廖軍鋒，王 虹，呂曉宇

（中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院康復醫(yī)學科，廣州 510010）

骨關(guān)節(jié)炎是一種多發(fā)生于中、老年人的炎癥性關(guān)節(jié)病，其發(fā)病機制尚未明確，且缺乏有效的治療手段[1]。研究顯示，骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞凋亡是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生的關(guān)鍵[2]，抑制軟骨細胞凋亡是骨關(guān)節(jié)炎非手術(shù)治療藥物開發(fā)的研究熱點。毛蕊異黃酮是從中藥黃芪中提取的單體成分，具有多種藥理活性。研究顯示，毛蕊異黃酮可通過激活PI3K/Akt和Nrf2/HO-1信號通路減輕缺糖缺氧誘導的心肌細胞損傷[3]；可通過降低腦組織炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激減輕腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織損傷[4]，表明毛蕊異黃酮具有良好的抗炎抗氧化作用，但目前關(guān)于毛蕊異黃酮對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞損傷的影響和機制還未見相關(guān)報道。miR-502-5p屬于微小RNA（miRNA）家族成員，參與增殖、分化和凋亡等生理或病理過程，與腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5-6]。研究顯示，骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨組織中miR-502-5p的表達明顯降低，上調(diào)miR-502-5p 可靶向負調(diào)控TRAF2的表達抑制IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡和炎癥反應(yīng)，miR-502-5p可作為減輕軟骨細胞損傷的分子靶點[7]。因此，本研究通過體外分離培養(yǎng)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞，探究毛蕊異黃酮對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞增殖和凋亡的影響及其能否調(diào)控miR-502-5p 表達發(fā)揮作用，以期為其用于骨關(guān)節(jié)炎的治療提供一定的實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2018 年2 月至2019 年3 月中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院康復醫(yī)學科收治的10 例行全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的骨關(guān)節(jié)炎患者為研究對象，其中男4例，女6例，平均（60.28±6.14）歲。取材位置為股骨髁內(nèi)、外髁負重過度區(qū)的關(guān)節(jié)軟骨組織，液氮保存。樣本采集經(jīng)本院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2 實驗試劑

毛蕊異黃酮，純度≥98%，上海賢鼎生物科技有限公司；阿司匹林，片劑，規(guī)格0.3 g，遠大醫(yī)藥(中國)有限公司；DMEM 培養(yǎng)基、細胞周期檢測試劑盒、Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡試劑盒和二喹啉甲酸（BCA）蛋白檢測試劑盒，北京索萊寶；LipofectamineTM2000 試劑盒，美國Invitrogen 公司；胎牛血清（FBS），浙江天杭生物科技公司；anti-miR-502-5p、anti-miR-NC和PCR引物，上海生工；B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）、B淋巴細胞瘤-2相關(guān)蛋白（Bax）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體，美國Santa Cruz 公司；miRNA 提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒，大連寶生物。

1.3 方法

1.3.1 骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞分離培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 在無菌條件下，將骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織剪成1 mm×1 mm×1 mm，加入0.2 %Ⅱ膠原酶消化30 min，加含10 %FBS 的DMEM 培養(yǎng)基終止消化，過200 目篩，濾液1 000 r/min 離心5 min。棄上清，用含10 % FBS 的DMEM 培養(yǎng)基重懸細胞，接種至培養(yǎng)瓶中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5 d后，更換新鮮培養(yǎng)基，此后每2～3 d更換1 次培養(yǎng)基。待細胞密度至80%時，加0.25%胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。將對數(shù)期骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞接種于6 孔板中（5.0×105個/孔），用LipofectamineTM2000 脂質(zhì)體法，分別轉(zhuǎn)染anti-miR-NC、antimiR-502-5p。轉(zhuǎn)染6 h 后，更換培養(yǎng)基。再培養(yǎng)24 h，收集細胞備用。

1.3.2 細胞分組處理 將未轉(zhuǎn)染的骨關(guān)節(jié)炎細胞分為對照組、毛蕊異黃酮低劑量組、毛蕊異黃酮中劑量組、毛蕊異黃酮高劑量組和陽性對照組，其中對照組細胞用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)，毛蕊異黃酮低、中、高劑量組細胞分別用含0.1 mg/L、1 mg/L、10 mg/L毛蕊異黃酮的培養(yǎng)基培養(yǎng)，陽性對照組細胞用含9 mg/mL 阿司匹林的培養(yǎng)基培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染anti-miRNC、anti-miR-502-5p 的細胞用含10 mg/L 毛蕊異黃酮的培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別記為毛蕊異黃酮高劑量+antimiR-NC 組、毛蕊異黃酮高劑量+anti-miR-502-5p組。

1.3.3 細胞計數(shù)試劑盒8（CCK-8）法檢測細胞增殖試驗 將未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染anti-miR-NC、anti-miR-502-5p 的骨關(guān)節(jié)炎細胞均接種于96 孔板中（1.0×104個/孔），培養(yǎng)12 h 后，棄培養(yǎng)基，按照上述“1.3.2 項”分組處理。分別培養(yǎng)24 h、48 h 和72 h 后，加10 μL CCK-8 試劑。孵育2 h 后，酶標儀450 nm 測光密度（OD）值。

1.3.4 流式細胞儀檢測細胞周期 將未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染anti-miR-NC、anti-miR-502-5p的骨關(guān)節(jié)炎細胞均接種于24孔板中（2.5×104個/孔），培養(yǎng)12 h后，棄培養(yǎng)基，按照上述“1.3.2 項”分組處理。培養(yǎng)48 h 后，收集細胞，并使用PBS 清洗2 次。加1 mL 預冷的70%乙醇，混懸細胞，4 ℃冰箱中固定12 h，1 000 r/min離心5 min，棄上清，并用PBS清洗細胞2次。加0.5 μL PI，37 ℃孵育30 min，上流式細胞儀檢測。

1.3.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡 細胞培養(yǎng)和分組同“1.3.4項”，培養(yǎng)結(jié)束后，收集細胞，用PBS清洗2 次。加500 μL 結(jié)合緩沖液，重懸細胞。依次加10 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI，避光孵育15 min后，上流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.3.6 Western blotting 法檢測Bax 和Bcl-2 蛋白表達 細胞培養(yǎng)和分組同“1.3.4 項”，培養(yǎng)結(jié)束后，收集細胞，用RIPA 試劑提取細胞中總蛋白。經(jīng)BCA法定量、電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉1 h后，分別于Bax（1∶500）、Bcl-2（1∶500）和GAPDH（1∶800）一抗孵育液中4 ℃冰箱過夜。再于山羊抗兔二抗（1∶3 000）孵育液中37 ℃孵育1 h。最后加顯影液避光顯影，曝光拍照。

1.3.7 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測細胞中miR-502-5p表達 細胞培養(yǎng)和分組同“1.3.4項”，培養(yǎng)結(jié)束后，收集細胞，用miRNA 提取試劑盒細胞中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 后，行PCR 擴增。反應(yīng)條件：95 ℃5 min，95 ℃10 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，共35 個循環(huán)。引物序列如下，miR-502-5p 上游：5'-CGGGCATCCTTGCTATCTG-3'，下游：5'-CAGCCACAAAAGAGCACAAT-3'；內(nèi)參U6 上游：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。采用2-△△Ct法計算miR-502-5p相對于內(nèi)參U6的表達水平。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，兩組間比較用獨立樣本t檢驗，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 毛蕊異黃酮對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞增殖的影響

對分離培養(yǎng)的不同傳代的OA軟骨細胞形態(tài)學進行觀察，發(fā)現(xiàn)第一代呈上皮樣，會有高亮圓形細胞，隨著傳代逐漸減少，至第4～6代細胞呈現(xiàn)梭形生長，見圖1。與對照組比較，毛蕊異黃酮中、高劑量組骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞增殖活性升高（均P＜0.05），細胞周期G0～G1 期縮短（P＜0.05），而S 期延長，并呈劑量依賴性（P＜0.05），G2～M 期無明顯變化（均P＞0.05）。與對照組比較，陽性對照組骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞增殖活性升高（P＜0.05），細胞周期G0～G1期縮短（P＜0.05），而S 期延長（P＜0.05），G2～M 期無明顯變化（P＞0.05）。與陽性對照組比較，毛蕊異黃酮高劑量組骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞增殖活性及細胞周期均無明顯變化（均P＞0.05），見表1。

圖1 不同傳代的OA軟骨細胞形態(tài)學變化（×200）

表1 毛蕊異黃酮對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞細胞細胞增殖活性和細胞周期的影響，n=3

表1 毛蕊異黃酮對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞細胞細胞增殖活性和細胞周期的影響，n=3

與對照組相比，*P＜0.05；與毛蕊異黃酮低劑量組相比，#P＜0.05；與毛蕊異黃酮中劑量組相比，&P＜0.05。

2.2 毛蕊異黃酮對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞凋亡的影響

與對照組比較，毛蕊異黃酮中、高劑量組骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞凋亡率和Bax蛋白表達降低，而Bcl-2蛋白表達升高（均P＜0.05），并呈一定劑量依賴性。與對照組比較，陽性對照組骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞凋亡率和Bax 蛋白表達降低（均P＜0.05），而Bcl-2蛋白表達升高（均P＜0.05）。與陽性對照組比較，毛蕊異黃酮高劑量組骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞凋亡率及細胞中Bax和Bcl-2蛋白表達均無明顯變化（均P＞0.05），見圖2、圖3和表2。

圖2 毛蕊異黃酮對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞凋亡的影響

圖3 毛蕊異黃酮對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞中Bax、Bcl-2蛋白表達的影響

表2 毛蕊異黃酮對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞凋亡及凋亡蛋白Bax、Bcl-2表達的影響，n=3

表2 毛蕊異黃酮對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞凋亡及凋亡蛋白Bax、Bcl-2表達的影響，n=3

與對照組相比，*P＜0.05；與毛蕊異黃酮低劑量組相比，#P＜0.05；與毛蕊異黃酮中劑量組相比，&P＜0.05。

2.3 毛蕊異黃酮對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞中miR-502-5p表達的影響

與對照組比較，毛蕊異黃酮中、高劑量組骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞中miR-502-5p 表達升高（P＜0.05），并呈劑量依賴的趨勢。與對照組比較，陽性對照組骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞中miR-502-5p 表達升高（P＜0.05）。與陽性對照組比較，毛蕊異黃酮高劑量組組骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞中miR-502-5p 表達無顯著變化（P＞0.05），見表3。

表3 毛蕊異黃酮對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞中miR-502-5p 表達的影響，n=3

表3 毛蕊異黃酮對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞中miR-502-5p 表達的影響，n=3

與對照組相比，*P＜0.05；與毛蕊異黃酮低劑量組相比，#P＜0.05；與毛蕊異黃酮中劑量組相比，&P＜0.05。

2.4 下調(diào)miR-502-5p 對毛蕊異黃酮處理的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞增殖的影響

與毛蕊異黃酮高劑量+anti-miR-NC 組比較，毛蕊異黃酮高劑量+anti-miR-502-5p 組骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞增殖活性降低（P＜0.05），細胞周期G0～G1 期延長（P＜0.05），而S 期縮短（P＜0.05），G2～M 期無顯著變化（P＞0.05），見表4。

表4 下調(diào)miR-502-5p對毛蕊異黃酮處理的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞增殖的影響，n=3

表4 下調(diào)miR-502-5p對毛蕊異黃酮處理的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞增殖的影響，n=3

與毛蕊異黃酮高劑量+anti-miR-NC組相比，*P＜0.05。

2.5 下調(diào)miR-502-5p 對毛蕊異黃酮處理的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞凋亡的影響

與毛蕊異黃酮高劑量+anti-miR-NC 組比較，毛蕊異黃酮高劑量+anti-miR-502-5p 組骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞凋亡率和Bax 蛋白表達升高（均P＜0.05），而Bcl-2蛋白表達降低（P＜0.05），見圖4、圖5和表5。

圖4 下調(diào)miR-502-5p 對毛蕊異黃酮處理的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞凋亡的影響

圖5 下調(diào)miR-502-5p 對毛蕊異黃酮處理的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞Bax和Bcl-2蛋白表達的影響

表5 下調(diào)miR-502-5p對毛蕊異黃酮處理的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞凋亡及Bax和Bcl-2蛋白表達的影響，n=3

表5 下調(diào)miR-502-5p對毛蕊異黃酮處理的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞凋亡及Bax和Bcl-2蛋白表達的影響，n=3

與毛蕊異黃酮高劑量+anti-miR-NC組相比，*P＜0.05。

3 討論

軟骨細胞是關(guān)節(jié)軟骨中的唯一細胞，參與維持軟骨組織結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定。骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨細胞過度凋亡，進而引發(fā)軟骨基質(zhì)減少，抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞細胞凋亡是骨關(guān)節(jié)炎治療的途徑之一。毛蕊異黃酮為中藥黃芪的主要活性成分之一，具有多種藥理活性。研究顯示，毛蕊異黃酮可提高缺氧缺糖/復氧復糖誘導的心肌細胞活力，并抑制細胞凋亡，減輕細胞損傷[8]；毛蕊異黃酮可能通過提高內(nèi)源抗氧化酶T-SOD 和GSH-Px 活性、降低脂質(zhì)過氧化損傷及腦組織AchE活性來改善D-半乳糖致衰老小鼠的學習記憶能力[9]；毛蕊異黃酮可能通過激活Nrf2 信號通路緩解了大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦水腫和血腦屏障破壞，減輕了神經(jīng)炎癥反應(yīng)和細胞凋亡[10]。

本研究顯示，毛蕊異黃酮可提高骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞增殖活性，阻滯了其細胞周期進程，降低了細胞凋亡率，并具有一定的劑量依賴性（P＜0.05），說明毛蕊異黃酮可促進骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞增殖，且抑制軟骨細胞凋亡。細胞凋亡是一種受多種分子調(diào)控的程序性死亡過程。Bax 和Bcl-2 參與調(diào)控細胞凋亡，其中Bax為促凋亡蛋白，其表達增加時形成同源二聚體，引起線粒體膜通透性改變，細胞色素C釋放量增加，進而激活caspases級聯(lián)反應(yīng)，誘導細胞凋亡[11]。而Bcl-2是一種抗凋亡分子，其表達增加時則與Bax 形成異源二聚體，減弱Bax 的促凋亡作用。本研究顯示，一定劑量的毛蕊異黃酮可抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞中Bax的蛋白表達，而促進了Bcl-2蛋白表達（P＜0.05），進一步說明毛蕊異黃酮抑制了骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞凋亡，具有治療骨關(guān)節(jié)炎的作用。

骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病率呈增長趨勢，探究其發(fā)病機制對治療藥物的研發(fā)具有重要現(xiàn)實意義。研究顯示，真核生物中存在大量miRNA，這些miRNA 參與調(diào)控細胞增殖和凋亡等生命活動，可作為包括骨關(guān)節(jié)炎在內(nèi)的多種疾病的治療靶點[12-14]。研究已表明，多種miRNA在骨關(guān)節(jié)炎中異常表達，在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展中起重要作用。例如，miR-145 在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞中呈低表達，上調(diào)其表達可靶向抑制BNIP3和調(diào)節(jié)Notch信號通路來減少骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞凋亡[15]；骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織和細胞中miR-124呈低表達，上調(diào)其表達可抑制軟骨細胞凋亡[16]。miR-502-5p 在滑膜組織中的表達與滑膜增生及炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，通絡(luò)止痛凝膠制劑可能通過調(diào)控miR-502-5p 等基因的表達減輕膝骨關(guān)節(jié)炎滑膜增生及炎癥反應(yīng)[17]。本研究顯示，毛蕊異黃酮可上調(diào)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞中miR-502-5p 的表達，而下調(diào)miR-502-5p 則逆轉(zhuǎn)了毛蕊異黃酮對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞增殖的促進作用及抑制凋亡作用，提示毛蕊異黃酮可能通過上調(diào)miR-502-5p 表達來影響骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞增殖和凋亡。

綜上，毛蕊異黃酮可增強骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞的增殖能力，并減少細胞凋亡，具有治療骨關(guān)節(jié)炎的潛在價值，其作用機制可能與上調(diào)細胞中miR-502-5p表達有關(guān)。