牛曉靜，張利芳，趙 靜，葉寒露，晏 玲

（武漢市中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)分泌科，武漢 430014）

糖尿病腎病是目前臨床中常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，近年來(lái)流行病學(xué)研究表明，約有21.3%的糖尿病患者并發(fā)腎臟疾病，并表現(xiàn)出逐年升高趨勢(shì)[1]。糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展與高血糖及腎臟血流量等多種因素密切相關(guān)，并以血尿、蛋白尿等為主要臨床特征，然而，目前臨床中對(duì)于糖尿病腎病的治療尚缺乏特異性藥物，現(xiàn)有藥物只能緩解患者的部分癥狀[2]，所以對(duì)于糖尿病腎病治療藥物的研發(fā)仍是目前的工作重點(diǎn)。mTOR/P70S6K 通路作為與細(xì)胞增殖分化密切相關(guān)的重要信號(hào)通路，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)mTOR/P70S6K 通路的異常激活與糖尿病腎病及足細(xì)胞損傷密切相關(guān)[3]。糖腎煎是以中醫(yī)理論為指導(dǎo)的中藥方劑，現(xiàn)代研究表明其對(duì)于糖尿病腎病具有顯著的改善作用[4-5]，然而其對(duì)足細(xì)胞自噬的影響及作用機(jī)制目前尚未見(jiàn)明確報(bào)道。本文通過(guò)研究糖腎煎對(duì)糖尿病腎病大鼠足細(xì)胞自噬及mTOR/P70S6K通路的調(diào)節(jié)作用，為糖腎煎的藥理作用研究提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

BS-420 全自動(dòng)生化分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；3-30KS 高速冷凍臺(tái)式離心機(jī)(德國(guó)Sigma 公司)；Gel Doc EZ 凝膠成像儀(美國(guó)BIO-RAD公司)；CKX41-F32FL熒光倒置顯微鏡(日本OLYMPUS 公司)；MK3 酶標(biāo)儀(芬蘭雷勃診斷有限公司)；ACCU-CHEK Active 血糖儀(瑞士ROCHE公司)。

1.2 藥品及試劑

糖腎煎由生黃芪(批號(hào)181109)30 g，太子參(批號(hào)191011)及五味子(批號(hào)190708)各20 g，生地黃(批號(hào)181223)、山 藥(批號(hào)190526)、山茱萸(批號(hào)190817)、茯苓(批號(hào)190928)、丹皮(批號(hào)191101)、赤芍(批號(hào)190708)、三七(批號(hào)190522)各10 g 組成(北京同仁堂股份有限公司)，將藥材置于1 500 mL蒸餾水中浸泡2 h，煎煮1 h，過(guò)濾，將藥材殘?jiān)糜? 000 mL蒸餾水中煎煮40 min，過(guò)濾，合并兩次濾液，蒸發(fā)濃縮，制成每毫升含生藥2.5 g的制劑；二甲雙胍(中美上海施貴寶制藥有限公司，批號(hào)20191017)；STZ(美國(guó)Sigma 公司，貨號(hào)S0130)；尿蛋白試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號(hào)C035-2-1)；高糖高脂飼料(含蔗糖10%、豬油10%、蛋黃粉10%、膽固醇1.5%、膽酸鈉0.5%、全價(jià)飼料68%)(江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限公司，貨號(hào)1019008)；血清肌酐及血清尿素氮(北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)分別為BC4910、BC1530)；大鼠超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及總抗氧化能力(T-AOC)檢測(cè)試劑盒，蘇木精—伊紅(HE)染色試劑盒，p-mTOR兔多克隆抗體，mTOR 兔單克隆抗體，免疫熒光染色試劑盒—抗兔Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 647，超敏ECL 化學(xué)發(fā)光液(碧云天生物科技有限公司，貨號(hào)分別為S0103、S0131S、S0116、C0105M、AF5869、AF1648、P0176、P0180、P0018M)；LC3、Synaptopodin、p-P70S6K、P70S6K 兔多克隆抗體(賽默飛世爾科技有限公司，貨號(hào)分別為PA5-22729、PA5-97078、PA5-17884、PA5-17883)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD 大鼠41 只，購(gòu)自三峽大學(xué)(合格證NO.42010200003408)，SPF 級(jí)，21 只雄性，20 只雌性，8 周齡，體重200～250 g，飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，溫度為22～26 ℃，相對(duì)濕度50%～70%的飼養(yǎng)條件下進(jìn)行飼養(yǎng)，人工光照明暗各12 h。

1.4 造模、分組及給藥

大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組(6 只)及造模組(35只)，空白對(duì)照組給予普通飼料喂養(yǎng)，造模組參照文獻(xiàn)[6]方法，采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合腹腔注射STZ法建立糖尿病腎病大鼠模型，具體方法：給予大鼠高糖高脂飼料喂養(yǎng)4 周后，按照35 mg/kg一次性腹腔注射給予1%的STZ 溶液，繼續(xù)以高糖高脂飼料喂養(yǎng)1 周后尾靜脈采血，使用血糖儀測(cè)定大鼠隨機(jī)血糖，并隨機(jī)取5 只大鼠進(jìn)行腎組織病理學(xué)檢查，以大鼠隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L且腎組織出現(xiàn)明顯病理學(xué)改變視為糖尿病腎病大鼠造模成功。將剩余造模組大鼠隨機(jī)分為模型組，糖腎煎低、中、高劑量組及二甲雙胍組，每組6 只。糖腎煎低、中、高劑量組分別按照5 g/kg、10 g/kg、20 g/kg[7](以生藥含量計(jì))的劑量灌胃給予大鼠糖腎煎，二甲雙胍組按照100 mg/kg[8]灌胃給予大鼠二甲雙胍，空白對(duì)照組及模型組灌胃給予生理鹽水，所有組別給藥 1 次/d，連續(xù)給藥16 周[7]。末次給藥結(jié)束24 h后，連續(xù)24 h 收集各組大鼠尿液，并使用尿蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定各組大鼠24 h尿蛋白量，隨后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 空腹血糖及糖化血紅蛋白水平的測(cè)定

各組大鼠禁食12 h 后，眼眶靜脈叢取血，使用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定大鼠空腹血糖及糖化血紅蛋白水平。

1.6 血清肌酐及血清尿素氮水平的測(cè)定

腹腔注射給予大鼠30 mg/kg 的戊巴比妥鈉對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉后，取仰臥位，腹主動(dòng)脈取血至干凈離心管中，室溫靜置1 h，8 000 r/min，在4 ℃條件下離心10 min，取上清液，使用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測(cè)試劑盒測(cè)定各組大鼠血清肌酐及尿素氮水平。

1.7 腎組織SOD、MDA及T-AOC水平的測(cè)定

頸椎脫臼法處死大鼠后分離腎組織，加入4 ℃預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液研磨勻漿后，8 000 r/min，4 ℃條件下離心15 min，取上清液，按照試劑盒方法測(cè)定大鼠腎組織SOD、MDA及T-AOC水平。

1.8 HE染色法檢查腎組織病理學(xué)變化

取大鼠腎組織，在4%中性甲醛中固定24 h 后，在石蠟包埋機(jī)包埋后，使用石蠟切片機(jī)進(jìn)行5 μm切片，經(jīng)二甲苯脫蠟及梯度乙醇水化后，使用HE染色試劑盒進(jìn)行常規(guī)染色，并在顯微鏡下對(duì)各組大鼠腎組織病理學(xué)進(jìn)行盲法觀察。

1.9 免疫熒光法測(cè)定足細(xì)胞Synaptopodin 及LC3水平

取大鼠腎組織石蠟切片，經(jīng)脫蠟、水化及抗原修復(fù)后，使用固定液在4 ℃條件下固定過(guò)夜，洗滌液洗3次，5 min/次，封閉液封閉60 min，將切片與Synaptopodin 及LC3 兔多克隆抗體(1∶500 稀釋)4 ℃孵育過(guò)夜，洗滌液洗3 次，5 min/次，加入Alexa Fluor 488 和Alexa Fluor 647 抗兔二抗(1∶1 000 稀釋)37 ℃避光孵育1 h，用DAPI 對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染，滴加抗熒光淬滅劑，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察拍照，使用ImageJ Pro 1.51對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析。

1.10 免疫印記法(western blotting)檢測(cè)腎組織pmTOR、mTOR、p-P70S6K、P70S6K蛋白水平

取大鼠腎組織，置于含有蛋白酶抑制劑和磷酸化酶抑制劑的組織裂解液中，研磨勻漿后，在4 ℃條件下，以12 000 r/min，離心10 min，取上清液，使用BCA 蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒測(cè)定總蛋白濃度。取相當(dāng)于40 μg 蛋白的勻漿液，使用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上，使用封閉液在室溫條件下封閉2 h 后，分別使用p-mTOR、mTOR、p-P70S6K、P70S6K 及GAPDH 抗體(1∶1 000 倍稀釋)在4 ℃條件下孵育過(guò)夜，使用TBST清洗3次，5 min/次，再使用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶2 000倍稀釋)室溫孵育1 h，再次使用TBST 清洗3 次，滴加超敏ECL 化學(xué)發(fā)光液檢測(cè)試劑在凝膠成像系統(tǒng)中成像后，使用ImageJ 1.4.0軟件對(duì)各蛋白表達(dá)量進(jìn)行定量分析。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均通過(guò)SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。多組間比較采用單向方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 糖腎煎對(duì)糖尿病大鼠空腹血糖及糖化血紅蛋白水平的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠空腹血糖及糖化血紅蛋白水平顯著升高(P＜0.05)；與模型組比較，糖腎煎各劑量組大鼠空腹血糖及糖化血紅蛋白水平顯著降低，并呈劑量依賴性(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

表1 大鼠空腹血糖及糖化血紅蛋白水平比較，n=6

表1 大鼠空腹血糖及糖化血紅蛋白水平比較，n=6

與空白對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與糖腎煎低劑量組比較，cP＜0.05；與糖腎煎中劑量組比較，dP＜0.05。

2.2 糖腎煎對(duì)糖尿病大鼠24 h尿蛋白量、血清肌酐及血清尿素氮水平的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠24 h 尿蛋白量、血清肌酐及血清尿素氮水平顯著升高(P＜0.05)；與模型組比較，糖腎煎各劑量組24 h 尿蛋白量、血清肌酐及血清尿素氮水平顯著降低，并呈劑量依賴性(P＜0.05)，見(jiàn)表2。

表2 大鼠24 h尿蛋白量、血清肌酐及血清尿素氮水平比較，n=6

表2 大鼠24 h尿蛋白量、血清肌酐及血清尿素氮水平比較，n=6

與空白對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與糖腎煎低劑量組比較，cP＜0.05；與糖腎煎中劑量組比較，dP＜0.05。

2.3 糖腎煎對(duì)糖尿病大鼠腎組織SOD、MDA 及TAOC水平的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠腎組織SOD及T-AOC 水平顯著降低(P＜0.05)，MDA 水平顯著升高(P＜0.05)；與模型組比較，糖腎煎各劑量組腎組織SOD 及T-AOC 水平顯著升高(P＜0.05)，MDA 水平顯著降低，并呈劑量依賴性(P＜0.05)，見(jiàn)表3。

表3 大鼠腎組織SOD、MDA及T-AOC水平比較，n=6

表3 大鼠腎組織SOD、MDA及T-AOC水平比較，n=6

與空白對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與糖腎煎低劑量組比較，cP＜0.05；與糖腎煎中劑量組比較，dP＜0.05。

2.4 糖腎煎對(duì)糖尿病大鼠腎組織病理學(xué)的影響

空白對(duì)照組大鼠腎組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，無(wú)明顯病理學(xué)變化；與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠腎組織系膜基質(zhì)增生，炎癥細(xì)胞聚集；與模型組比較，糖腎煎各劑量組大鼠腎組織系膜增生減輕，炎癥細(xì)胞聚集明顯減少，二甲雙胍組大鼠腎組織炎癥浸潤(rùn)明顯減輕，見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠腎組織病理學(xué)檢查結(jié)果(HE，×400)

2.5 糖腎煎對(duì)糖尿病大鼠足細(xì)胞Synaptopodin 及LC3水平的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠足細(xì)胞Synaptopodin及LC3熒光強(qiáng)度顯著降低(P＜0.05)；與模型組比較，糖腎煎各劑量組足細(xì)胞Synaptopodin 及LC3熒光強(qiáng)度顯著升高，并呈劑量依賴性(P＜0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 大鼠足細(xì)胞Synaptopodin及LC3水平比較

2.6 糖腎煎對(duì)糖尿病大鼠腎組織p-mTOR、mTOR、p-P70S6K、P70S6K蛋白水平的影響

空白對(duì)照組比較，模型組大鼠腎組織p-mTOR/mTOR、p-P70S6K/P70S6K 水平顯著升高(P＜0.05)；與模型組比較，糖腎煎各劑量組腎組織p-mTOR/mTOR、p-P70S6K/P70S6K水平顯著降低，并呈劑量依賴性(P＜0.05)，見(jiàn)圖3。

圖3 大鼠腎組織p-mTOR、mTOR、p-P70S6K、P70S6K 蛋白水平比較

3 討論

糖尿病腎病是由于長(zhǎng)期血糖水平升高及糖代謝紊亂造成的腎組織病理性改變。近年來(lái)糖尿病腎病在我國(guó)的發(fā)病率逐年升高，是導(dǎo)致終末期腎病的主要病因之一[9]。糖尿病腎病的發(fā)生與血糖水平升高、遺傳因素及腎臟血流動(dòng)力學(xué)異常等因素密切相關(guān)，如不及時(shí)干預(yù)可能會(huì)進(jìn)展為終末期腎衰竭等嚴(yán)重腎病，甚至危及患者生命。足細(xì)胞損傷是由于腎組織病理性改變過(guò)程中出現(xiàn)的足細(xì)胞功能異常，導(dǎo)致腎小球?yàn)V過(guò)率降低及腎小管上皮細(xì)胞損傷等病理改變，進(jìn)而出現(xiàn)血尿、蛋白尿及全身水腫等典型病理特征[10]。目前，臨床中對(duì)于糖尿病腎病的治療常采用控制血糖、血壓等藥物手段，終末期腎病患者則采用替代治療手段。然而，上述治療手段表現(xiàn)出有效率低、不良反應(yīng)多等缺點(diǎn)，且嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。所以，對(duì)于糖尿病腎病治療藥物的開(kāi)發(fā)是當(dāng)前的主要任務(wù)之一。

糖腎煎是基于中醫(yī)學(xué)理論，由生黃芪、太子參、生地、山藥、山茱萸、茯苓、丹皮、五味子、赤芍、三七等傳統(tǒng)中藥材組成的中藥成方制劑，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)于糖尿病腎病具有顯著效果。其中，胡愛(ài)民等[11]研究發(fā)現(xiàn)，糖腎煎聯(lián)合貝那普利能夠顯著調(diào)節(jié)2 型糖尿病腎病患者血糖及血脂代謝，降低患者尿蛋白量，進(jìn)而緩解糖尿病腎病患者疾病狀態(tài)；管煒等[12]研究表明，糖腎煎聯(lián)合羥苯磺酸鈣能夠通過(guò)降低糖尿病腎病患者血肌酐及血清尿素氮水平進(jìn)而改善患者腎功能；晏玲等[13]給予糖尿病腎病大鼠糖腎煎后發(fā)現(xiàn)，糖腎煎能夠通過(guò)降低大鼠胱抑素c及血、尿β2微球蛋白進(jìn)而改善大鼠腎功能。由此表明，糖腎煎在治療糖尿病腎病方面具有較大潛力。

24 h 尿蛋白量、血清肌酐及血清尿素氮水平是反應(yīng)腎組織功能的常用指標(biāo)，尿蛋白量增加提示腎小球?yàn)V過(guò)率降低，血清肌酐及血清尿素氮水平提示腎功能下降[14-15]；本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠24 h 尿蛋白量、血清肌酐及血清尿素氮水平均顯著升高，與模型組比較，糖腎煎各劑量組大鼠24 h尿蛋白量、血清肌酐及血清尿素氮水平均明顯降低，提示糖腎煎能夠呈劑量依賴性改善糖尿病腎病大鼠腎功能，修復(fù)大鼠腎損傷，減緩大鼠疾病進(jìn)展；腎組織SOD、MDA及T-AOC水平是反應(yīng)腎組織氧化應(yīng)激損傷的修復(fù)能力的重要指標(biāo)，研究表明，糖尿病大鼠腎組織MDA水平升高，SOD及T-AOC 水平降低均會(huì)導(dǎo)致糖尿病大鼠腎組織損傷加重，并誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷[16]；本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白對(duì)照組比較，糖尿病腎病模型大鼠腎組織MDA水平升高，SOD 及T-AOC 水平降低，而給予大鼠不同劑量的糖腎煎，大鼠MDA 水平降低，SOD 及TAOC水平升高，提示糖腎煎能夠呈劑量依賴性改善糖尿病腎病大鼠氧化應(yīng)激損傷，提高腎組織自我修復(fù)能力，恢復(fù)大鼠足細(xì)胞功能，并具有一定的劑量依賴趨勢(shì)。

研究表明，足細(xì)胞自噬與糖尿病腎病的進(jìn)展密切相關(guān)，同時(shí)，足細(xì)胞自噬水平降低會(huì)導(dǎo)致腎組織對(duì)氧化應(yīng)激損傷的自我修復(fù)及調(diào)節(jié)能力降低，加重腎組織損傷[17]。Synaptopodin 是一種與肌動(dòng)蛋白微絲偶聯(lián)的蛋白，在動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)于腎小球的足細(xì)胞和后腦的突觸內(nèi)[18]。LC3 是與細(xì)胞自噬相關(guān)的蛋白，研究表明其水平降低是細(xì)胞自噬水平降低的表現(xiàn)[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠Synaptopodin及LC3熒光強(qiáng)度顯著降低提示足細(xì)胞數(shù)目及足細(xì)胞自噬水平均顯著降低，給予大鼠不同劑量的糖腎煎后，大鼠Synaptopodin 及LC3 熒光強(qiáng)度顯著升高，并呈劑量依賴性，提示糖腎煎能夠升高糖尿病腎病大鼠足細(xì)胞數(shù)量及足細(xì)胞自噬水平，進(jìn)而修復(fù)足細(xì)胞抗氧化應(yīng)激損傷功能。

mTOR/P70S6K 是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的與糖尿病腎病及足細(xì)胞損傷密切相關(guān)的信號(hào)通路。王新慧等[20]研究發(fā)現(xiàn)，mTOR 及P70S6K 磷酸化水平升高與足細(xì)胞損傷密切相關(guān)，抑制mTOR 及P70S6K 磷酸化水平則能夠改善足細(xì)胞自噬，修復(fù)足細(xì)胞損傷；詹慧芳等[21]報(bào)道了雷帕霉素能夠抑制mTOR 及P70S6K的磷酸化，進(jìn)而激活足細(xì)胞自噬并改善其損傷狀態(tài)；杜俊杰等[22]研究表明，mTOR通路的異常激活會(huì)抑制足細(xì)胞自噬，而抑制mTOR的磷酸化水平則能夠顯著提高足細(xì)胞自噬水平，修復(fù)足細(xì)胞損傷。由此可見(jiàn)，mTOR/P70S6K 通路在足細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)過(guò)程中起到重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠腎組織p-mTOR/mTOR、p-P70S6K/P70S6K 水平顯著升高；與模型組比較，糖腎煎各劑量組及二甲雙胍組腎組織p-mTOR/mTOR、p-P70S6K/P70S6K水平顯著降低，提示糖腎煎能夠呈劑量依賴性顯著降低mTOR/P70S6K通路的磷酸化水平，進(jìn)而修復(fù)大鼠腎足細(xì)胞損傷，調(diào)節(jié)足細(xì)胞自噬，改善大鼠腎功能，進(jìn)而改善糖尿病腎病大鼠疾病轉(zhuǎn)歸。

綜上所述，糖腎煎能夠顯著改善糖尿病腎病大鼠腎功能，修復(fù)足細(xì)胞損傷，調(diào)節(jié)足細(xì)胞自噬水平，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)mTOR/P70S6K通路有關(guān)。