余秀蓉，劉伊楚，蘭風(fēng)華，曾 健，林 娟，王志紅

0 引 言

Leber先天性黑蒙癥(Leber congenital amaurosis, LCA)是1869年由德國(guó)眼科醫(yī)師Theodor Leber首先報(bào)道[1]。該病是最嚴(yán)重的遺傳性視網(wǎng)膜疾病，可導(dǎo)致嬰兒在出生后1個(gè)月內(nèi)完全喪失視力[2]?；純撼１憩F(xiàn)為眼球震顫、固視障礙、畏光、按壓眼球、黑蒙性瞳孔等眼部癥狀。視網(wǎng)膜電圖(electroretinogram, ERG)表現(xiàn)為a、b波平坦，甚至消失，具有診斷價(jià)值。LCA具有遺傳和臨床異質(zhì)性，多數(shù)為常染色體隱性遺傳，也有少數(shù)報(bào)道為常染色體顯性遺傳，基因突變譜在不同的種群間存在差異[3]。LCA常見的致病基因主要有CEP290、GUCY2D、CRB1、RPE65、IMPDH1、AIPL1和RPGRIP1等，約50%～60%的LCA患者可以通過(guò)基因檢測(cè)明確病因[4]。本研究采用二代測(cè)序方法對(duì)一個(gè)LCA家系的先證者進(jìn)行基因診斷，并通過(guò)PCR擴(kuò)增及直接測(cè)序方法對(duì)該家系的高危胎兒進(jìn)行產(chǎn)前分子診斷，并回顧了相關(guān)文獻(xiàn)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象先證者，女，2014年12月生，1歲，因“生后不能視物”就診于我院眼科，眼科檢查：角膜透明，瞳孔直徑2.5 mm，對(duì)光反應(yīng)存在，眼球震顫，眼球內(nèi)陷，指眼征陽(yáng)性。標(biāo)準(zhǔn)全視野ERG：雙眼未引出正常波形，雙眼各振幅熄滅。眼底照相提示視網(wǎng)膜色素變性，顯示周邊視網(wǎng)膜色素沉著，見圖1?；純耗I臟彩超、生化全套、動(dòng)脈血?dú)夥治?、尿常?guī)、尿微量蛋白檢查均正常，患兒聽力正常，智力、運(yùn)動(dòng)發(fā)育正常。根據(jù)患者病史及檢查結(jié)果，臨床擬診LCA。先證者父母既往身體健康，無(wú)LCA家族史。先證者母親再次妊娠16周行遺傳咨詢，并要求對(duì)先證者行LCA相關(guān)的基因診斷以及對(duì)所懷胎兒進(jìn)行產(chǎn)前診斷。家系圖見圖2。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：2016019)，先證者父母均簽署知情同意書。

a：右眼；b：左眼圖示周邊視網(wǎng)膜色素沉著圖1 Leber先天性黑蒙癥患者眼底照相

Ⅰ-1：先證者母親；Ⅰ-2先證者父親；Ⅱ-1：先證者；Ⅱ-2：胎兒圖2 Leber先天性黑蒙癥家系圖

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取采集先證者及其父母外周血各2 mL，先證者母親妊娠20周，由產(chǎn)科醫(yī)師穿刺抽取其羊水約10 mL。使用DNA提取試劑盒(Qiagen公司)分別提取該家系的外周血和羊水細(xì)胞的基因組DNA，并將DNA樣本置-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 二代測(cè)序先證者外周血送深圳華大臨床檢驗(yàn)中心進(jìn)行LCA相關(guān)的基因Panel(AIPL1、CABP4、CEP290、CRB1、CRX、GUCY2D、IQCB1、LCA5、LRAT、RD3、RDH12、RPE65、RPGRIP1、SPATA7、TULP1、IMPDH1、OTX2、KCNJ13和NMNAT1)檢測(cè)。主要包括DNA文庫(kù)制備，芯片捕獲和富集，測(cè)序儀完成基因檢測(cè)，基因突變分析并結(jié)合致病變異和正常人基因組等數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出LCA相關(guān)的變異。

1.2.3 Sanger測(cè)序針對(duì)先證者在IQCB1第11外顯子發(fā)現(xiàn)的突變，按照參考文獻(xiàn)[5]，由鉑尚生物技術(shù)(上海)合成覆蓋突變位點(diǎn)的引物，上游序列：5′-AGATTGCACAACAGCAGCAG-3′，下游序列：5′-TCATCACGTAGCTAGAAAAGTTGG-3′。擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為389 bp，包含IQCB1基因c.1090C>T突變位點(diǎn)。對(duì)先證者及其父母和高危胎兒的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，配置PCR反應(yīng)體系，設(shè)置循環(huán)參數(shù)：95 ℃/5 min；95 ℃/30 s，56 ℃/30 s，72 ℃/30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃/5 min。PCR產(chǎn)物送鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司進(jìn)行Sanger測(cè)序。

1.2.4 母體基因組污染排除取胎兒羊水細(xì)胞和父母外周血的基因組DNA，按照參考文獻(xiàn)[6]用Identifiler試劑盒(ABI公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用3100 Avant遺傳分析儀(ABI公司)檢測(cè)15個(gè)短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat, STR)，再用GeneMapper Software v3.7軟件鑒定STR位點(diǎn)。根據(jù)母親獨(dú)有的STR位點(diǎn)是否在羊水細(xì)胞樣本中出現(xiàn)，判斷是否存在母體基因組污染[7]。

2 結(jié) 果

2.1 二代測(cè)序LCA相關(guān)基因Panel測(cè)序發(fā)現(xiàn)先證者IQCB1基因c.1090C>T(p.R364X)純合突變。該突變?yōu)橐阎虏⌒酝蛔儭?/p>

2.2 Sanger測(cè)序測(cè)序結(jié)果證實(shí)先證者存在IQCB1基因c.1090C>T純合突變，先證者父母和高危胎兒的IQCB1外顯子11基因測(cè)序顯示均為c.1090C>T雜合突變，見圖3。

a:先證者(Ⅱ-1)檢出IQCB1基因c.1090C>T純合突變；b:先證者父親(Ⅰ-2)檢出IQCB1基因c.1090C>T雜合突變；c:先證者母親(Ⅰ-1)檢出IQCB1基因c.1090C>T雜合突變；d:胎兒(Ⅱ-2)檢出IQCB1基因c.1090C>T雜合突變圖3 Leber先天性黑蒙癥家系IQCB1基因外顯子11部分序列圖

2.3 母體基因組DNA污染的排除胎兒及其父母基因組DNA的STR位點(diǎn)分析結(jié)果顯示：母親基因組DNA獨(dú)有的STR位點(diǎn)均未在胎兒羊水細(xì)胞中出現(xiàn)，羊水細(xì)胞基因組DNA來(lái)自獨(dú)立個(gè)體，因此，可以排除母體基因組DNA污染。

3 討 論

IQCB1(IQ motif containing B1)基因,也稱NPHP5(nephrocystin-5)基因，是眼-腎綜合征(Senior-Loken syndrome, SLSN)最常見的致病基因,該病呈常染色體隱性遺傳[8]。近年來(lái)IQCB1基因突變報(bào)道主要見于LCA和SLSN患者，截至2019年4月，人類基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)(The Human Gene Mutation Database)已收錄44種突變類型，包括19種無(wú)義與錯(cuò)義突變、6種剪接突變、12種小片段缺失突變和7種小片段插入突變。通過(guò)二代測(cè)序，本研究發(fā)現(xiàn)先證者存在IQCB1基因c.1090C>T(p.R364X)致病性純合突變。該突變由美國(guó)Khanna等[9]于2009年首次報(bào)道，Tong等[5]和Yu等[10]在3個(gè)中國(guó)SLSN患者檢測(cè)出該純合突變。通過(guò)一代測(cè)序驗(yàn)證，先證者的父母親都攜帶有IQCB1基因c.1090C>T雜合突變，他們沒(méi)有眼部及腎臟的病變，符合常染色體隱性遺傳的特征。

IQCB1基因位于3q13.3，有15個(gè)外顯子，編碼由598個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白，其中包含一個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)域(340-373氨基酸殘基)和兩個(gè)鈣調(diào)蛋白IQ結(jié)合域(294-323和387-416氨基酸殘基)。該蛋白主要表達(dá)在連接感光細(xì)胞的纖毛和腎小管上皮細(xì)胞的初級(jí)纖毛，負(fù)責(zé)上皮細(xì)胞的完整性。有研究表明該蛋白合成障礙會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜變性和腎囊腫形成[8]。c.1090C>T(p.R364X)為無(wú)義突變，該突變提前引入終止密碼子，使得mRNA轉(zhuǎn)錄提前終止，產(chǎn)生由363個(gè)氨基酸組成的異常截短蛋白。由于該截短蛋白喪失了原有蛋白完整的螺旋結(jié)構(gòu)域和鈣調(diào)蛋白IQ結(jié)合域，導(dǎo)致蛋白功能缺陷，從而致病。

IQCB1基因突變所致的SLSN典型臨床表現(xiàn)是視網(wǎng)膜和腎臟的病變，而無(wú)其他器官損害。該型患者100%會(huì)出現(xiàn)視網(wǎng)膜病變，重者早期出現(xiàn)LCA，輕者表現(xiàn)為輕度視力損害和視網(wǎng)膜色素變性，部分患者可僅表現(xiàn)為早發(fā)視網(wǎng)膜色素變性或LCA而無(wú)腎功能衰竭[11-12]。2016年，美國(guó)猶他大學(xué)的Ronquillo等[13]對(duì)IQCB1基因敲除小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)IQCB1基因編碼的蛋白對(duì)小鼠光感受器外節(jié)層形成至關(guān)重要，但對(duì)小鼠腎臟和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞纖毛的形成不是必須的。有研究表明，IQCB1基因突變患者發(fā)生腎功能衰竭的年齡差異較大，早者3歲發(fā)病，遲者可延遲到50歲，因此，僅表現(xiàn)為L(zhǎng)CA的患者發(fā)生腎功能衰竭的風(fēng)險(xiǎn)高，若未能早期診斷，有可能突然死于水電解質(zhì)失衡[14]。目前IQCB1基因已成為臨床表型為L(zhǎng)CA和(或)腎單位腎癆(nephronophthisis, NPHP)患者的共同篩查基因，可明顯提高SLSN的臨床診斷率。

本研究中先證者目前僅表現(xiàn)出LCA而無(wú)腎臟病變，需要定期進(jìn)行尿常規(guī)、尿微量蛋白、腎功能等監(jiān)測(cè)以達(dá)到早發(fā)現(xiàn)早治療、預(yù)防腎衰竭的目的。目前，雖然有報(bào)道基因治療方法應(yīng)用該病的臨床治療[15]，但是產(chǎn)前診斷/胚胎植入前產(chǎn)前診斷仍然是預(yù)防此類患兒出生的主要途徑。本研究中胎兒檢測(cè)結(jié)果為IQCB1基因c.1090C>T雜合突變，根據(jù)遺傳規(guī)律，該胎兒出生后患SLSN的風(fēng)險(xiǎn)低。先證者母親于妊娠36周2天順產(chǎn)1健康女孩，LCA /NPHP相關(guān)的眼部及腎臟檢查均未發(fā)現(xiàn)異常。