張 海 程光遠(yuǎn) 楊宗桃 王 彤 劉淑嫻 商賀陽 趙 賀 徐景升

福建農(nóng)林大學(xué)國家甘蔗工程技術(shù)研究中心 / 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部福建甘蔗生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 教育部作物遺傳育種與綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福建福州 350002

鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin, CRT)在真核生物中高度保守并廣泛表達(dá)[1-4], 主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum, ER)和胞間連絲(plasmodesmata, PD), CRT是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中主要的Ca2+結(jié)合蛋白, 具有分子伴侶功能[5-8]。Ca2+是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使, 在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要作用[5,9]。因此, CRT 參與調(diào)控Ca2+穩(wěn)態(tài)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)控(endoplasmic reticulum quality control, ERQC)、生長發(fā)育和免疫應(yīng)答等多種生物學(xué)過程[2-4,10-12]。CRT 在哺乳動(dòng)物中的研究較為深入, 該蛋白除了上述基本生物功能外, 還參與了癌癥等疾病的發(fā)生[13-14]。植物中CRT 的研究相對(duì)滯后[15], 研究表明CRT 廣泛應(yīng)答生物和非生物脅迫,參與干旱、低溫、鹽脅迫、真菌、細(xì)菌、病毒的侵染等逆境脅迫反應(yīng)[2,4,8,16-21]。

甘蔗(Saccharumspp. hybrid)是我國和世界上最重要的糖料作物和能源作物[22-24]。甘蔗花葉病毒(Sugarcane mosaic virus, SCMV)屬于馬鈴薯Y 病毒科(Potyviridae) Y 病毒屬(Potyvirus), 是甘蔗花葉病的主要病原之一, 嚴(yán)重危害甘蔗生產(chǎn)[25-28]。SCMV為單鏈正義RNA 病毒, 長度約為10 kb, 編碼2 個(gè)多聚蛋白, 經(jīng)自身編碼的蛋白酶裂解后形成11 個(gè)成熟的功能蛋白, 從N 端至C 端分別為P1、HC-Pro、P3、P3N-PIPO、6K1、CI、6K2、VPg、NIa、NIb 和CP蛋白[29-32]。其中, 6K2 蛋白參與病毒的復(fù)制、胞內(nèi)與胞間移動(dòng), 在馬鈴薯Y 病毒屬病毒建立系統(tǒng)性侵染過程中起著至關(guān)重要的作用[33-37]。

本課題組在前期研究中, 以SCMV 編碼的6K2蛋白為誘餌, 從甘蔗品種ROC22 葉片cDNA 酵母文庫中篩選到了具有完整開放讀碼框(open reading frame, ORF)的CRT基因, 其長度為1281 bp。在本研究中, 我們進(jìn)一步從Badila 葉片中克隆了該基因,命名為ScCRT1。本研究利用 RT-qPCR 分析了ScCRT1基因在甘蔗不同組織中的表達(dá)特異性以及應(yīng)答 SCMV 侵染的表達(dá)情況; 利用酵母雙雜交(yeast 2 hybrid, Y2H)和雙分子互補(bǔ)(bimolecular fluorescence complementation, BiFC)技術(shù)驗(yàn)證了ScCRT1 蛋白與SCMV-6K2 的互作關(guān)系; 利用瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn), 研究了ScCRT 的亞細(xì)胞定位。本研究為研究SCMV 侵染甘蔗的分子機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù), 并為甘蔗抗花葉病育種提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及處理方法

SCMV 病毒、甘蔗品種Badila 組培苗、本氏煙(Nicotiana benthamiana)苗由福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部福建甘蔗生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。2019 年11 月, 待組培苗長至15～25 cm、完全展開葉出現(xiàn)4～5 片時(shí), 摩擦接種SCMV, 設(shè)置3 個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)5 株, 對(duì)照植株使用磷酸緩沖液(pH 7.0)摩擦接種, 使用SCMV-CP基因特異引物(表1)檢測(cè)接種是否成功。分別在接種后0 h、4 h、8 h、12 h、18 h、1 d、2 d、3 d、4 d 取樣, 研究目的基因應(yīng)答SCMV 侵染的表達(dá)模式。在隔離網(wǎng)室內(nèi)隨機(jī)選取9株處于伸長期且長勢(shì)一致健康的Badila植株, 分成3 組, 每組3 株。取其白色嫩根、心葉(未展開的葉)、正一葉(甘蔗最高可見肥厚帶的第一葉)、正四葉、第四節(jié)間、第八節(jié)間, 用于研究目的基因的組織表達(dá)特性。樣品采集后用液氮速凍, 置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA 提取和cDNA 合成

使用TRIzol (Invotrigen, USA)試劑, 按照說明書要求提取樣品總RNA, 用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 質(zhì)量。使用Nanodrop (Thermo Scientific,USA)測(cè)定RNA 的濃度, 按照Prime Script RT Reagent Kit 使用說明書, 將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.3 ScCRT1 基因的克隆及生物信息學(xué)分析

以篩選酵母文庫獲得的CRT基因序列為參考,通過同源克隆的方法, 在起始密碼子和終止密碼子附近設(shè)計(jì)ScCRT1基因的特異擴(kuò)增引物(表1)。以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA 為模板, 使用PrimeSTAR GXL DNA polymerase (TaKaRa Bio, Japan)高保真酶, 參照Shinohara 等[38]的方法克隆ScCRT1基因, 并送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

表1 本研究使用的引物Table 1 Primers used in this study

將測(cè)序獲得目的基因序列, 利用 NCBI 中的ORF finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)軟件分析開放閱讀框, 并獲取其氨基酸序列。利用ProtParam (http://expasy.org/tools/protparam.html)預(yù)測(cè)蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì); 利用GOR4 (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)、SignalP 5.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 和 TMHMM 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分別預(yù)測(cè)分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)、信號(hào)肽和跨膜特性; 用 Blastp 在線工具查找ScCRT1 的同源氨基酸序列, 使用DNAMAN 6.0 軟件多重比對(duì)同源氨基酸序列, 使用 ClustalX 和MEGA 7.0 的ML (maximum likelihood, LG+G)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 ScCRT1 的RT-qPCR 表達(dá)分析

根據(jù)ScCRT1基因的ORF 序列, 設(shè)計(jì)特異性實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物(表1), 以GAPDH基因和eEF-1α基因(表 1)作為內(nèi)參基因[39]。按照 SYBR Green PCR Master Mix (Roche)說明書配制定量反應(yīng)體系, 在熒光定量PCR 儀上完成定量PCR 擴(kuò)增。每個(gè)樣品設(shè)置3 次技術(shù)重復(fù), 以無菌水作對(duì)照, 擴(kuò)增程序?yàn)?0℃ 2 min, 95℃ 10 min; 95℃ 15 s, 60℃1 min, 40 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后, 采用2–ΔΔCt算法分析獲得的數(shù)據(jù)[40]。

1.5 ScCRT1 的亞細(xì)胞定位

參照Cheng 等[29]的方法, 利用Gateway 方法將ScCRT1構(gòu)建到pEarlyGate101 載體中, 獲得ScCRT1亞細(xì)胞定位質(zhì)粒 ScCRT1-YFP 并轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中。取健康的本氏煙植株, 參照Cheng 等[29]農(nóng)桿菌侵染方法, 將帶有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌注射入健康的本氏煙葉片。48 h 后在激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP5II)下觀察本氏煙葉片表皮細(xì)胞中ScCRT1 蛋白的定位, YFP 的激發(fā)光波長為514 nm,捕獲波長為530～590 nm。

1.6 Y2H 驗(yàn)證ScCRT1 與SCMV-6K2 的互作

參照Zhang 等[34]的方法構(gòu)建ScCRT1基因的誘餌載體pBT3-SET-ScCRT1, 利用Y2H 技術(shù)驗(yàn)證其與pPR3-N-SCMV-6K2 的互作關(guān)系。pTSU2-APP 和pNubG-Fe65 組合作為陽性對(duì)照, pNubG-Fe65 和pPR3-N 組合作為陰性對(duì)照, pBT3-SET-ScCRT1 和pPR3-N 組合為自激活驗(yàn)證。

1.7 BiFC 驗(yàn)證ScCRT1 與SCMV-6K2 的互作

參照Cheng 等[29]的方法構(gòu)建ScCRT1-YC 載體,利用BiFC 技術(shù)驗(yàn)證其與YN-SCMV-6K2 的互作。YFP 的激發(fā)光波長為 514 nm, 捕獲波長為530～590 nm; 葉綠素自熒光的激發(fā)光波長為552 nm,采集波長為650～680 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 ScCRT1 基因的克隆與生物信息學(xué)分析

經(jīng)PCR 擴(kuò)增和測(cè)序, 本研究從Badila中克隆了1 條ORF 長度為1281 bp 的CRT基因, 該基因編碼426 個(gè)氨基酸。核苷酸序列比對(duì)表明, 該CRT 序列與高粱的CRT1 (Sorghum bicolor, XM_021451918.1)同源性高達(dá)96.49%, 將該基因命名為ScCRT1, 并提交GenBank, 登錄號(hào)為MT635395。ProtParam 分析表明, ScCRT1 的分子量為48.22 kD, 等電點(diǎn)為4.43;不穩(wěn)定系數(shù)為 35.67, 為穩(wěn)定蛋白; 脂溶指數(shù)為63.29, 總平均親水性是-1.023, 可能是親水性蛋白。GOR4 預(yù)測(cè)表明, ScCRT1 中無規(guī)則卷曲占比最高,達(dá)到60.09%; 其次是延伸鏈和α 螺旋, 占比分別為20.19%和19.72%; 無β-折疊結(jié)構(gòu)?？缒そY(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果表明, ScCRT1 具有1 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域, 其分布在13～35, 膜向性為 i→o。SignalP 5.0 分析表明,ScCRT1 蛋白含有信號(hào)肽, 且信號(hào)肽的剪切位點(diǎn)位于第31 和32 號(hào)氨基酸之間(圖1), 為分泌蛋白。

2.2 ScCRT1 的氨基酸序列同源性分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

典型的CRT 蛋白含有3 個(gè)不同的結(jié)構(gòu)和功能域:高度保守的球狀N-結(jié)構(gòu)域, 其末端含有一個(gè)信號(hào)肽序列; P-結(jié)構(gòu)域, 具有高親和力和低Ca2+結(jié)合能力;C-結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)出低親和力和高的Ca2+結(jié)合能力, 其末端包含有(K/H)DEL 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)[1-2]。在ScCRT1 氨基酸中發(fā)現(xiàn)具有上述典型的CRT 的3 個(gè)結(jié)構(gòu)域組成, 殘基1～31 的疏水信號(hào)肽序列, 殘基32～216 的球形N-結(jié)構(gòu)域, 殘基217～313 的富含脯氨酸P-結(jié)構(gòu)域, 殘基314～426 的多酸性氨基酸C-結(jié)構(gòu)域并含有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)HDEL 基序(圖1)。通過NCBI 網(wǎng)站的 Blastp 和 Phytozome 網(wǎng)站的 Proteome Blastp 搜索 ScCRT1 同源序列, 結(jié)果顯示,ScCRT1 蛋白與高粱(XP_021307591.1)、玉米(Zea mays, XP_008670080.1)、二穗短柄草(Brachypodium distachyon, XP_003563166.1)、谷子(Setaria italic,XP_004981159.1)、水稻(Oryza sativa, XP_01562 8738.1)和擬南芥(Arabidopsis thaliana, NP_176030.1)的CRT 蛋白相似度分別為96%、90%、92%、86%、78%、72%。對(duì)甘蔗及其他物種CRT 蛋白的氨基酸序列同源性分析表明, 在其N-結(jié)構(gòu)域和P-結(jié)構(gòu)域氨基酸序列高度保守, 信號(hào)肽序列和C-結(jié)構(gòu)域氨基酸序列因物種的不同表現(xiàn)出明顯的差異(圖1)。

使用ClustalX 和MEGA 7.0 的ML (maximum likelihood, LG+G)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹, 分析ScCRT1蛋白與其他物種CRT 蛋白的進(jìn)化關(guān)系。結(jié)果表明,植物CRTs 蛋白主要分為2 種亞型: CRT1/CRT2 亞型和 CRT3 亞型。在擬南芥中 CRT 含有 AtCRT1(AT1G56340.2)、AtCRT2 (AT1G09210.1)和AtCRT3(AT1G08450.1) 3 種蛋白, 包括2 個(gè)蛋白亞型; 其中AtCRT1 與AtCRT2 相似性很高, 為CRT1/CRT2 亞型; AtCRT3 為CRT3 亞型, 該亞型與CRT1/CRT2 亞型存在著較大差異[41-42]。基于進(jìn)化樹分析, 我們克隆的ScCRT1 蛋白屬于CRT1/CRT2 亞型(圖2)。

單子葉植物甘蔗、高粱、柳枝稷(Panicum virgatum)、水稻、谷子、大麥(Hordeum vulgare)、二穗短柄草形成群I; 雙子葉植物煙草(Nicotiana tabacum)、葡萄(Vitis vinifera)、三葉楊(Populus trichocarpa)、大豆(Glycine max)、苜蓿(Medicago sativa)、擬南芥形成群II (圖2)。在遺傳進(jìn)化上, CRT 蛋白在單子葉植物和雙子葉植物之間存在明顯的分化。

2.3 ScCRT1 的亞細(xì)胞定位

在激光共聚焦顯微鏡下觀察煙草瞬時(shí)表達(dá)ScCRT1-YFP 融合蛋白的黃色熒光在細(xì)胞內(nèi)的分布(圖3); ScCRT1-YFP 融合蛋白的黃色熒光信號(hào)為典型的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào), 表明其主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。

2.4 ScCRT1 基因的組織特異性表達(dá)及應(yīng)答SCMV 侵染的表達(dá)模式

基于RT-qPCR 技術(shù), 以根中ScCRT1基因的表達(dá)量為參照基準(zhǔn), 采用 2–ΔΔCt法對(duì)甘蔗各組織ScCRT1基因表達(dá)量的分析結(jié)果(圖4)表明,ScCRT1基因的表達(dá)具有明顯的組織特異性, 在不同組織中的表達(dá)量差異較顯著, 其在心葉中的相對(duì)表達(dá)量最高, 根和正一葉次之, 第八節(jié)間中表達(dá)量最少。使用SCMV-CP基因特異引物(表1)檢測(cè)SCMV 接種的甘蔗, 選出擴(kuò)增出目的片段的樣品, 進(jìn)行ScCRT1基因應(yīng)答SCMV 侵染的RT-qPCR 試驗(yàn)。結(jié)果顯示SCMV的侵染對(duì)ScCRT1基因表達(dá)的影響顯著, 與對(duì)照相比,ScCRT1基因在侵染早期顯著上調(diào), 在12 h 時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大值, 然后下調(diào)表達(dá), 但仍顯著高于對(duì)照(圖5)。

2.5 ScCRT1 與SCMV-6K2 的互作驗(yàn)證

Y2H 試驗(yàn)結(jié)果顯示, pBT3-SET-ScCRT1 和pPR3-N 共轉(zhuǎn)酵母細(xì)胞NMY51和陰性對(duì)照在添加了5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)的SD/-Leu/-Trp (DDO)培養(yǎng)基上生長, 但在添加了X-Gal 的SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade (QDO)培養(yǎng)基上不生長; pBT3-SET-ScCRT1 和pPR3-N-SCMV-6K2 共轉(zhuǎn)的酵母菌株NMY51和陽性對(duì)照在添加了X-Gal 的DDO 和QDO培養(yǎng)基上可以生長并呈現(xiàn)藍(lán)色(圖6)。表明pBT3-SET-ScCRT1 不具有自激活性; ScCRT1 與SCMV-6K2 蛋白在體外互作。

BiFC 試驗(yàn)結(jié)果表明, 共注射的 YN-6K2 和ScCRT1-YC 在本氏煙葉片表皮細(xì)胞中產(chǎn)生黃色熒光信號(hào)(圖7), 說明ScCRT1 與SCMV-6K2 互作, 這與Y2H 試驗(yàn)結(jié)果一致, 進(jìn)一步表明 ScCRT1 與SCMV-6K2 互作。

3 討論

盡管病毒與寄主相融, 但是病毒侵染仍然會(huì)對(duì)寄主造成脅迫, 導(dǎo)致寄主在轉(zhuǎn)錄組水平對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行重新編程, 產(chǎn)生大量差異表達(dá)基因[43-46]。本課題組前期研究表明, 甘蔗花葉病另外1 個(gè)主要病原甘蔗條紋花葉病毒(Sugarcane streak mosaic virus,SCSMV,Poacevirus)侵染甘蔗品種FN40導(dǎo)致CRT基因表達(dá)上調(diào)[45]。本研究中,ScCRT1基因在SCMV侵染早期表達(dá)上調(diào), 隨著時(shí)間加長逐漸下降, 但仍顯著高于對(duì)照。該結(jié)果與番木瓜PaCRT基因應(yīng)答番木瓜環(huán)斑花葉病毒(Papaya ringspot virus, PRSV,Potyvirus)侵染的表達(dá)模式相似[21]。這些研究結(jié)果表明,CRT應(yīng)答病毒侵染的分子機(jī)制可能相同, 這也與CRT 蛋白結(jié)構(gòu)保守的特性相符。ScCRT1 主要定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中(圖3)。定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的CRT 參與了Ca2+穩(wěn)態(tài)調(diào)控和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)控, 對(duì)于Ca2+依賴的信號(hào)傳導(dǎo)和新合成蛋白的正確折疊具有重要作用[9-10]。病毒侵染會(huì)造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫, 影響蛋白的正確折疊[45,47]。因此我們推測(cè)SCMV 侵染甘蔗也會(huì)造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫,干擾ScCRT1 作為分子伴侶協(xié)助蛋白折疊的功能,為此寄主上調(diào)ScCRT1表達(dá)以應(yīng)答脅迫。

植物病毒與寄主長期協(xié)同進(jìn)化[48]且結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,必須與寄主因子互作才能建立系統(tǒng)性侵染[49]。本研究利用Y2H 和BiFC 試驗(yàn)證明了SCMV-6K2 與ScCRT 的互作(圖6 和圖7), 互作位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞膜, 并且在細(xì)胞膜上出現(xiàn)點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)。我們推測(cè)細(xì)胞膜上的互作位點(diǎn)有可能位于胞間連絲, 這種互作可能在侵染早期阻礙SCMV 胞間移動(dòng)。馬鈴薯Y 病毒的胞間移動(dòng)是以6K2 誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形成的囊泡的形式進(jìn)行的[36-37], SCMV-6K2 與ScCRT1 互作于胞間連絲,可能由于CRT 的Ca2+調(diào)節(jié)功能, 導(dǎo)致胞間連絲位置Ca2+濃度升高, 激活胼胝質(zhì)合成酶Cals[50], 促進(jìn)胼胝質(zhì)合成積累, 進(jìn)而減小胞間連絲的通透性。在煙草應(yīng)答煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus, TMV,Tobamovirus)侵染的研究中, 也有類似研究報(bào)道。煙草的NtCRT 與TMV 的運(yùn)動(dòng)蛋白互作, 過表達(dá)NtCRT嚴(yán)重影響TMV 的胞間移動(dòng)[8]。在非生物逆境鋁離子脅迫下, 小麥、煙草和苜蓿的CRT 上調(diào)表達(dá), 與胼胝質(zhì)共定位沉積于胞間連絲, 阻礙共質(zhì)體運(yùn)輸[51-52]。這些研究結(jié)果表明, CRT 參與調(diào)節(jié)胞間連絲的通透性。Badila極易感染SCMV, 在侵染后期, ScCRT1的表達(dá)量下調(diào), 推測(cè)胞間連絲胼胝質(zhì)積累下降, 通透性增加, 便于SCMV 胞間移動(dòng), 最終建立系統(tǒng)性侵染。

病毒在寄主體內(nèi)建立系統(tǒng)性侵染是一個(gè)動(dòng)態(tài)的生物學(xué)過程, 6K2 不但參與病毒的復(fù)制和胞間移動(dòng),還參與了自噬調(diào)節(jié)[53], 6K2 除了與病毒自身編碼蛋白CI、P3 互作[36,54-55]互作外, 還與很多寄主編碼蛋白互作[34]。而CRT 可能還與病毒編碼的其他蛋白互作, 比如番木瓜的 PaCRT 與番木瓜環(huán)斑病毒(Papaya ring spot virus, PRSV,Potyvirus)的HC-Pro互作[21]。因此, 闡明ScCRT1 在SCMV 侵染中的作用還需要進(jìn)一步深入研究, 如Ca2+濃度的變化, 過表達(dá)或抑制ScCRT1的表達(dá)對(duì)SCMV 的復(fù)制和胞間移動(dòng)的影響等。

4 結(jié)論

從甘蔗葉片中克隆到鈣網(wǎng)蛋白基因ScCRT1,GenBank 登錄號(hào)為MT635395。ScCRT1的ORF 長度為 1281 bp, 編碼 426 aa。亞細(xì)胞定位試驗(yàn)表明,ScCRT1 蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng); RT-qPCR 分析顯示, 該基因在心葉等幼嫩組織中表達(dá)量較高; 在SCMV 侵染條件下,ScCRT1基因的表達(dá)呈先上調(diào)后下調(diào)的表達(dá)模式; Y2H 與 BiFC 試驗(yàn)表明, ScCRT1 與SCMV-6K2 蛋白互作。