梁波，林家煜

福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院內(nèi)分泌科，福建泉州 362000

脛前皮膚黑斑在糖尿病中的臨床發(fā)病率可高達(dá)24.78%[1]， 也有因脛前黑斑就診才首次發(fā)現(xiàn)糖尿病的患者，皮膚黑斑通常密集或散在對稱分布，一般呈斑點(diǎn)狀，或融合成片狀，棕褐色居多，部分暗紅或褐黑色，顏色深淺不一。 一般與皮膚表面相平，可低于皮膚表面，黑斑周圍皮膚可有萎縮性損害，外傷或搔抓后可出現(xiàn)淺表性潰瘍，也可出現(xiàn)自發(fā)性潰瘍。

隨著對糖尿病慢性并發(fā)癥深入研究，除了褪黑素減少、ACTH 水平升高以及下肢中小動(dòng)脈粥樣硬化的原因[2-4]，近些年的研究熱點(diǎn)如氧化應(yīng)激、持續(xù)低度炎癥發(fā)現(xiàn)也與糖尿病皮膚損害有關(guān)。2 型糖尿病患者也存在細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)異常[5]，研究發(fā)現(xiàn)，Th17/Treg 平衡失衡與糖尿病發(fā)病密切相關(guān)[6-7]，Th17/Treg 平衡是否與2型糖尿病患者脛前黑斑及其他慢性并發(fā)癥發(fā)生相關(guān)，國內(nèi)外研究較少。 該研究于2017 年1 月—2020 年12月擬研究Th17/Treg 在2 型糖尿病脛前黑斑患者中的表達(dá)情況，以探討免疫異常在糖尿病脛前黑斑患者發(fā)病的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集于該院住院的18～65 歲（避免老年性皮膚色素沉著干擾）2 型糖尿病患者病例，納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合1999年WHO2 型糖尿病（T2DM）診斷標(biāo)準(zhǔn)；②無急性嚴(yán)重代謝紊亂如酮癥酸中毒、高滲狀態(tài)；③肝腎功能正常，無心臟疾病史、無高血壓病史；④無自身免疫性疾病，無各種感染、腫瘤，未使用免疫抑制或增強(qiáng)劑。 正常對照組來源于該院健康體檢人員，納入標(biāo)準(zhǔn)：①糖耐量正常；②無心肝腎等疾病；③無影響糖代謝的相關(guān)疾病及急性應(yīng)激性疾??；④無自身免疫性疾病及相關(guān)的家族史；⑤無脛前黑斑；⑥年齡、性別與T2DM 組相匹配。

將T2DM 組按照脛前皮膚有無萎縮性色素沉著斑分為有斑組與無斑組。 黑斑判斷標(biāo)準(zhǔn)：絕大部分呈對稱或不對稱分布在膝關(guān)節(jié)以下脛前皮膚表面，呈密集或散在分布，5 點(diǎn)或5 點(diǎn)以上，形狀呈斑點(diǎn)狀或小片狀，顏色棕褐色或棕黑色，且斑點(diǎn)周圍有萎縮性皮損。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 ①一般資料：性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)[BMI=體質(zhì)量（kg）/身高的平方（m2）]、糖尿病病程、血壓（高血壓患者不入組，高血壓：有高血壓病史或兩次非同日血壓≥140/80 mmHg）。②生化指標(biāo)：糖化血紅蛋白（HbA1c）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）。③微血管病變：眼底檢查評估患者是否存在糖尿病視網(wǎng)膜病變；尿微量白蛋白/肌酐比值＞30 mg/g 評估患者是否存在糖尿病腎損害；神經(jīng)傳導(dǎo)速度測定評估糖尿病周圍神經(jīng)病。 ④下肢動(dòng)脈血管彩超，評估下肢動(dòng)脈粥樣硬化情況。⑤糖尿病足：按Wargner 分期進(jìn)行評估。⑥均留取血樣，以用于體外實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 標(biāo)本采集與保存 采集受試對象的空腹靜脈血10 mL，選取4 mL 全血置入不加抗凝劑管，自然凝血后，離心10 min，分離血清。 選取6 mL 全血置入肝素抗凝管，在30 min 內(nèi)采用Ficoll 淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法分標(biāo)本中的外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）；收集分裝后，均置－80℃冰箱保存。

1.2.3 主要試劑和儀器 流式細(xì)胞儀（FACS Calibur and Cell Quest Pro 型），小鼠抗人 CD25、CD4、Foxp3 及 IL-17A單克隆熒光抗體；莫能菌素、離子霉素和氟波酯。 人IL-17、IL-22 和 IL-10、TGF-β 的 ELISA 檢測試劑盒；Multiskcan FC 酶標(biāo)儀。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測 Th17/Treg 細(xì)胞 （1）Th17 細(xì)胞檢測：①將PBMC 用常溫PBS 洗滌1 次，細(xì)胞計(jì)數(shù)濃度至 2×106/mL。 ②提取 100 μl PBMC 細(xì)胞懸液，加入莫能菌素（500 ng/mL）、離子霉素（1 μM）以及氟波酯（50 ng/mL）。 ③移入 24 孔板孵育 5 h，PBS 洗滌 1 次。④加入FITC 標(biāo)記的小鼠抗人CD4+單抗，4℃下孵育15 min，避光。⑤加入破膜劑孵育15 min。⑥加PE 標(biāo)記的小鼠抗人IL-17A 單抗，4℃孵育15 min，避光。⑦PBS洗滌1 次，重懸細(xì)胞。 ⑧0.5%多聚甲醛固定后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測CD4+/IL-17A+細(xì)胞的比例。

（2）Treg 細(xì)胞檢測：①將 PBMC 用常溫 PBS 洗滌 1次，細(xì)胞計(jì)數(shù)濃度至 2×106/mL。 ②提取 100 μl PBMC細(xì)胞懸液，加入FITC 標(biāo)記的小鼠抗人CD4 單抗和Per CP標(biāo)記的小鼠抗人CD25 單抗，4℃下孵育15 min，避光。③加入破膜劑孵育15 min。 ④加PE 標(biāo)記的小鼠抗人Foxp3 單抗，4℃孵育 15 min，避光。 ⑤PBS 洗滌 1 次，重懸細(xì)胞。 ⑥0.5%多聚甲醛固定后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測CD4+/CD25/Fox P 3+細(xì)胞的比例

1.2.5 ELISA （Enzyme linked immunosorbent assay，酶聯(lián)免疫吸附測定） 測定血 IL-17、IL-22、IL-10、TGF-β 表達(dá) ①按試劑盒說明書配置標(biāo)準(zhǔn)品工作液濃度梯度由于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。②取試劑盒里的96 孔板，每孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100 μl，37℃孵育90 min。③標(biāo)記抗體孵育：每個(gè)孔加入生物素化抗體工作液100 μl，37℃孵育60 min。④每孔加入洗滌液350 μl 洗滌3 次。⑤每孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素工作液100 μl，37℃孵育30 min，洗滌5 次。⑥每孔加入底物溶液（TMB）90 μl，37℃避光孵育 15 min 顯色。⑦每孔加終止液 50 μl，終止反應(yīng)，在反應(yīng)終止5 min 內(nèi)，用酶標(biāo)儀在450 nm 波長測量各孔的光密度（OD 值）。 ⑧以標(biāo)準(zhǔn)品濃度與OD值的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出直線回歸方程式，通過待測樣品的 OD 值， 計(jì)算出樣品的濃度， 乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。 進(jìn)一步比較。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各組數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)。正態(tài)分布的計(jì)量資料以（）表示，兩組間比較進(jìn)行t 檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)和四分位間距表示，兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和百分比（%）表示，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。 所有檢驗(yàn)方法均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組受檢者人口學(xué)資料分析

收集糖尿病患者167 例，男 103 例，女64 例；伴脛前黑斑患者83 例，其中糖尿病足患者36 例，無脛前黑斑患者84 例，其中糖尿病足12 例。 正常對照組80 名。

病程都＞3 年，年齡＞35 歲，但 35～50 歲的黑斑發(fā)病率與50～65 歲相當(dāng)，提示糖尿病患者黑斑發(fā)生與年齡增加無關(guān)。糖尿病伴脛前黑斑組BMI 明顯低于無伴脛前黑斑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示糖尿病患者脛前黑斑發(fā)生可能與BMI 下降相關(guān)，見表1。

表1 3 組受檢者臨床資料比較

2.2 3 組受檢者生化指標(biāo)比較

入組病例均排除肝腎功能電解質(zhì)異?；颊?，因此該研究比較患者的血糖控制水平（糖化血紅蛋白）和血脂水平的差異，評估血糖血脂對脛前黑斑發(fā)生的影響，結(jié)果顯示兩組患者 HbA1C、TG、TC、HDL-C、LDL-C 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表 1。

2.3 各組患者并發(fā)癥情況比較

與無伴脛前黑斑組相比，伴脛前黑斑組糖尿病患者，糖尿病視網(wǎng)膜病變、尿ACR 升高及糖尿病足的發(fā)生率較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但周圍神經(jīng)損害、下肢動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示糖尿病患者黑斑發(fā)生可能與微血管病變及糖尿病足發(fā)生有關(guān)，見表1。

2.4 3 組受檢者外周血Th17 細(xì)胞和Treg 細(xì)胞表達(dá)情況

糖尿病患者伴和不伴脛前黑斑組外周血中Th17 細(xì)胞比例均高于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），糖尿病伴脛前黑斑患者組和無脛前黑斑患者組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；伴和不伴脛前黑斑的糖尿病患者外周血中Treg 細(xì)胞比例均低于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且伴脛前黑斑糖尿病患者組外周血Treg 細(xì)胞比例低于無脛前黑斑糖尿病患者組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖 1、表 2。

圖1 各組受檢者外周血Th17 和Treg 細(xì)胞比例流式圖

表2 3 組受檢者外周血 Th17 和 Treg 細(xì)胞比例對比[（），%]

表2 3 組受檢者外周血 Th17 和 Treg 細(xì)胞比例對比[（），%]

注：*代表與正常對照組對比，P＜0.05；#代表與糖尿病無脛前黑斑組對比，P＜0.05

組別Th17 Treg糖尿病伴脛前黑斑組（n=83）糖尿病無脛前黑斑組（n=84）正常對照組（n=80）（3.73±0.36）*（3.98±0.19）*1.68±0.43（3.68±0.24）*#（4.85±0.15）*6.76±0.32

2.5 3 組受檢者血細(xì)胞因子表達(dá)情況比較

糖尿病患者伴和不伴脛前黑斑組受檢者外周血中IL-17 的水平高于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），糖尿病伴脛前黑斑患者組和糖尿病無脛前黑斑患者組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與正常組對比，兩組受檢者 IL-22 水平有升高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；②糖尿病患者伴和不伴脛前黑斑組受檢者外周血中TGF-β、IL-10 均低于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且糖尿病伴脛前黑斑患者組外周血TGF-β、IL-10 表達(dá)低于糖尿病無脛前黑斑患者組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表 3。

表3 3 組受檢者外周血細(xì)胞因子結(jié)果比較[（），pg/mL]

表3 3 組受檢者外周血細(xì)胞因子結(jié)果比較[（），pg/mL]

注：*代表與正常對照組對比，P＜0.05；#代表與糖尿病無脛前黑斑組對比，P＜0.05

指標(biāo) 糖尿病伴脛前黑斑組（n=83）糖尿病無脛前黑斑組（n=84）正常對照組（n=80）IL-17 IL-22 TGF-β IL-10（45.23±12.68）*31.96±15.15（56.62±18.43）*#（40.75±13.46）*#（40.82±10.71）*29.64±17.15（69.13±17.79）*（53.95±10.58）*27.64±14.13 23.35±12.56 107.12±26.34 84.00±19.12

3 討論

糖尿病患者脛前皮膚色素沉著又稱脛前黑斑，早期研究發(fā)現(xiàn)為局部微循環(huán)障礙所致。 但如今對于經(jīng)前黑斑形成及臨床意義有很多不同的見解?？赡芷つw色素沉著形成的影響因素很多：促進(jìn)黑色素形成激素如前列腺素、性腺激素、腎上腺素分泌增多或抑制黑色素形成激素如甲狀腺激素，褪黑素分泌減少以及體內(nèi)酪氨酸酶氧化與抗氧化之間失衡均能促進(jìn)黑色素的形成從而導(dǎo)致皮膚色素沉著[8-9]。 研究發(fā)現(xiàn)，炎癥因素也是皮膚色素沉著的因素之一，當(dāng)生物刺激或者物理、化學(xué)刺激局部皮膚的情況下，可使皮膚發(fā)生炎癥反應(yīng)。 進(jìn)一步引起粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、前列腺素E2以及IL-8、IL-9 等炎癥因子分泌增加，從而促進(jìn)黑素的轉(zhuǎn)運(yùn)[10-11]。

免疫因素對于糖尿慢性并發(fā)癥的研究逐漸增加，但脛前黑斑的相關(guān)研究國內(nèi)外均涉及較少，邱明才等[12]研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病脛前黑斑患者同時(shí)進(jìn)行皮損局部活檢及腎臟病理檢查發(fā)現(xiàn)大量免疫復(fù)合物沉積， 如IgG、IgA、IgM、C1、C1q、FRA。 故免疫反應(yīng)參與了糖尿病脛前黑斑以及腎臟病變的發(fā)生及發(fā)展，但具體機(jī)制仍有待深入研究。 Th17 細(xì)胞是近些年研究發(fā)現(xiàn)的CD4+T 淋巴細(xì)胞的新亞群，IL-6 和轉(zhuǎn)化生長因子-β 聯(lián)合作用可以誘導(dǎo)初始T 淋巴細(xì)胞分化成Th17 細(xì)胞，Th17 細(xì)胞可以分泌IL-17、IL-21 及IL-22 等炎癥因子，參與炎癥反應(yīng)和自身免疫病的發(fā)生發(fā)展[13-14]，Treg 細(xì)胞可分泌IL-10 或通過細(xì)胞接觸機(jī)制（CTLA-4 和GITR），調(diào)節(jié)和抑制免疫反應(yīng)，其表達(dá)異常與糖尿病的發(fā)生密切相關(guān)[15-16]。 Th17與Treg 兩者形成一個(gè)相互補(bǔ)充相互制約的平衡關(guān)系，在疾病狀態(tài)，這種平衡則被打破[17]。 Th1、Th2、Th17、Treg細(xì)胞所致不同優(yōu)勢免疫應(yīng)答與疾病的發(fā)生、發(fā)展及其預(yù)后有關(guān)。 Saltiykov BB 等[18]對糖尿病患者股部進(jìn)行皮膚活檢發(fā)現(xiàn)，患者皮膚的毛細(xì)血管壁有IgG、IgM 以及補(bǔ)體的附著。 因此，免疫復(fù)合物的堆積可能引起血管內(nèi)皮損傷并誘導(dǎo)炎癥從而引起微血栓形成,從而導(dǎo)致皮膚微循環(huán)障礙，但具體的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

該研究通過收集糖尿病并發(fā)脛前黑斑患者的臨床資料，并取血液標(biāo)本進(jìn)行免疫細(xì)胞Th17 和Treg 細(xì)胞比例測定和相應(yīng)的細(xì)胞因子測定，從而與糖尿病無并發(fā)脛前黑斑患者及正常對照組受檢者進(jìn)行對比，探討糖尿病患者并脛前黑斑是否與其他慢性并發(fā)癥相關(guān)，并且是否與免疫功能異常相關(guān)。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與糖尿病無脛前黑斑患者對比，糖尿病并脛前黑斑患者血糖水平、血脂水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但 BMI 明顯下降，提示體質(zhì)量可能是局部皮膚的保護(hù)因素，是否與局部皮下脂肪量有關(guān)仍需要進(jìn)一步探究。與糖尿病無脛前黑斑患者對比，糖尿病并脛前黑斑患者視網(wǎng)膜病變和尿微量白蛋白的發(fā)生率升高，提示糖尿病并脛前黑斑患者微血管并發(fā)癥發(fā)生率升高，因此，出現(xiàn)脛前黑斑的糖尿病患者應(yīng)注意排查糖尿病眼底病變、腎臟病變等微血管并發(fā)癥。 局部皮膚的缺血缺氧容易導(dǎo)致色素沉著，由此推測皮膚的微血管病變可能與脛前黑斑發(fā)生相關(guān)。 并且結(jié)果也顯示，糖尿病并脛前黑斑患者糖尿病足的發(fā)生率也明顯升高，可能也與局部皮膚病變相關(guān)。

為進(jìn)一步探索糖尿病局部皮膚病變的發(fā)病機(jī)制，該研究從免疫功能入手，探究脛前黑斑發(fā)病是否與免疫功能失衡有關(guān)，結(jié)果顯示，與正常對照組對比，糖尿病患者Th17 細(xì)胞比例、IL-17 水平上升，Treg 細(xì)胞比例、TGF-β 水平、IL-10 水平下降，與糖尿病無脛前黑斑患者對比，糖尿病并脛前黑斑患者Treg 細(xì)胞比例、TGF-β 水平、IL-10 水平進(jìn)一步下降。 提示糖尿病患者發(fā)病可能與免疫細(xì)胞Th17/Treg 比例失衡有關(guān)。 Th17 是促炎細(xì)胞，而Treg 是調(diào)節(jié)免疫炎癥的細(xì)胞，與糖尿病無脛前黑斑患者對比，糖尿病并脛前黑斑患者Treg 細(xì)胞進(jìn)一步下降，因此考慮脛前黑斑患者可能與TGF-β 水平、IL-10水平下降從而導(dǎo)致局部免疫功能紊亂致免疫炎癥發(fā)生有關(guān)。

綜上所述，合并脛前黑斑糖尿病患者易發(fā)生眼底病變、腎臟病變，并與糖尿足發(fā)病率升高相關(guān)，這可能與脛前黑變患者免疫細(xì)胞Th17/Treg 比例失衡導(dǎo)致TGF-β 水平、IL-10 水平下降有關(guān)。 該研究有很多不足之處，入組病例尚不完整，仍需要進(jìn)一步收集病例資料。 由于涉及倫理問題，沒有收集局部脛前黑斑的組織，無法進(jìn)行局部指標(biāo)的檢測，進(jìn)一步對機(jī)制進(jìn)行研究和探討。 對于細(xì)胞因子的表達(dá)是否與脛前黑斑的發(fā)生呈因果關(guān)系仍需要進(jìn)一步的分子機(jī)制研究才能明確。