高 蕓 張玉雪 馬 泉 蘇盛楠,3 李春燕,* 丁錦峰朱 敏 朱新開 郭文善

1 揚州大學江蘇省作物遺傳生理國家重點實驗室培育點 / 糧食作物現(xiàn)代產業(yè)技術協(xié)同創(chuàng)新中心, 江蘇揚州 225009; 2 太倉市農業(yè)機械技術推廣站, 江蘇太倉 215499; 3 太倉市城廂鎮(zhèn)農業(yè)技術服務站, 江蘇太倉 215499

溫度是影響小麥生長發(fā)育的重要環(huán)境因素之一, 特別是春季3、4 月低溫, 小麥正處于拔節(jié)、孕穗和開花的關鍵生育時期, 低溫嚴重影響了小麥等農作物的生長[1-3]。我國黃淮平原冬麥區(qū)河南省和山東省霜凍害一般發(fā)生頻率達 30%以上, 最高年份可達70%[4]。2016 年越冬凍害造成河南省柘城縣小麥減產 5%～20%, 早春凍害造成減產5%～30%, 晚霜凍害造成減產15%～60%[5]。近55年來, 江蘇省倒春寒平均每年發(fā)生3.8 次, 每次平均持續(xù)時間為3.2 d, 中級以上倒春寒一般發(fā)生率達22%以上[6]。2013 年3 月江蘇省出現(xiàn)4 次寒潮和溫度急劇下降的惡劣天氣, 24 h 降溫幅度高達21.2 ℃, 最低溫度–0.7 ℃, 受災嚴重地區(qū)興化市小麥平均減產 25%左右[7], 可見春季低溫是制約小麥生產的重要氣候因素。

小麥生育中后期逆境脅迫會造成小麥每穗粒數(shù)和千粒重顯著下降, 制約小麥產量的形成[8-9], 小麥在藥隔形成期和孕穗期遇到低溫影響更加顯著, 每穗粒數(shù)的減少與溫度的降幅和低溫持續(xù)時間成正比[10-11]; 尤其是減數(shù)分裂期是小麥低溫最敏感的時期, 該時段低溫脅迫致每穗粒數(shù)減少是產量下降的主要原因[12]。

小麥幼穗發(fā)育的好壞決定了穗型的大小, 其發(fā)育過程受到外界溫度的影響[13-14], 而粒數(shù)的多少往往與花粉育性和花后灌漿物質多少有關。導致小麥花粉育性降低的原因很多: 低溫條件下小麥花粉母細胞減數(shù)分裂過程中出現(xiàn)非同源染色體配對的異?，F(xiàn)象, 導致花粉敗育[12]; 低溫脅迫下植物體內活性氧過度積累, 花藥抗氧化酶活性降低是導致小麥花藥敗育的又一原因[15-17]; 在不育系小麥方面的研究表明, 絨氈層程序化死亡過程的異常、花粉壁無法正常合成、以及花藥中小孢子母細胞淀粉和脂類物質代謝異常等是溫敏核不育小麥受溫度影響致花粉敗育的主要原因[18-20]。

一定強度的春季低溫顯著降低了小麥產量, 除穗數(shù)減少外, 每穗粒數(shù)下降也是減產的重要原因之一。但導致小麥粒數(shù)下降的原因是小孢子母細胞減數(shù)分裂的異常, 還是因為花藥中營養(yǎng)物質代謝、絨氈層死亡過程的異常引起的花粉敗育, 尚沒有明確的結論。本試驗以春性小麥品種揚麥16和半冬性小麥品種徐麥30為材料, 在小麥倒二葉出生期、孕穗期和開花期分別進行低溫處理, 研究春季低溫對小麥花粉育性和粒數(shù)形成的影響及其生理機制, 為提高小麥抗低溫能力、確保小麥穩(wěn)產提供理論依據(jù)和技術支持。

1 材料與方法

供試品種為春性品種揚麥16 和半冬性品種徐麥30, 試驗于2015—2017 年在揚州大學江蘇省作物遺傳生理實驗室盆缽試驗場進行。試驗用土為輕壤土, 兩年度有機質含量平均為14.61 g kg–1, 堿解氮含量為52.35 g kg–1, 速效磷含量為37.35 g kg–1,速效鉀含量為96.51 g kg–1。采用盆栽種植, 盆缽高26 cm, 上口直徑26 cm, 底面直徑18 cm, 底部一共8 個排水孔。每盆裝土12 kg, 基施尿素0.85 g及復合肥(15% N、15% P2O5和15% K2O) 3.5 g, 澆等量水自然沉實后播種, 覆土1 kg。四葉期追施壯蘗肥, 每盆施尿素0.35 g; 葉齡余數(shù)2.5 時追施拔節(jié)肥, 每盆施尿素0.4 g 和復合肥3.33 g。2015 年于10 月31 日播種, 2016 年于11 月18 日播種, 每盆播種12 粒, 四葉期定苗, 每盆留生長一致植株8 株。在人工智能控溫室中進行低溫處理(溫度誤差±0.5 ℃, 大氣相對濕度 70%, 光量子通量密度800 μmol m–2s–1)。

1.1 試驗設計

于倒二葉出生期(倒二葉露尖1～2 cm)、孕穗期(劍葉全展, 劍葉與倒二葉葉枕距2～4 cm)和開花期(小麥中部小穗開出1～2 朵小花)選取生長一致的盆缽分別進行低溫處理。倒二葉出生期、孕穗期、開花期晝夜低溫分別為 5℃/–3℃、 8℃/–1℃和12℃/4℃。每個處理時間均設24 h 和48 h 兩個水平,盆缽土壤水分為田間持水量的60%～70%, 處理結束后移至自然條件下生長至成熟, 以室外自然生長的植株為對照。

1.2 測定內容與方法

1.2.1 花粉母細胞減數(shù)分裂觀察 取處于減數(shù)分裂期的麥穗(劍葉與倒二葉葉枕距為3～4 cm)中下部花藥, 用卡諾固定液固定, 置–20℃冰箱保存。試驗時將花藥取出, 置于載玻片上, 加少許醋酸洋紅,用解剖針迅速將花藥搗碎, 蓋上蓋玻片, 在酒精燈上烤一下, 在顯微鏡下觀察, 挑選適期的花粉母細胞。在蓋玻片一側加入適量的45%醋酸, 在另一側放入吸水紙置換出染液, 使細胞質背景顏色變淺。在液氮中放置數(shù)秒(直到聲音變弱), 用刀片迅速揭去蓋玻片, 晾干。滴加4%多聚甲醛500 μL 靜置5 min, 分別用 70%、90%和 100%酒精脫水。滴加DAPI10 μL, 蓋上蓋玻片, 壓片, 熒光顯微鏡(Olympus BX60)放大倍數(shù)為100 倍進行觀察, 使用Olympus cellSens Dimension 軟件照相。

1.2.2 花藥細胞化學觀察 花藥細胞化學觀察方法參照李東霄[20-21]。小麥抽穗后, 取小麥中下部花藥, 一半花藥通過醋酸洋紅壓片確定二核期和三核期, 另一半用0.1 mol L–1(pH 7.4)磷酸鹽緩沖液配置的含3%戊二醛固定液4℃固定8 h, 再用磷酸緩沖液漂洗3 次, 乙醇逐級脫水。用LR White 樹脂滲透、包埋、聚合。選用Leica EM UC7 型(德國)超薄切片機切1.2 μm 的半薄切片, 高碘酸–希夫反應鑒別紅色多糖物質, 考馬斯亮藍R-250 鑒別藍色蛋白質類物質, 利用Leica DM 2500 型(德國)正置生物顯微鏡進行觀察。

1.2.3 花粉活性觀察 于開花期取麥穗中下部花藥, 采用 I2-KI 染色制片, 采用蔡司顯微鏡(Axio Imager D2 型)觀察花粉發(fā)育情況, 統(tǒng)計花粉敗育率。

1.2.4 穗部性狀調查 于成熟期每個處理取5 盆,調查每個處理每穗結實小穗數(shù)、退化小穗數(shù)、每小穗結實粒數(shù)和每穗粒數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

本文數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010、DPS 6.55等軟件進行數(shù)據(jù)的計算、繪圖、統(tǒng)計分析。因2015—2017 兩年度小麥生長季各項指標變化趨勢基本一致, 本文重點以2016—2017 年數(shù)據(jù)進行詳細分析。

2 結果與分析

2.1 春季不同時期低溫對小麥花粉育性的影響

2.1.1 孕穗期低溫對小麥花粉母細胞減數(shù)分裂的影響 與自然生長對照小麥花粉母細胞減數(shù)分裂后期I、末期I 和末期II 相比較(圖1-1～3), 孕穗期8 ℃/–1℃低溫處理48 h, 2 個品種小麥花粉母細胞減數(shù)分裂過程均觀察到減數(shù)分裂異常情況。揚麥16 花粉母細胞減數(shù)分裂后期I 出現(xiàn)多條落后染色體, 組成染色體橋(圖1-4); 在末期I 子細胞染色體排列散亂, 細胞周圍出現(xiàn)微核(圖1-5); 在末期II 細胞周圍出現(xiàn)微核(圖1-6)。徐麥30 花粉母細胞減數(shù)分裂期后期I 出現(xiàn)染色體橋和落后染色體(圖1-7, 8); 在末期II 出現(xiàn)大小不一致的子細胞(圖1-9), 表明孕穗期低溫影響小麥花粉母細胞的減數(shù)分裂過程。

2.1.2 春季不同時期低溫對小麥花藥發(fā)育的影響

自然生長的2 個品種小麥花藥中, 大液泡減小或者消失, 細胞質內含物積累正常, 在二胞花粉期,多糖物質淀粉和蛋白質含量逐漸增加(圖2-A, D 和圖4-A, D); 在三胞花粉期, 絨氈層降解情況較好,少有殘留的痕跡(圖3-A, D 和圖5-A, D); 在小麥倒二葉出生期和孕穗期低溫處理48 h 后, 處在二胞花粉期的花藥, 大液泡分解程度較低, 細胞質內含物未增加, 顆粒物較少, 淀粉和蛋白質積累量低, 形似空殼, 花粉細胞出現(xiàn)較多不規(guī)則的畸形狀態(tài)(圖2-B, C, E, F 和圖4-B, C, E, F); 三胞花粉期絨氈層細胞明顯延遲分解, 有較多殘留(圖3-B, C, E, F 和圖5-B, C, E, F)。倒二葉出生期低溫處理后小麥花藥中淀粉和蛋白質的積累量均低于孕穗期低溫處理, 淀粉和蛋白質代謝異常的現(xiàn)象更顯著(圖3 和圖5)。這些結果說明倒二葉出生期和孕穗期低溫脅迫均會導致花藥中淀粉、蛋白質代謝異常和絨氈層降解延遲, 影響了小麥花粉的正常發(fā)育。2 個品種均表現(xiàn)為倒二葉出生期低溫處理對花藥淀粉和蛋白質代謝的影響程度大于孕穗期低溫處理。

2.1.3 春季不同時期低溫對小麥花粉?；钚缘挠绊?/p>

開花期通過碘染色觀察花粉?；钚? 揚麥16 和徐麥30 在倒二葉出生期低溫處理后敗育率最高, 變化范圍在23.6%～29.6%, 其次是孕穗期, 變化范圍在13.6%～19.8%, 開花期敗育率僅為7.0%～16.6%(表1)。3 個時期低溫處理后花粉粒敗育率均表現(xiàn)為徐麥30 高于揚麥16, 并且隨低溫處理時間的延長敗育率增加。

表1 春季不同時期低溫對小麥花粉粒活性的影響Table 1 Effects of low temperature in spring at different stages on wheat pollen activity

2.2 春季不同時期低溫對穗部性狀的影響

倒二葉出生期和孕穗期低溫脅迫后, 小麥結實小穗數(shù)和每小穗結實粒數(shù)均顯著低于自然生長對照, 且小穗退化百分率隨著低溫脅迫時間的延長呈上升趨勢(表2)。在兩年間, 揚麥16 倒二葉出生期低溫處理24 h 和48 h 后平均小穗退化百分率分別為17.9%和18.7%, 孕穗期低溫處理24 h 和48 h 后平均小穗退化百分率分別為14.0%和16.4%, 開花期低溫處理揚麥16 退化小穗數(shù)略高于自然對照處理, 但無顯著差異; 徐麥30 在兩年間倒二葉出生期低溫處理24 h 和48 h 之后平均小穗退化百分率分別為22.0%和24.0%, 孕穗期低溫處理24 h 和48 h 后平均小穗退化百分率分別為19.9%和21.2%,徐麥30 開花期低溫處理導致退化小穗數(shù)顯著高于對照處理, 說明徐麥30 在開花期對低溫反應更敏感。2 個品種3 個時期低溫處理后, 每小穗結實粒數(shù)均低于自然生長對照處理, 且隨低溫處理時間的延長而減少。相關性分析表明, 2 個品種兩年間花粉敗育率與小穗退化數(shù)均成顯著正相關, 2015—2016年, 揚麥16 相關系數(shù)0.935**, 徐麥30 相關系數(shù)0.780*, 2016—2017 年, 揚麥16 相關系數(shù)0.848*, 徐麥30 相關系數(shù)0.980**, 退化小穗數(shù)隨著花粉敗育率的增加呈上升趨勢(圖6)。

3 討論

3.1 春季低溫對小麥花粉育性的影響

花藥的發(fā)育情況直接影響小麥粒數(shù)的形成。有研究表明, 不育小麥的花藥異常情況大多出現(xiàn)在小孢子母細胞期、單核靠邊期和二胞花粉期[22-23], 小麥劍葉與倒二葉葉耳距為0～4 cm 時幼穗中小孢子母細胞處于減數(shù)分裂的盛期, 對零度以上低溫最為敏感, 低溫導致后期出現(xiàn)落后的染色體、后期或末期染色體仍停留在赤道板上等異?，F(xiàn)象[24]。本研究結果亦表明, 孕穗期低溫對2 個品種小麥花粉母細胞減數(shù)分裂有顯著影響, 低溫處理后的小麥花粉母細胞出現(xiàn)染色體配對紊亂、減數(shù)分裂染色體不同步、子細胞差異明顯等異?，F(xiàn)象。趙莎等[25]研究表明,敗育小麥農墾58 花藥的絨氈層細胞提前啟動細胞程序性死亡, 但解體過程緩慢, 使單核花粉無法獲得所需的營養(yǎng)物質而敗育。溫敏核不育小麥花藥在二胞花粉后期, 細胞質中內含物質不持續(xù)增加, 淀粉粒積累終止與花粉敗育有關[20]。本試驗研究結果表明, 倒二葉出生期和孕穗期低溫處理后的花藥中,絨氈層在三胞花粉時期仍有較多殘留的痕跡, 說明絨氈層沒有適時解體, 影響了花粉發(fā)育過程中營養(yǎng)物質的供給。同時亦觀察到2 個時期低溫處理均降低了花粉細胞內淀粉粒數(shù)量和蛋白質的積累量, 使得花粉在發(fā)育過程中沒有充足的養(yǎng)分供應, 不能進一步發(fā)育為成熟的花粉粒。與溫敏核不育花粉相比,本研究中低溫處理僅使花粉的內含物質積累量下降,并沒有出現(xiàn)非常嚴重的空泡化現(xiàn)象, 這也是低溫處理后結實率并沒有顯著下降的原因。有研究表明,小麥拔節(jié)期、孕穗期低溫顯著降低葉片的光合能力[26-27], 減少植株干物質積累[28]。本研究中倒二葉出生期低溫處理對花藥中淀粉和蛋白質積累的影響大于減數(shù)分裂期低溫, 這可能是由于倒二葉出生期低溫處理對葉片傷害重, 影響了葉片的光合作用,也間接影響了花粉的營養(yǎng)供給, 導致花粉敗育率顯著增加; 同一時期隨著低溫處理時間的延長, 敗育率增高。有研究指出, 冬性小麥低溫誘導的抗凍害基因在從營養(yǎng)生長期轉向生殖生長期的過程中表達量是顯著下降的, 遇春季低溫抗寒性下降[29], 本試驗中2 個品種間徐麥30 敗育率大于揚麥16, 這個結果與每穗結實粒數(shù)下降的結果一致, 進一步說明半冬性品種徐麥30 在小麥后期低溫的敏感性高于春性品種揚麥16。

從花藥原基分化到成熟花粉粒形成的過程中,花粉母細胞減數(shù)分裂和花藥絨氈層正常發(fā)育是形成可育花粉的關鍵[30]。本試驗研究結果表明, 孕穗期低溫處理后出現(xiàn)了花粉母細胞減數(shù)分裂異常, 花藥細胞畸形以及絨氈層分解遲緩等現(xiàn)象, 花粉育性亦降低。在擬南芥中RCK 基因發(fā)生突變后同源染色體聯(lián)會和交叉紊亂, 二價體數(shù)目減少, 出現(xiàn)單價體,花粉母細胞減數(shù)分裂異常, 導致花粉敗育[31]。在絨氈層發(fā)育的過程中, 多個受體蛋白激酶[32]、轉錄因子MYB (v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)結構域蛋白[33]、鋅指蛋白中的PHD-Finger結構域蛋白[34]等均參與調控, 小麥雄性不育與育性相關基因表達也有關, 早在減數(shù)分裂期育性基因的表達就出現(xiàn)差異, 且外界溫度對不育基因表達量有調控作用[35], 本試驗中低溫脅迫是否導致基因或者蛋白調控過程異常, 從而影響花粉母細胞減數(shù)分裂和絨氈層的程序性死亡的啟動致花粉敗育, 尚需從分子生物學角度開展深入研究。

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3.2 春季低溫對小麥每穗粒數(shù)的影響

春季低溫造成穗數(shù)和每穗粒數(shù)顯著下降[11,13,36]。拔節(jié)期和孕穗期低溫對穗數(shù)和每穗粒數(shù)的影響超過對粒重的影響, 特別是在孕穗期低溫處理后每穗粒數(shù)下降達55.1%, 是產量降低的主要原因[37]。Subedi等[38-39]研究結果表明, 抽穗后低溫顯著降了小麥結實率, 孕穗至開花期低溫導致小麥每穗粒數(shù)顯著下降, 產量下降了35%～78%。本試驗研究結果亦表明,倒二葉出生期和孕穗期低溫均顯著降低了小麥結實小穗數(shù)和每穗粒數(shù), 增加了退化小穗數(shù), 且隨著低溫時間的延長, 小穗退化百分率呈上升趨勢, 每穗粒數(shù)呈下降趨勢。開花期低溫略降低了結實小穗數(shù)和每穗粒數(shù)。相關分析表明花粉敗育率與退化小穗數(shù)呈顯著正相關, 這也進一步說明倒二葉出生期和孕穗期低溫引起花粉敗育是此期低溫致每穗粒數(shù)下降的主要原因。生產中這2 個生育時期若發(fā)生低溫天氣值得關注, 后續(xù)將開展春季低溫的避災減災調控途徑研究, 以提高小麥抗春季低溫逆境能力, 實現(xiàn)穩(wěn)產增產。

4 結論

小麥孕穗期低溫導致花粉母細胞減數(shù)分裂出現(xiàn)染色體配對紊亂等異?，F(xiàn)象, 倒二葉出生期和孕穗期低溫延遲了花藥絨氈層的降解, 花藥中多糖物質淀粉和蛋白質的積累量下降, 花粉發(fā)育因營養(yǎng)物質不足敗育率增加, 開花期低溫處理花粉敗育率略有下降。3 個時期低溫處理均降低小麥每小穗結實粒數(shù)和每穗粒數(shù), 并隨低溫處理時間的延長呈上升趨勢, 以倒二葉出生期低溫處理穗粒數(shù)降低的幅度最大, 其次是孕穗期, 開花期穗粒數(shù)降低幅度最小。相關分析表明, 春季低溫導致小麥花粉育性下降是每穗粒數(shù)降低的主要生理原因。