腎康注射液具有改善脂代謝，糾正淋巴細(xì)胞紊亂，抑制免疫炎癥反應(yīng)，抑制腎小球系膜細(xì)胞增生，減緩腎臟纖維化，延緩腎小球硬化等作用[6-8]。中藥制劑成分復(fù)雜，作用機(jī)制多樣，對(duì)于腎康注射液治療DN的通路缺乏系統(tǒng)性認(rèn)識(shí)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于系統(tǒng)生物學(xué)相關(guān)理論，聯(lián)合數(shù)據(jù)庫，通過“藥物-有效成分-靶點(diǎn)-疾病”的方式，研究藥物治療疾病作用機(jī)制[9-10]。本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，結(jié)合文獻(xiàn)研究、數(shù)據(jù)發(fā)掘、統(tǒng)計(jì)分析等手段，收集腎康注射液有效成分、作用靶點(diǎn)及DN靶點(diǎn)等，構(gòu)建腎康注射液與DN相互作用網(wǎng)絡(luò)，探究腎康注射液治療DN作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 文獻(xiàn)來源與分析平臺(tái) TCMSP數(shù)據(jù)庫、Uniprot數(shù)據(jù)庫、Genecards數(shù)據(jù)庫、Active Perl軟件、String數(shù)據(jù)庫、PDB數(shù)據(jù)庫、Cytoscape 3.6.1軟件、R3.6.2軟件、Discovery studio軟件、Pymol軟件、Autodock軟件。

1.2 研究方法

1.2.1 腎康注射液有效成分的收集及篩選：通過TCMSP數(shù)據(jù)庫，收集丹參、紅花、大黃及黃芪的主要活性成分。根據(jù)Lipinski五規(guī)則及相關(guān)文獻(xiàn)[11]對(duì)成分毒藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行設(shè)置，篩選出在人體內(nèi)生物活性較高的成分，篩選條件為藥物相似性(DL)≥0.18、分配系數(shù)≤5、氫鍵給體≤5、氫鍵受體≤10。

1.2.2 收集腎康注射液相關(guān)靶點(diǎn)：通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選出腎康注射液的所有作用靶點(diǎn)，通過Active Perl軟件篩選后，得到藥物活性成分的對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。進(jìn)一步使用Uniprot數(shù)據(jù)庫對(duì)藥物靶點(diǎn)信息進(jìn)行規(guī)范化處理，查找蛋白質(zhì)名稱，限定物種為人，獲取唯一的Uniprot ID，得到藥物靶點(diǎn)ID。

1.2.3 收集DN相關(guān)靶點(diǎn)：從Genecards數(shù)據(jù)庫獲取與DN相關(guān)的靶點(diǎn)，并導(dǎo)入U(xiǎn)niprot數(shù)據(jù)庫的相應(yīng)Uniprot ID，得到疾病靶點(diǎn)ID。

1.2.4 收集腎康注射液與DN共同靶點(diǎn)：通過R3.6.2軟件，將前期獲得的腎康注射液靶點(diǎn)及DN相關(guān)的靶點(diǎn)取交集，得到腎康注射液與DN共同靶點(diǎn)。

1.2.5 “藥物-有效成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：將藥物-疾病共同靶點(diǎn)及藥物靶點(diǎn)基因ID通過Active Perl軟件，獲得network文件，type文件，藥物有效成分3個(gè)文件。3個(gè)文件通過Cytoscape 3.6.1軟件獲得藥物-有效成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，并對(duì)其進(jìn)行注釋及美化。

1.2.6 蛋白質(zhì)互作(Protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：PPI網(wǎng)絡(luò)是由蛋白通過彼此之間的相互作用，來參與調(diào)節(jié)基因表達(dá)、傳遞生物信號(hào)、物質(zhì)及能量代謝、調(diào)控細(xì)胞周期等生命過程的各個(gè)環(huán)節(jié)[12]。通過String數(shù)據(jù)庫，輸入前期獲得的共同靶點(diǎn)信息，物種選擇Homo sapiens(智人)，選擇置信度得分>0.90以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性，去除獨(dú)立的基因，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。通過R3.6.2軟件得到PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因。

1.2.7 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析：功能富集分析是將基因或者蛋白列表分成多個(gè)部分，即將獲得的基因根據(jù)功能或其他標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類，將具有相似功能的基因放到一起，并將其與生物學(xué)表型關(guān)聯(lián)起來[12]。使用前期獲得的共同靶點(diǎn)，通過R3.6.2軟件、Active Perl軟件對(duì)靶點(diǎn)基因進(jìn)行富集分析，包括GO功能富集分析及KEGG通路富集分析，設(shè)定P<0.05并使用Bonferroni檢驗(yàn)法進(jìn)行校正，并篩選出具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的生物學(xué)過程和信號(hào)通路。

1.2.8 分子對(duì)接：選擇PPI網(wǎng)絡(luò)中Degree值最大的10個(gè)靶點(diǎn)作為受體，與納入研究的腎康注射液活性成分進(jìn)行分子對(duì)接。在PDB數(shù)據(jù)庫下載受體的人源性蛋白結(jié)構(gòu)，逐一導(dǎo)入Discovery studio軟件進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)常規(guī)預(yù)處理。TCMSP數(shù)據(jù)庫下載腎康注射液主要各活性成分的SDF三維結(jié)構(gòu)作為配體，導(dǎo)入Pymol軟件、Autodock軟件進(jìn)行常規(guī)預(yù)處理，并逐一對(duì)主要藥物活性成分和配體進(jìn)行對(duì)接，制作熱力圖。

2 結(jié) 果

2.1 腎康注射液有效成分及靶點(diǎn)的收集及篩選 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索并通過設(shè)置ADME參數(shù)篩選后得到大黃有效成分16個(gè)、丹參有效成分65個(gè)、紅花有效成分22個(gè)、黃芪有效成分20個(gè)，篩選重復(fù)后得到有效成分共120個(gè)。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫、Active Perl軟件獲得上述有效成分的作用靶點(diǎn)，除去重復(fù)靶點(diǎn)后，共得到有效成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)2219個(gè)，同時(shí)在Uniprot數(shù)據(jù)庫中查找主要活性成分作用靶點(diǎn)的相應(yīng)Uniprot ID，去除重復(fù)和非人源靶點(diǎn)，得到1948個(gè)靶點(diǎn)，即藥物靶點(diǎn)ID。

2.2 DN靶點(diǎn)篩選 從Genecards數(shù)據(jù)庫共收集到與DN相關(guān)的靶點(diǎn)4444個(gè)，將靶點(diǎn)名導(dǎo)入U(xiǎn)niprot數(shù)據(jù)庫，獲得4444個(gè)Uniprot ID 。

2.3 腎康注射液與DN共同靶點(diǎn) 通過R3.6.2軟件，將前期獲得的腎康注射液靶點(diǎn)及DN相關(guān)的靶點(diǎn)取交集，得到183個(gè)腎康注射液與DN共同靶點(diǎn)。

2.4 “藥物-有效成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 將腎康注射液與DN共同靶點(diǎn)及藥物靶點(diǎn)基因ID通過Active Perl軟件、Cytoscape 3.6.1軟件獲得藥物-有效成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)。其中橘色節(jié)點(diǎn)表示腎康注射液有效成分有37種；綠色節(jié)點(diǎn)表示DN和腎康注射液交集靶點(diǎn)184個(gè)；紅色節(jié)點(diǎn)代表DN；黃色節(jié)點(diǎn)代表腎康注射液(圖1)。

圖1 “藥物-有效成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過String數(shù)據(jù)庫，輸入前期獲得的疾病-藥物交集靶點(diǎn)，物種選擇智人(Homo sapiens)，設(shè)置置信系數(shù)>0.9，去除獨(dú)立的基因，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，共有基因167個(gè)，連線718條(圖2)。

圖2 腎康注射液有效成分與DN共同靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析 將腎康注射液與DN的183個(gè)共同靶點(diǎn)通過R3.6.2軟件進(jìn)行GO功能富集分析，共得到169條生物過程，主要涉及免疫炎癥反應(yīng)、代謝通路等生物學(xué)過程(圖3)。KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果，共得到174條信號(hào)通路，通過KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步查找信號(hào)通路相關(guān)信息及通路圖，其中與DN相關(guān)的通路59條，主要涉及免疫炎癥反應(yīng)、能量代謝調(diào)節(jié)、自噬等(圖4)。

圖3 腎康注射液與DN共同靶點(diǎn)GO功能富集分析氣泡圖

2.7 分子對(duì)接 選取PPI網(wǎng)絡(luò)中“Degree”值最大10個(gè)靶點(diǎn)，與腎康注射液的6個(gè)主要活性成分進(jìn)行分子對(duì)接，對(duì)接得分經(jīng)過熱力圖分析得出結(jié)果。其中，對(duì)接得分≤-9.0 kcal/mol的成分有3個(gè)，占5.0%，其余對(duì)接得分均在-9.0～-5.0 kcal/mol之間(圖5)。一般認(rèn)為對(duì)接得分≤-5.0 kcal/mol時(shí)，藥物活性成分與靶點(diǎn)具有較好的結(jié)合活性，因此腎康注射液的主要活性成分與重點(diǎn)靶點(diǎn)之間具有較好的結(jié)合能力。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)甲基黃連堿(Worenine)與目標(biāo)靶點(diǎn)對(duì)接得分均≤-7.0 kcal/mol，其中30 %對(duì)接得分≤-9.0 kcal/mol。JUN、絲裂原激活蛋白激酶8(Mitogenactivated protein kinases 8，MAPK8)、APP與所有主要藥物活性成分結(jié)合分?jǐn)?shù)均≤-7.0 kcal/mol。由此推測甲基黃連堿等成分可能是腎康注射液治療DN的有效成分，MAPK8、APP可能是其主要作用靶點(diǎn)。

3 討 論

DN發(fā)病機(jī)制與免疫炎癥、血流動(dòng)力學(xué)改變、氧化應(yīng)激、代謝紊亂、遺傳等因素有關(guān)[13-14]。中醫(yī)認(rèn)為DN病機(jī)以臟腑內(nèi)虛為本，瘀血痰濁為標(biāo)，治療上根據(jù)辨證，采用補(bǔ)虛活血瀉濁、益氣活血、補(bǔ)腎化瘀、化瘀散結(jié)等方法[15]。腎康注射液能夠兼顧DN患者本虛標(biāo)實(shí)的特點(diǎn)，一定程度上減少DN患者的尿蛋白，改善腎功能，延緩疾病進(jìn)一步發(fā)展。腎康注射液中黃芪益氣袪濕，丹參、紅花的提取物具有活血化瘀的功效，大黃通腑泄?jié)?，?duì)于DN氣血運(yùn)行不暢形成濁邪具有良好的治療效果。本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法構(gòu)建腎康注射液治療DN的“藥物-有效成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，對(duì)其涉及的信號(hào)通路及生物學(xué)過程進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)腎康注射液治療DN是通過多途徑發(fā)揮作用。涉及的主要生物學(xué)過程有免疫炎癥反應(yīng)、能量代謝、水鹽代謝調(diào)節(jié)、改善局部微循環(huán)、調(diào)控細(xì)胞周期等。通過分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)，腎康注射液6個(gè)主要活性成分均能與DN的10個(gè)主要靶點(diǎn)結(jié)合，腎康注射液可能通過JUN、MAPK8、APP等靶點(diǎn)，調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)、凋亡等通路，延緩DN進(jìn)展。

DN患者常合并代謝綜合征，高血糖、高脂血癥、高尿酸血癥等代謝疾病又進(jìn)一步加重腎臟損傷。在高血糖狀態(tài)下，人體產(chǎn)生不可逆糖化蛋白質(zhì)即晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)。當(dāng)AGEs不能完全被腎臟近端小管內(nèi)吞、溶酶體降解時(shí)，AGEs大量積累，促進(jìn)炎癥因子釋放，激活炎癥反應(yīng)，促使糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展[14]。血管內(nèi)皮生長因子B(VEGF-B)在DN患者體內(nèi)高水平表達(dá)，腎臟脂肪變性，抑制VEGF-B信號(hào)傳導(dǎo)可降低腎臟的脂毒性，提高足細(xì)胞對(duì)胰島素信號(hào)敏感性，延緩DN進(jìn)展[14，16]。腎康注射液可通過調(diào)節(jié)VEGF-B等信號(hào)傳導(dǎo)，降低腎臟的脂毒性。血壓控制不佳是導(dǎo)致DN進(jìn)展的重要因素，腎康注射液通過作用于RAAS系統(tǒng)起到一定的調(diào)節(jié)血壓作用[16]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究表明，腎康注射液中鼠李檸檬素、野黃芩素等有效成分可以作用于表皮生長因子受體、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1、血管內(nèi)皮生長因子A等靶點(diǎn)基因，通過血管內(nèi)皮生長因子信號(hào)通路、脂肪細(xì)胞素信號(hào)通路、胰島素信號(hào)通路等16條信號(hào)通路，從改善胰島功能、提高機(jī)體對(duì)胰島素敏感性、調(diào)節(jié)腎臟局部血壓等多方面改善DN患者代謝紊亂，減少尿蛋白，延緩腎臟衰竭。

炎癥反應(yīng)在DN發(fā)病過程中處于重要地位。白介素-18、白介素-1β、Toll樣受體-2等炎癥因子造成全身和局部低度炎癥與DN的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，且在調(diào)節(jié)免疫紊亂中發(fā)揮重要作用。血管內(nèi)皮蛋白酪氨酸磷酸酶與糖尿病并發(fā)癥的發(fā)展有關(guān)，抑制血管內(nèi)皮蛋白酪氨酸磷酸酶表達(dá)，減少促炎和纖維化基因靶點(diǎn)表達(dá)，延緩DN進(jìn)展[17-18]。腎康注射液中決明內(nèi)酯、6-羥基山柰酚、澤蘭黃醇、熊竹素等作用于一氧化氮合酶-3、白介素-6、核受體共激活劑-2、MAPK-8等靶基因，通過T淋巴細(xì)胞、腫瘤壞死因子、Toll樣受體信號(hào)通路等，調(diào)節(jié)人體免疫反應(yīng)，減少炎癥因子產(chǎn)生。

自噬在多種急慢性腎臟疾病中起著重要作用，可與細(xì)胞凋亡、能量代謝、免疫炎癥反應(yīng)等過程相互影響。有研究表明，在DN模型小鼠出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞特異性自噬缺陷后可加重蛋白尿，導(dǎo)致疾病惡化[19]。同時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞特異性自噬缺陷的小鼠對(duì)高糖高脂飲食耐受性下降，易出現(xiàn)腎功能受損。自噬通過降解AGEs，提高溶酶體活性，減輕炎癥反應(yīng)，保護(hù)足細(xì)胞。腎康注射液通過酪氨酸激酶抑制劑抵抗相關(guān)信號(hào)通路、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶信號(hào)通路等減輕腎臟損傷。