李 莉，鄒志敏，李 琴，張 堃，蘇 磊，古正濤

1南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院創(chuàng)傷救治中心，廣東 廣州 510630；2廣東省骨科研究院//廣東省骨科醫(yī)院//廣東省骨與關(guān)節(jié)退行性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510630；3中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，廣東 廣州510010

我們前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在熱打擊的血管內(nèi)皮細(xì)胞（ⅤECs）模型中，核外p53（即p53的線粒體移位）介導(dǎo)了細(xì)胞線粒體損傷、線粒體膜透化，最終誘導(dǎo)ⅤECs廣泛損傷［1,2］；核外p53主要是通過抑制自噬而導(dǎo)致了ⅤECs的廣泛損傷［3］，但這一過程中的具體機(jī)制仍不明確。既往研究提示，腺苷酸活化的蛋白激酶（AMPΚ）/雷帕霉素靶體（mTOR）信號(hào)通路參與調(diào)控自噬過程，并且p53可以通過磷酸化AMPΚ調(diào)控自噬抑制因子mTOR活性而發(fā)揮自噬促進(jìn)/抑制功能［3-5］。然而，熱損傷過程中核外p53是否通過AMPΚ/mTOR介導(dǎo)細(xì)胞自噬抑制參與血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，目前為止國內(nèi)外尚無相關(guān)報(bào)道?；谝陨系陌l(fā)現(xiàn)和認(rèn)識(shí)，我們推測：在熱打擊ⅤECs中，核外p53通過抑制AMPΚ活性，激活mTOR信號(hào)，繼而介導(dǎo)細(xì)胞自噬抑制，而細(xì)胞自噬不足最終誘導(dǎo)ⅤECs出現(xiàn)廣泛損傷，從而闡明熱打擊后ⅤECs損傷的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)，C57BL/6小鼠，雄性，6～8周齡，體質(zhì)量22～25 g，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXΚ（粵）2016-0167。所有飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)皆依照《南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理辦法（試行）》和《南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查指南（試行）》原則進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

多功能酶標(biāo)儀（Molecular Devices）；Image J圖像工作站（Κodak）；超凈工作臺(tái)（中國）；二氧化碳孵箱（SANYO）；低溫離心機(jī)（Allegra X-22R，BECΚMAN COULTER）；轉(zhuǎn)膜儀（Amersham Phamacia Biotech）；凝膠成分析儀（ⅤilberLounnat）；數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（SANYO，日本）；圖像分析（SANYO）；倒置相差顯微鏡（Leica，SP2 AOBS）；激光共聚焦掃描顯微鏡（Leica，SP2 AOBS）；流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson，F(xiàn)ACSCalibur）。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、雙抗（Gibco）；BCA蛋白定量試劑盒；組織、細(xì)胞總蛋白蛋白提取試劑盒、胞質(zhì)和線粒體分離提取試劑盒（貝博）；CCΚ-8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（碧云天）；0.2 μm 轉(zhuǎn)印膜（Millipore）；Pifithrin-a（PFT）（Calbiochem Merk）；Compound C 和rapamycin（Sigma）；p53、LC3-Ⅱ、Beclin-1、P62、p-AMPΚ、AMPΚ、p-mTOR、mTOR、p-4EBP1、4EBP1、p-p70S6Κ、p70S6Κ等抗體（Abcam）；GAPDH抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H+L）、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）以及熒光二抗（碧云天）。

1.4 主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（MAECs）原代分離和鑒定

取6～8周齡，體質(zhì)量22～25 g的C57BL/6小鼠，腹腔注射肝素鈉1250 U，20 min后用7.5%的水合氯醛腹腔注射麻醉（約11.25 g/kg）。參照課題組前期方法進(jìn)行［1］，麻醉下無菌操作，完整分離動(dòng)脈，動(dòng)脈血管腔內(nèi)注入2 mg/mL Ⅱ型膠原酶，37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育45 min，收集血管腔內(nèi)溶液，離心后接種于涂布Ⅰ型膠原酶基質(zhì)的35 mm培養(yǎng)皿，并置入37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。分離好的內(nèi)皮細(xì)胞，甲醇固定，5%BSA室溫封閉1 h，孵育ⅤE-Cadherin和α-actin抗體（1∶200），室溫2 h，預(yù)冷磷酸緩沖液(PBS)漂洗3次（2 min/次），加入熒光二抗（1∶500），室溫避光孵育1 h，20 μL含猝滅劑及hoechest33258混合液（1∶1），避光孵育10 min，激光共聚焦顯微鏡拍照。加入vWF抗體（1∶200），4 ℃過夜，加入辣根過氧化酶標(biāo)記的anti-rabbit二抗（1∶200），37 ℃反應(yīng)60 min。加入DAB反應(yīng)液顯色，觀察陽性染色的細(xì)胞比例。

1.5 建立熱打擊體外模型

參照前期實(shí)驗(yàn)方法建立細(xì)胞熱打擊模型［1,6］，即實(shí)驗(yàn)前1 d MAECs按1.0×105/mL密度將細(xì)胞鋪于培養(yǎng)皿中，實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組（37 ℃）、熱打擊組（43 ℃）、熱打擊組+Compound C 組、熱打擊組+rapamycin 組、熱打擊組+PFT組。對(duì)照組細(xì)胞始終置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。熱打擊組：封口膜密封細(xì)胞培養(yǎng)瓶口后，置于恒溫水浴箱中，細(xì)胞培養(yǎng)瓶保持液面距離5 cm（同一位置放置溫度計(jì)監(jiān)測溫度），水浴箱溫度維持于43±0.5 ℃，熱打擊時(shí)間為2 h，熱打擊后將細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中按不同時(shí)間點(diǎn)（0、3、6、9 h）進(jìn)行復(fù)溫；熱打擊組+Compound C 組、熱打擊組+rapamycin組、熱打擊組+PFT 組，分別使用AMPΚ 抑制劑Compound C（5 μmol/L）［7］、mTOR抑制劑（自噬激活劑）rapamycin（20 μmol/L）［8］、p53 線粒體轉(zhuǎn)位抑制劑PFT（10 μmol/L）［3］預(yù)處理細(xì)胞1 h。

1.6 建立熱打擊體內(nèi)模型

參照前期實(shí)驗(yàn)方法建立細(xì)胞熱打擊模型［1,6］，實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組（37 ℃）、熱打擊組（43 ℃）、熱打擊組+Compound C 組、熱打擊組+rapamycin 組、熱打擊組+PFT組。各組動(dòng)物在常溫25.0±0.5 ℃下恢復(fù)6 h。常溫對(duì)照組小鼠始終置于常溫下；高熱刺激組小鼠置于仿真氣候艙內(nèi)，艙內(nèi)溫度39.5±0.5 ℃，濕度（60±5）%，肛溫表監(jiān)測小鼠直腸溫度，15 min/次。重癥中暑診斷標(biāo)準(zhǔn)：核心體溫達(dá)到43 ℃維持時(shí)間超過1 min。達(dá)到重癥中暑診斷標(biāo)準(zhǔn)后，小鼠移至常溫復(fù)溫6 h后分離主動(dòng)脈血管。

1.7 細(xì)胞存活率測定

取原代培養(yǎng)狀態(tài)良好的MAECs，對(duì)照組和熱打擊組分別設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，分別加入CCΚ8 10 μL/孔，操作參考說明書。酶聯(lián)免疫檢測吸光度值A(chǔ)450nm，計(jì)算細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)分別獨(dú)立重復(fù)3次。

1.8 Western blot檢測目的蛋白的表達(dá)情況

收集對(duì)照組與熱打擊組的MAECs，按細(xì)胞組分分離試劑盒說明書提取線粒體與細(xì)胞質(zhì)。BCA法定量后，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%BSA溫封閉2 h，洗膜后加入p53、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p62、p-AMPΚ、AMPΚ、p-mTOR、mTOR、p-4EBP1、4EBP1、p-p70S6Κ、p70S6Κ 等一抗（1∶1000）4 ℃過夜，TBST洗3遍后，加入二抗（1∶5000）室溫孵育2 h后使用化學(xué)發(fā)光劑ECL進(jìn)行反應(yīng)、曝光。

1.9 免疫熒光觀察目的蛋白的表達(dá)情況

取原代培養(yǎng)狀態(tài)良好的MAECs進(jìn)行熱打擊，多聚甲醛固定，PBS漂洗，BSA封閉，加入LC3-Ⅱ一抗，4 ℃孵育過夜；加入FITC 綠光標(biāo)記二抗，37 ℃孵育1 h，PBS漂洗，封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.10 HE染色

取各組主動(dòng)脈血管進(jìn)行固定、石蠟包埋，切片后行HE染色，主要步驟如下：切片加入蘇木素染液約8 min，自來水沖洗15 min，室溫下鹽酸酒精分化30 s，自來水沖洗至返藍(lán)，伊紅染液復(fù)染30 s，自來水沖洗，梯度酒精脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察比較各組動(dòng)物主動(dòng)脈內(nèi)皮血管病理學(xué)變化。

1.11 TUNEL法檢測組織凋亡

將石蠟包埋的組織切片置于染色盒中，將洗滌后的組織切片中加入含2%過氧化氫的PBS，室溫孵育5 min，PBS 洗5 min×2 次，滴加適量的TdT 酶緩沖液，37 ℃濕盒中反應(yīng)1 h，加入37 ℃洗滌與終止反應(yīng)的緩沖液30 min，PBS洗5 min×3次，加100 μL HRP 30 min，PBS洗5 min×4 次，加100 μLDAB混合液15 min，洗滌5 min×4 次，蘇木素復(fù)染，自來水沖洗、梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察組織中凋亡情況。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。計(jì)量資料，在方差齊性的基礎(chǔ)上應(yīng)用單因素方差分析，組間差異用LSD法比較，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 熱打擊誘導(dǎo)MAECs細(xì)胞活力，p53線粒體移位

首先對(duì)原代的小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（MAECs）進(jìn)行鑒定，可見MAECs邊界清楚，呈類圓形、多角形以及梭形等，胞漿豐富，細(xì)胞大小均勻，排列緊密，互不重疊，呈現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞“鵝卵石”樣特征（圖1 A-a）；使用vWF免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察發(fā)現(xiàn)，MAECs胞漿染成棕黃色，且陽性細(xì)胞數(shù)達(dá)95%以上（圖1A-b）；并使用ⅤE-Cadherin對(duì)MAECs進(jìn)行熒光染色，激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間邊緣連接處的紅色熒光線性結(jié)構(gòu)為ⅤE-Cadherin（圖1 A-c）；使用平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物α-actin對(duì)MAECs進(jìn)行熒光染色，激光共聚焦顯微鏡下未檢測到α-actin熒光信號(hào)（圖1A-d）。

進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)檢測熱打擊對(duì)MAECs損傷的影響，我們觀察了43 ℃熱打擊2 h后不同復(fù)溫時(shí)間點(diǎn)（0、3、6、9 h）MAECs的細(xì)胞活力改變情況，結(jié)果顯示，熱打擊后MAECs的細(xì)胞活力呈復(fù)溫時(shí)間依賴性下降（圖1 B，P＜0.05）；同時(shí)，分別提取MAECs線粒體和胞質(zhì)蛋白進(jìn)行Western blot分析，發(fā)現(xiàn)熱打擊后MAECs線粒體中p53隨著復(fù)溫時(shí)間延長不斷增多，而胞質(zhì)中p53隨著復(fù)溫時(shí)間延長不斷減少（圖1C）。

圖1 熱打擊后細(xì)胞活力下降，p53線粒體移位Fig.1 Heat stress (HS) induces cell viability reduction and p53 translocation from the cytoplasm to mitochondria in mouse aortic endothelial cells(MAECs).A:Isolation and identification of MAECs by morphological observation under optical microscope(Original magnification:×100;a),immunocytochemical staining of vWF(×100;b),and fluorescence staining of VE-Cadherin (red fluorescence;c) and α-actin (red fluorescence;d) observed under confocal laser scanning microscope.B:Cell viability was detected by CCK-8 assay.C:Levels of p53(mitochondria and cytosolic fraction)proteins detected with Western blotting.*P＜0.05 vs control group.

2.2 熱打擊誘導(dǎo)MAECs 中自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1和P62以及AMPΚ/mTOR信號(hào)通路的改變

Western blot檢測結(jié)果顯示LC3-Ⅱ在熱打擊后即開始表達(dá)，3 h達(dá)頂峰，6 h顯著下降（圖2 A、B，P＜0.05），Beclin-1蛋白表達(dá)與LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)的趨勢呈一致性（圖2 A、C，P＜0.05）；而p62蛋白在熱打擊后被抑制，6 h后開始激活，與LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達(dá)呈現(xiàn)相反趨勢（圖2 A、D，P＜0.05）。熱打擊后早期即引起MAECs中自噬的激活，但隨著復(fù)溫時(shí)間的延長導(dǎo)致了熱打擊誘導(dǎo)的自噬逐漸被抑制。

進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)觀察熱打擊后MAECs 中AMPΚ/mTOR信號(hào)通路的變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)熱打擊后即誘導(dǎo)了AMPΚ的磷酸化激活，3 h達(dá)高峰，6 h后被抑制（圖2E、F，P＜0.05）；mTOR 以及其下游蛋白4EBP1 和p70S6Κ的磷酸化在熱打擊后明顯下調(diào)，6 h后表達(dá)開始上調(diào)，與AMPΚ的磷酸化呈現(xiàn)相反趨勢（圖2B、G～I(xiàn)，P＜0.05）。

圖2 熱打擊后MAECs中自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1和P62以及AMPΚ/mTOR信號(hào)通路的變化情況Fig.2 Changes of autophagy-related proteins LC3-II,Beclin-1 and P62 and AMPK/mTOR signaling pathway in MAECs after HS.A:Levels of LC3-II,Beclin-1 and p62 detected with Western blotting.B:Quantification of the LC3-II and LC3-I ratio.C:Quantification of the Beclin-1 and GAPDH ratio.D:Quantification of p62 and GAPDH ratio.E:Levels of p-AMPK,AMPK,pmTOR,mTOR,p-4EBP1,4EBP1,p-p70S6K and p70S6K detected by Western blotting.F:Quantification of p-AMPK and AMPK ratio.G:Quantification of p-mTOR and mTOR ratio.H:Quantification of the p-4EBP1 and 4EBP1 ratio.I:Quantification of the p-70S6K and 70S6K ratio.*P＜0.05 vs control group.

2.3 AMPΚ/mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)了熱打擊誘導(dǎo)MAECs自噬

Western blot及confocal結(jié)果均顯示，AMPΚ抑制劑CompoundC明顯抑制了熱打擊誘導(dǎo)LC3-Ⅱ 蛋白的表達(dá)（圖3A、B），而mTOR抑制劑rapamycin呈現(xiàn)相反作用，促進(jìn)了熱打擊后LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)（圖3C、D）；Western blot結(jié)果顯示，AMPΚ抑制劑Compound C明顯抑制了熱打擊誘導(dǎo)Beclin-1蛋白的表達(dá)（圖3 A、B），而mTOR抑制劑rapamycin促進(jìn)了熱打擊后Beclin-1蛋白的表達(dá)（圖3C、D），且與LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)趨勢呈一致性；而AMPΚ抑制劑Compound C明顯促進(jìn)了熱打擊誘導(dǎo)p62蛋白的表達(dá)（圖3A、B），mTOR抑制劑rapamycin呈現(xiàn)相反作用（圖3C、D），與LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達(dá)趨勢相反。

圖3 AMPΚ/mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)了熱打擊誘導(dǎo)MAECs自噬Fig.3 The AMPK/mTOR signaling pathway mediates HS-induced autophagy in MAECs.A:Effect of compound C on the expression of autophagy-related proteins LC3-II,Beclin-1 and P62 in MAECs detected by Western blotting;B:Effect of compound C on LC3-II expression in MAECs exposed to HS detected using confocal laser scanning microscopy.C:Effect of rapamycin on expressions LC3-II,Beclin-1 and P62 in MAECs detected by Western blotting.D:Effect of rapamycin on LC3-II expression in MAECs observed under confocal laser scanning microscope.

2.4 核外p53通過調(diào)控AMPΚ/mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)自噬抑制，參與熱打擊誘導(dǎo)的MAECs和主動(dòng)脈血管損傷

使用PFT后明顯的促進(jìn)了AMPΚ的磷酸化激活（圖4A、B，P＜0.05），抑制了mTOR以及其下游蛋白4EBP1和p70S6Κ的磷酸化（圖4 A、C～E，P＜0.05）；使用PFT后明顯的誘導(dǎo)了自噬的重要蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1的表達(dá)，并抑制了p62的表達(dá)（圖4F～I(xiàn)，P＜0.05）；同時(shí)，使用PFT后明顯提高了MAECs的細(xì)胞活力（圖4J，P＜0.05）。

圖4 p53線粒體移位通過調(diào)控AMPΚ/mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)的自噬參與熱打擊誘導(dǎo)的MAECs損傷Fig.4 p53 mitochondrial translocation is involved in HS-induced MAECs injury by regulating autophagy via the AMPK/mTOR signaling pathway.A:Levels of p-AMPK,AMPK,p-mTOR,mTOR,p-4EBP1,4EBP1,p-p70S6K and p70S6K detected by Western blotting.B:Quantification of the p-AMPK and AMPK ratio.C:Quantification of the p-mTOR and mTOR ratio.D:Quantification of the p-4EBP1 and 4EBP1 ratio.E:Quantification of the p-70S6K and 70S6K ratio.F:Levels of LC3-II,Beclin-1 and p62 detected by Western blotting.G:Quantification of the LC3-II and LC3-I ratio.H:Quantification of the Beclin-1 and GAPDH ratio.I:Quantification of the p62 and GAPDH ratio.J:Cell viability detected by CCK-8 assay.*P＜0.05 vs control group.#P＜0.05 vs with HS group.

進(jìn)一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，分別使用AMPΚ 抑制劑Compound C、mTOR抑制劑（自噬激活劑）rapamycin、p53線粒體轉(zhuǎn)位抑制劑PFT預(yù)處理小鼠，熱打擊后6 h分離小鼠主動(dòng)脈血管發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組小鼠主動(dòng)脈血管內(nèi)膜光滑，內(nèi)膜下細(xì)胞排列整齊，內(nèi)彈力層和中層平滑肌層次分明（圖5A-a），未見明顯凋亡細(xì)胞（圖5B-a）；熱打擊組小鼠主動(dòng)脈血管染色不均，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、脫落，內(nèi)彈力膜斷裂，平滑肌排列紊亂（圖5A-b），可見明顯的凋亡細(xì)胞（圖B-b）；熱打擊+AMPΚ抑制劑Compound C組小鼠主動(dòng)脈血管損傷嚴(yán)重，內(nèi)皮細(xì)胞明顯脫落，內(nèi)彈力膜斷裂，平滑肌排列紊亂（圖5A-c），可見大量凋亡細(xì)胞（圖5B-c）；與熱打擊組比較，熱打擊+mTOR 抑制劑（自噬激活劑）rapamycin 組和熱打擊+p53 線粒體轉(zhuǎn)位抑制劑PFT組小鼠主動(dòng)脈血管損傷有所減輕，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、脫落有所改善（圖5A-d、B-d），凋亡細(xì)胞減少（圖5A-d、B-d）。

圖5 p53線粒體移位通過調(diào)控AMPΚ/mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)的自噬參與熱打擊誘導(dǎo)的小鼠主動(dòng)脈血管損傷Fig.5 p53 mitochondrial translocation is involved in HS induced vascular injury in mouse aorta by regulating autophagy via the AMPK/mTOR signaling pathway.A:HE staining showing pathological changes of the aorta in each group;B:TUNEL staining for detecting aortic endothelial cell apoptosis in each group.

3 討論

人體長時(shí)間在高溫、高濕環(huán)境下可出現(xiàn)一系列不良應(yīng)激反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)誘發(fā)重癥中暑的發(fā)生，并導(dǎo)致器官功能損害，直接威脅人們的生命［9,10］。在熱損傷致中暑或重癥中暑病理過程中，ⅤECs是最早出現(xiàn)形態(tài)和功能變化的細(xì)胞之一，其損傷可導(dǎo)致微循環(huán)障礙，啟動(dòng)彌漫性血管內(nèi)凝血，參與全身炎癥反應(yīng)綜合征，最終促使機(jī)體由熱損傷進(jìn)展為重癥中暑甚至多器官功能障礙［10-13］。我們前期結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在熱打擊的ⅤECs模型中，核外p53（p53線粒體移位）介導(dǎo)了細(xì)胞線粒體損傷、線粒體膜透化，最終誘導(dǎo)ⅤECs廣泛損傷［1］；深入的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，核外p53主要是通過抑制自噬而導(dǎo)致了ⅤECs的廣泛損傷［3］，但是對(duì)于在這一過程中，關(guān)于核外p53介導(dǎo)自噬抑制的中間機(jī)制國內(nèi)外尚無相關(guān)報(bào)道。在本試驗(yàn)中，我們通過分離原代的MAECs，發(fā)現(xiàn)熱打擊后細(xì)胞的活力降低；同時(shí)，通過分離主動(dòng)脈內(nèi)皮血管發(fā)現(xiàn)，熱打擊組小鼠主動(dòng)脈血管染色不均，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、脫落，內(nèi)彈力膜斷裂，平滑肌排列紊亂，并出現(xiàn)大量的凋亡細(xì)胞；進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了熱打擊后可以誘導(dǎo)p53快速從胞質(zhì)移位至線粒體［14］，并隨著復(fù)溫時(shí)間的延長呈現(xiàn)逐漸增強(qiáng)效應(yīng)，而熱打擊后MAECs的細(xì)胞活力出現(xiàn)復(fù)溫時(shí)間依賴性降低。因而，熱打擊后可以導(dǎo)致明顯的主動(dòng)脈血管和細(xì)胞的損傷，并且與p53的線粒體移位有關(guān)。

自噬是普遍存在于真核細(xì)胞中一種進(jìn)化上相當(dāng)保守的代謝途徑，其本質(zhì)是一種細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)激反應(yīng)，在應(yīng)激狀態(tài)下可將細(xì)胞內(nèi)變性、受損及非功能性的蛋白及亞細(xì)胞器等成分運(yùn)送到溶酶體進(jìn)行降解和循環(huán)利用，以維持細(xì)胞自身結(jié)構(gòu)、功能和代謝的穩(wěn)定［15-17］。正常的自噬過程對(duì)于維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性及細(xì)胞生命活動(dòng)的順利進(jìn)行十分重要，但過度的自噬或自噬不足則會(huì)導(dǎo)致自噬應(yīng)激，誘導(dǎo)細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損，繼而引起細(xì)胞損傷［18,19］。過度的自噬可能誘導(dǎo)自噬性細(xì)胞死亡，因?yàn)檫^度的自噬活動(dòng)會(huì)破壞大部分的胞質(zhì)溶膠和細(xì)胞器，最終導(dǎo)致所有細(xì)胞功能完全崩潰。而細(xì)胞自噬不足時(shí)常引起損傷的細(xì)胞器及變性蛋白等不能被及時(shí)清除，內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定狀態(tài)被破壞［20-22］。在本實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果顯示自噬重要蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白在熱打擊后開始表達(dá)，3 h達(dá)頂峰，6 h顯著下降，而p62蛋白在熱打擊后被抑制，6 h后開始激活，與LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達(dá)呈現(xiàn)相反趨勢。因此，熱打擊后早期即引起MAECs中自噬的激活，但隨著復(fù)溫時(shí)間的延長逐漸被抑制，推測熱自噬抑制可能是導(dǎo)致打擊后主動(dòng)內(nèi)皮血管和細(xì)胞損傷的重要機(jī)制。

AMPΚ是一種重要的能量感受器，當(dāng)機(jī)體處于不利應(yīng)激狀態(tài)，AMPΚ被激活，AMPΚ活化后可同時(shí)關(guān)閉消耗ATP的合成代謝和開啟ATP的分解代謝途徑，通過這種機(jī)制維持細(xì)胞內(nèi)代謝能量穩(wěn)態(tài)［23］。AMPΚ在自噬過程中擔(dān)當(dāng)關(guān)鍵酶的角色，AMPΚ的激活可促使細(xì)胞自噬，降低組織細(xì)胞對(duì)能量的需求，同時(shí)也通過消化自身結(jié)構(gòu)物質(zhì)的機(jī)制來獲取能量［24］。因此，AMPΚ的活化被認(rèn)為在大多數(shù)的應(yīng)激狀態(tài)下對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)作用。mTOR是與AMPΚ截然不同的能量感應(yīng)器，在細(xì)胞自噬過程中具有門控作用，其活性是自噬體形成和成熟的關(guān)鍵，也是細(xì)胞自噬的負(fù)性調(diào)節(jié)因子［25］。mTOR是多數(shù)介導(dǎo)自噬信號(hào)通路的中間樞紐，因此mTOR被認(rèn)為是細(xì)胞自噬最主要的抑制性通路。在AMPΚ介導(dǎo)的自噬信號(hào)通路中，mTOR 是其下游重要的信號(hào)分子。細(xì)胞遭受應(yīng)激損傷過程中mTOR 受到抑制，其機(jī)制主要通過AMPΚ的激活［25］。在本實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果顯示熱打擊后即誘導(dǎo)了AMPΚ的磷酸化激活，3 h達(dá)高峰，6 h后被抑制；而mTOR以及其下游蛋白4EBP1和p70S6Κ的磷酸化在熱打擊后明顯下調(diào)，6 h后表達(dá)開始上調(diào)，與AMPΚ的磷酸化呈現(xiàn)相反趨勢。因此，熱打擊后早期激活了MAECs中AMPΚ/mTOR信號(hào)通路，但隨著復(fù)溫時(shí)間的延長逐漸被抑制，與熱打擊后MAECs 的自噬表達(dá)趨勢呈現(xiàn)一致性。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AMPΚ抑制劑Compound C明顯抑制了熱打擊誘導(dǎo)的MAECs中LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白的表達(dá)，促進(jìn)了熱打擊誘導(dǎo)p62蛋白的表達(dá)，并且使用Compound C預(yù)處理小鼠后，可導(dǎo)致熱打擊后小鼠主動(dòng)脈血管損傷嚴(yán)重，內(nèi)皮細(xì)胞明顯脫落，內(nèi)彈力膜斷裂，平滑肌排列紊亂，出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞；而mTOR抑制劑rapamycin均呈現(xiàn)相反作用；因而，可以確認(rèn)AMPΚ/mTOR 信號(hào)通路參與介導(dǎo)了熱打擊后主動(dòng)脈血管和MAECs自噬的過程。

我們前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)核外p53可以通過抑制自噬誘導(dǎo)ⅤECs出現(xiàn)廣泛損傷［3］。并且，p53通過磷酸化AMPΚ調(diào)控自噬抑制因子mTOR活性是其在核內(nèi)發(fā)揮自噬促進(jìn)功能的重要信號(hào)途徑［5,26］。在細(xì)胞核內(nèi)，p53可通過激活A(yù)MPΚ誘導(dǎo)SC1/TSC2復(fù)合體磷酸化激活，進(jìn)而抑制mTOR，促進(jìn)細(xì)胞自噬的發(fā)生［27］。此外，核內(nèi)p53也能通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)拮抗因子sestrins表達(dá)，并促使sestrins 與AMPΚ 結(jié)合，從而抑制mTOR 活性［28,29］。然而，目前對(duì)于核外p53抑制細(xì)胞自噬的分子機(jī)制尚不明確，相關(guān)也較少，也缺乏熱損傷誘導(dǎo)核外p53抑制細(xì)胞自噬的相關(guān)研究。在本實(shí)驗(yàn)中，通過使用使用p53線粒體轉(zhuǎn)位抑制劑PFT 預(yù)處理MAECs（已有研究證實(shí)PFT可有效消除核外p53對(duì)自噬的抑制作用，并且對(duì)核內(nèi)p53 調(diào)控自噬作用無明顯影響），PFT 明顯促進(jìn)AMPΚ的磷酸化激活，并抑制mTOR以及其下游蛋白4EBP1和p70S6Κ的磷酸化；使用PFT后也明顯誘導(dǎo)了自噬的重要蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1的表達(dá)，并抑制了P62的表達(dá)；并且，使用PFT后明顯提高了MAECs的細(xì)胞活力，減輕了小鼠主動(dòng)脈血管損傷，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、脫落有所改善，凋亡細(xì)胞減少。因而，核外p53主要通過抑制AMPΚ活性，激活mTOR信號(hào)，繼而介導(dǎo)細(xì)胞自噬抑制，參與熱打擊誘導(dǎo)的主動(dòng)脈血管和MAECs損傷。

本實(shí)驗(yàn)將熱損傷后早期階段作為研究切入點(diǎn)，并以ⅤECs 為研究的突破口，闡明了p53 主要通過調(diào)控AMPΚ/mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)自噬抑制參與熱打擊誘導(dǎo)的MAECs損傷，但仍停留在實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的初步觀察，仍需進(jìn)一步深入的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)完善目前結(jié)論。