張秀燕，王 強(qiáng)，孫曉娟，田 樂，高 蕾，王海濱，高書軍△

（張家口市第二醫(yī)院 1.手麻科；2.骨科，張家口 075000）

肋骨骨折是鈍性胸外傷后最常見的損傷，約占所有鈍性胸外傷人群的50%[1]。肋骨骨折可增加患者肺部感染和死亡的風(fēng)險，尤其是在老年人群中[2]。過去的幾十年中，在肋骨骨折患者的護(hù)理方面取得了巨大的進(jìn)步，但患者的預(yù)后仍然很差[3]，因此亟待研發(fā)出新的治療策略。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）是TGF-β超家族成員，能夠刺激間充質(zhì)骨祖細(xì)胞向成骨細(xì)胞成熟[4]。矮小相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2 (runt-related transcription factor 2，Runx2)，也稱為核心結(jié)合因子α 亞基1（core-binding factor subunit alpha-1，CBF-alpha-1），由Runx2 基因編碼，Runx2 是調(diào)控成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[5-6]。BMP2和Runx2轉(zhuǎn)錄因子均能夠刺激成骨細(xì)胞分化和骨形成[1]。有文獻(xiàn)報道，BMP2可以通過激活Smad 蛋白來刺激包括Runx2 在內(nèi)的許多靶基因的表達(dá)而發(fā)揮作用[7]。此外，Runx2通過直接結(jié)合靶基因中的增強(qiáng)子區(qū)域來誘導(dǎo)成骨細(xì)胞特異性基因表達(dá)[1]。

miR-29 家族是一種骨骼和肌肉發(fā)育密切相關(guān)的miRNA，能夠調(diào)控成骨細(xì)胞的增殖和分化[8]，由miR-29a、miR-29b 和miR-29c 組成。研究發(fā)現(xiàn)，miR-29b-3p通過靶向調(diào)控BMP1抑制骨折后的愈合過程[9-10]。本研究通過構(gòu)建大鼠肋骨骨折，探討miR-29對BMP2/Runx2的調(diào)控作用及其對骨折愈合的影響，為促進(jìn)臨床骨折愈合提供新的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 40只10周齡SPF級雄性SD大鼠，體重（200±20）g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2014-0001。

1.2 肋骨骨折大鼠模型的建立與動物分組 異氟烷麻醉大鼠，取左側(cè)臥位，捫及第六肋骨，分層切開皮膚、皮下組織和肌肉，剝離骨膜，顯露肋骨并橫向剪斷，使肋骨自由移動，對位分層縫合[11]。術(shù)后1 d，將大鼠隨機(jī)分為對照組和miR-29 組，每組20 只。miR-29 組在骨折斷端，使用微量注射器注射30 μL miR-29 mimic（購自上海吉凱基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司，終濃度1.67 μg/μL，溶于生理鹽水），對照組注射等量生理鹽水。

1.3 Micro-CT 掃描 造模14 d、28 d 后，每組分別處死10 只大鼠，X 線片觀察大鼠肋骨愈合情況。Micro-CT掃描檢測各組肋骨顯微結(jié)構(gòu)參數(shù)，掃描條件為：圖像矩陣為2 048×2 048，整合時間為200 ms，能量/強(qiáng)度為70 kVp、114 μA、8 W，以0°旋轉(zhuǎn)，進(jìn)行掃描。掃描結(jié)束后用Micro-CT 自帶的軟件進(jìn)行定量分析，指標(biāo)包括骨密度、骨礦物質(zhì)含量及骨骼體積比。

1.4 Western blotting法檢測Runx2和BMP2蛋白表達(dá) 取大鼠肋骨骨痂組織，加入組織裂解液充分研磨，離心，取上清，BCA法測定蛋白濃度。加入上樣緩沖液（1∶4）煮沸使蛋白變性，每孔加入30 μg樣品或5 μL Marker 進(jìn)行SDS-PAGE，濃縮膠電壓75 V，30 min，分離膠電壓120 V，60 min；轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，洗膜；一抗Runx2、BMP2、β-actin（均1∶1 000，Abcam，英國）4 ℃冰箱孵育過夜，洗膜；山羊抗兔IgG 二抗（1∶3 000，Abcam，英國）室溫孵育30 min，洗膜；ECL 顯色，曝光。采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值。以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達(dá)量

1.5 實(shí)時熒光定量PCR（RT-qPCR）法檢測Runx2和BMP2 mRNA 相對表達(dá)量 Trizol 法提取肋骨骨痂組織樣本總RNA，nanodrop 測定RNA 濃度，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系為20 μL：上游和下游引物各(10 μmol/L)1.0 μL，cDNA 2.0 μL，SYBRTM Premix Dimer Eraser(2×)10 μL，ddH2O 4.0 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s，55 ℃退火、延伸各20 s，共40 個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達(dá)量，引物序列如下，BMP2 上游：5'-TGCACCAAGATGAACACAGC-3'，下游：5'-GTGCCACGATCCAGTCATTC-3'；Runx2 上游：5'-CCATAACGGTCTTCACAAATCCT-3'，下游：5'-TCTGTCTGTGCCTTCTTGGTTC-3'；miR-29a上游：5'-ACAGACTCATTCCATTGTGC-3'，下游：5'-CCACATGCAATTCAGGTCAG-3'；β-actin上游：5'-CTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3'，下游：5'-TACATGGCTGGGGTGTTGA-3'，U6 上游：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'，下游5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 27.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。組內(nèi)和組間進(jìn)行兩兩比較時，若滿足正態(tài)分布且方差齊性采用Student'st檢驗(yàn)；若服從正態(tài)分布但方差不齊，則用Welch'st-test；若非正態(tài)分布，則用Mann-WhitneyUtest，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠一般情況比較 miR-29組20只大鼠均成活并造模成功；對照組20 只大鼠均造模成功，未發(fā)生死亡。所有大鼠術(shù)后第1 天活動自如，進(jìn)食及飲水正常。術(shù)后1 周傷口局部紅腫逐漸消退，無滲液。

2.2 骨組織愈合情況比較 X線片顯示，自14 d開始，兩組均有骨痂開始形成，至28 d骨痂塑形改建，說明隨著時間推移兩組的骨折均有不同程度的愈合。兩組X線片圖像顯示，14 d時miR-29組骨痂形成較對照組明顯增加。隨時間推移兩組骨折線均逐漸變模糊，28 d時對照組骨痂塑形完成，骨干趨于正常，骨密度均勻，而miR-29 組愈合情況明顯優(yōu)于對照組（圖1）。此外，Micro-CT結(jié)果顯示，兩組大鼠的骨密度、骨礦物質(zhì)含量及骨骼體積比均隨時間逐漸增加（P＜0.05），與對照組相比，miR-29 組骨密度、骨礦物質(zhì)含量及骨骼體積比均顯著增加（P＜0.05），見圖2。

圖1 不同時間點(diǎn)大鼠胸部X線片

圖2 不同時間點(diǎn)大鼠肋骨微結(jié)構(gòu)變化

2.3 兩組不同時間Runx2 和BMP2 mRNA 相對表達(dá)量比較 與對照組相比，miR-29 組miR-29、Runx2 和BMP2 mRNA 相對表達(dá)量均明顯升高（均P＜0.05），兩組肋骨骨折28 d 時miR-29、Runx2 和BMP2 mRNA 相對表達(dá)量均較14 d 時明顯下降（均P＜0.05），見圖3。

圖3 兩組不同時間miR-29、Runx2及BMP2 mRNA相對表達(dá)量比較

2.4 兩組Runx2 及BMP2 蛋白表達(dá)水平比較 與對照組比較，miR-29 組Runx2 及BMP2 蛋白表達(dá)量均明顯升高（均P＜0.05），兩組肋骨骨折28 d 時Runx2 和BMP2 蛋白表達(dá)量均較14 d 時明顯下降（均P＜0.05），見圖4。

圖4 不同時間點(diǎn)大鼠肋骨中Runx2及BMP2的蛋白量變化

3 討論

骨形成是指未分化的前體細(xì)胞在損傷發(fā)生后趨化集中到損傷部位，并在Smad蛋白、BMP家族等轉(zhuǎn)錄因子的刺激作用下分化為成骨細(xì)胞并合成膠原，最終形成新的骨組織的過程。成骨分化過程受到諸多轉(zhuǎn)錄因子起的調(diào)控，Runx2 和BMP2 作為最主要的成骨分化轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控多種成骨標(biāo)志性基因的表達(dá)，是骨形成中的關(guān)鍵信號通路[12-13]。已有文獻(xiàn)報道，BMP2可以通過激活Smad蛋白和其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來刺激包括Runx2在內(nèi)的許多靶基因的表達(dá)而發(fā)揮作用，其具體機(jī)制為，BMP 信號傳導(dǎo)首先通過配體與Ⅰ型和Ⅱ型BMP受體結(jié)合而激活，并由Smad 經(jīng)典通路或者絲裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途徑進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)[14-15]。本研究結(jié)果表明，肋骨骨折后BMP2、Runx2信號通路激活，誘導(dǎo)前成骨細(xì)胞成骨分化和刺激成骨細(xì)胞增殖，從而促進(jìn)骨痂形成和基質(zhì)礦化。此外，本研究結(jié)果顯示，肋骨骨折28 d 時兩組BMP2、Runx2表達(dá)量均明顯下調(diào)（P＜0.05），表明在骨折愈合末期，骨痂形成和基質(zhì)礦化已趨于完成，BMP2/Runx2信號通路逐漸恢復(fù)非激活水平。

miRNA是在植物、動物和某些病毒中普遍存在的單鏈非編碼RNA分子，長度約20個核苷酸，主要參與了基因的轉(zhuǎn)錄后沉默，被發(fā)現(xiàn)在多種骨科疾病過程中起到核心調(diào)控作用[16]。其中，miR-29家族是研究最為廣泛的miRNA之一。miR-29家族由miR-29a、miR-29b 和miR-29c 組成，miR-29a 主要分布于細(xì)胞質(zhì)，而miR-29b 和miR-29c 主要分布于細(xì)胞核中，發(fā)揮不同的生理病理功能[17-18]。Zhang等[9]發(fā)現(xiàn)，miR-29b-3p 結(jié)合于BMP1 的3'UTR 區(qū)從而降低其mRNA 水平，抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成熟和分化；另一項研究顯示，miR-29b-3p 可以促進(jìn)骨痂礦物質(zhì)沉積、提高骨小梁的體積，因而有利于骨折的愈合[19]。miR-29在骨折愈合中的作用十分復(fù)雜，其干預(yù)時期和所表達(dá)的組織細(xì)胞不同，在骨折愈合中可能會產(chǎn)生不同的作用。此外，在脆性骨折中，miR-29a和miR-29b在患者的血液中低表達(dá)，且與骨密度呈正相關(guān)關(guān)系[20]。在破骨細(xì)胞中特異表達(dá)miR-29a，可以抑制核因子κB 受體活化因子配體（RANKL）和趨化因子CXCL12的表達(dá)，從而抑制破骨細(xì)胞的分化成熟，有利于骨骼中礦物質(zhì)的沉積和骨小梁的形成[21]。最后，miR-29a 還可以通過ERK/MAPK 通過激活Wnt/β-catenin 信號通路，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化成熟；另一方面，miR-29a受Wnt/βcatenin 通路的調(diào)控，在其激活后高表達(dá)，因而miR-29a 可與Wnt/β-catenin 形 成正反饋調(diào)節(jié) 環(huán)路[22-23]。但miR-29a 與BMP2/Runx2 的crosstalk在肋骨骨折中的作用還不明確。本研究通過局部過表達(dá)miR-29a，發(fā)現(xiàn)其能促進(jìn)BMP2/Runx2 的表達(dá)和蛋白量，從而促進(jìn)骨痂形成、提高骨密度而發(fā)揮促進(jìn)骨折愈合的作用。

綜上，miR-29a能夠促進(jìn)大鼠肋骨骨折的恢復(fù)，其作用機(jī)制與BMP2/Runx2 通路有關(guān)，但其具體作用靶點(diǎn)有待進(jìn)一步的研究。