黃永健，黎穎怡，陳心怡，謝恩義

（廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088）

甘露醇是一種六碳線型多元醇，為白色粉末結(jié)晶，其分子式為C6H14O6，分子量182.17[1]。甘露醇是一種重要的精細(xì)化工產(chǎn)品，在食品、醫(yī)藥和化工等行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用[2-4]。甘露醇是食品和藥物管理局允許使用的一種食品添加劑，人體吸收慢，可制作適合糖尿病人、肥胖病人食用的低熱值、低糖的產(chǎn)品[5-8]。此外，它可作為無糖口香糖增塑劑、自由基清除劑和藥物賦形劑[9-11]；因其滲透性高，也可作為利尿劑[12]。甘露醇存在于許多植物中，包括南瓜、芹菜、洋蔥、橄欖等，也可以由細(xì)菌、酵母、真菌、地衣和藻類等微生物產(chǎn)生[6]，特別是在褐色海藻中均有存在，且提取效果明顯[2]。目前，國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)甘露醇的方法主要為萃取法、化學(xué)合成法、發(fā)酵法和酶法等[6]。利用海藻提取的方法是我國(guó)生產(chǎn)甘露醇的主要方法[13]。目前世界甘露醇年產(chǎn)量與年總需求量不平衡，隨著甘露醇應(yīng)用領(lǐng)域的不斷拓寬，甘露醇的需求量仍然會(huì)有較大的增長(zhǎng)，發(fā)展前景樂觀[14]。

張氏馬尾藻（Sargassum zhangii）是我國(guó)亞熱帶沿海特有種類，主要分布于雷州半島等，屬于褐藻門，圓子綱，墨角藻目，馬尾藻科，馬尾藻屬，是一種大型經(jīng)濟(jì)褐藻[15]。目前利用海帶提取甘露醇的研究較多，但利用馬尾藻提取甘露醇的研究鮮有報(bào)道。本文對(duì)張氏馬尾藻中的甘露醇提取工藝進(jìn)行了初步研究?？疾旖釙r(shí)間、浸提溫度和料液比3個(gè)因素對(duì)張氏馬尾藻甘露醇提取量的影響，再根據(jù)正交試驗(yàn)優(yōu)化得到最佳組合條件，旨在為張氏馬尾藻甘露醇的工業(yè)化制備提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

張氏馬尾藻（Sargassum zhangii）：2019年 9月下旬采集于廣東省湛江市徐聞縣南山鎮(zhèn)二墩，曬干后備用。

D-甘露醇、L-鼠李糖、乙酸銨、乙酰丙酮（均為分析純）：上海源葉生物科技有限公司；高碘酸鈉、冰醋酸（均為分析純）：生工生物工程（上海）股份有限公司；濃鹽酸（優(yōu)級(jí)純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 。

1.2 儀器與設(shè)備

FW100高速萬能粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；DHG-9245A電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；AUY220電子天平（精度0.000 1 g）：日本島津公司；DK-8D電熱恒溫水槽：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；RJ-LDL-50A低速立式大容量離心機(jī)：無錫瑞江分析儀器有限公司；UV754紫外可見分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 甘露醇水浴提取工藝流程

張氏馬尾藻→烘干研磨至粉末狀→水浴浸提→離心（5 000 r/min，15 min）→準(zhǔn)確吸取1 mL上清液按標(biāo)準(zhǔn)曲線操作方法配制、加入試劑→測(cè)吸光度→計(jì)算甘露醇含量。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

D-甘露醇標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.100 mg/mL）：準(zhǔn)確稱取D-甘露醇標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用純水定容至100 mL即得。

Nash試劑：75.000 0 g乙酸銨、1 mL冰醋酸、1 mL乙酰丙酮混合，加純水定容至500 mL即得。

取適量標(biāo)準(zhǔn)溶液分別稀釋至 0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg/mL，備用。各移取1 mL上述稀釋溶液分別置于具塞試管中；分別向各試管加入1 mL 15.10 mmol/L高碘酸鈉溶液，混勻后室溫25℃下靜置10 min；各加入2 mL 0.1%L-鼠李糖溶液，混勻；依次加入4 mL新配制的Nash試劑，混勻后于53℃恒溫水浴中加熱15min使其顯色，放置冷卻至室溫25℃；以純水作為空白對(duì)照，在413 nm處測(cè)量D-甘露醇的吸光度（OD413）[16-17]。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

1.3.3.1 浸提溫度對(duì)張氏馬尾藻甘露醇提取量的影響

準(zhǔn)確稱取0.500 0 g張氏馬尾藻藻粉，按料液比1∶100（g/mL）加入 50 mL 純水，分別置于 50、60、70、80、90、100℃下水浴回流提取2 h后，5 000 r/min離心15 min，取上清液1 mL測(cè)量吸光度，考察浸提溫度對(duì)張氏馬尾藻甘露醇提取量的影響，共6個(gè)組別，每組重復(fù)試驗(yàn)3次。

1.3.3.2 料液比對(duì)張氏馬尾藻甘露醇提取量的影響

準(zhǔn)確稱取0.500 0 g張氏馬尾藻藻粉，加入純水使料液比分別為 1∶60、1∶70、1∶80、1∶90、1∶100、1∶110（g/mL），浸提時(shí)間設(shè)為2 h，浸提溫度設(shè)為100℃，研究料液比對(duì)張氏馬尾藻甘露醇提取量的影響，共6個(gè)組別，每組重復(fù)試驗(yàn)3次。

1.3.3.3 浸提時(shí)間對(duì)張氏馬尾藻甘露醇提取量的影響

準(zhǔn)確稱取0.500 0 g張氏馬尾藻藻粉，按料液比1∶100（g/mL）加入 50 mL 純水，在 100℃下水浴回流提取 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h，考察浸提時(shí)間對(duì)張氏馬尾藻甘露醇提取量的影響，共6個(gè)組別，每組重復(fù)試驗(yàn)3次。

1.3.4 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果所確定的因素與水平，分別進(jìn)行張氏馬尾藻甘露醇提取工藝的L9（34）正交試驗(yàn)[18]，最終確定其最佳提取組合工藝條件。正交試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 因素水平Table 1 Factors and levels

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS25和Excel 2010進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 D-甘露醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

D-甘露醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 D-甘露醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of D-mannitol

由圖1可知，D-甘露醇標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=72.846x-0.7432，R2=0.9990。式中：y為D-甘露醇質(zhì)量濃度，mg/L；x為吸光度（OD413）。該D-甘露醇標(biāo)準(zhǔn)曲線具有很好的線性關(guān)系。

2.2 張氏馬尾藻甘露醇提取的單因素試驗(yàn)

2.2.1 浸提溫度對(duì)張氏馬尾藻甘露醇提取量的影響

浸提溫度對(duì)張氏馬尾藻甘露醇提取量的影響見圖2。

圖2 不同浸提溫度對(duì)張氏馬尾藻甘露醇提取量的影響Fig.2 Effects of different extracting temperature on extraction content of mannitol from Sargassum zhangii

由圖2可知，從整體趨勢(shì)上看，隨著浸提溫度的上升，甘露醇的提取量隨之增大，這是由甘露醇本身的物理特性所決定的，其溶解度在一定范圍內(nèi)會(huì)隨著溫度的升高而增大。由于水浴提取法的加熱溫度最高只能達(dá)到100℃，基于實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備條件，甘露醇浸提溫度選取為80、90、100℃。

2.2.2 料液比對(duì)張氏馬尾藻甘露醇提取量的影響

料液比對(duì)張氏馬尾藻甘露醇提取量的影響見圖3。

圖3 不同料液比對(duì)張氏馬尾藻甘露醇提取量的影響Fig.3 Effects of different solid-liquid ratio on extraction content of mannitol from Sargassum zhangii

由圖 3 可知，當(dāng)料液比從 1∶60（g/mL）至 1∶100（g/mL）遞變，甘露醇的提取量逐漸增加；當(dāng)料液比達(dá)到 1∶100（g/mL），甘露醇提取量達(dá)到最大；但當(dāng)料液比達(dá)到1∶110（g/mL）時(shí)，甘露醇提取量反而下降。因此，張氏馬尾藻甘露醇提取的料液比選取為1∶90、1∶100、1∶110（g/mL）。

2.2.3 浸提時(shí)間對(duì)張氏馬尾藻甘露醇提取量的影響

浸提時(shí)間對(duì)張氏馬尾藻甘露醇提取量的影響見圖4。

圖4 不同浸提時(shí)間對(duì)張氏馬尾藻甘露醇提取量的影響Fig.4 Effects of different extracting time on extraction content of mannitol from Sargassum zhangii

由圖4可知，浸提時(shí)間在1.0 h～2.0 h時(shí)，浸提時(shí)間越長(zhǎng)，甘露醇提取量越大，這可能是因?yàn)殡S著回流時(shí)間的加長(zhǎng)使得甘露醇充分溶解于溶劑中；當(dāng)浸提時(shí)間為2.0 h時(shí)，甘露醇提取量達(dá)到峰值；然而當(dāng)浸提時(shí)間超過2.0 h，提取量開始下降。因此，張氏馬尾藻甘露醇的浸提時(shí)間選取為1.5、2.0、2.5 h。

2.3 張氏馬尾藻甘露醇提取的正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)所得的結(jié)果，以浸提溫度、浸提時(shí)間、料液比這3個(gè)單因素為考察因素，各取3個(gè)水平，進(jìn)行L9（34）的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以確定張氏馬尾藻甘露醇的最佳提取條件，以甘露醇提取量為評(píng)價(jià)指標(biāo)。正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 張氏馬尾藻甘露醇提取的正交試驗(yàn)方案與結(jié)果Table 2 The orthogonal test scheme and results of mannitol extraction from Sargassum zhangii

由表2可知，A、B、C因素的極差分別為 0.368、0.026、0.215，表明本試驗(yàn)中，浸提溫度對(duì)張氏馬尾藻甘露醇提取量的影響最大，其次為料液比，浸提時(shí)間影響最小。張氏馬尾藻甘露醇提取的最佳水平組合為A3B2C2，即最佳工藝條件為浸提溫度100℃、料液比1∶100（g/mL）、浸提時(shí)間 2.0 h。經(jīng) 3 組驗(yàn)證試驗(yàn)，在上述最佳組合條件下，張氏馬尾藻甘露醇的平均提取量為5.636 mg/g，高于正交試驗(yàn)各組合，由此證明該正交試驗(yàn)的實(shí)際最佳水平組合與理論最佳水平組合一致。

3 結(jié)論

研究采用水浴浸提法提取張氏馬尾藻中的甘露醇，結(jié)果表明對(duì)提取效果影響最大的因素是浸提溫度，其次是料液比，影響最小的是浸提時(shí)間。張氏馬尾藻甘露醇提取的最佳工藝條件為浸提溫度100℃、料液比 1∶100（g/mL）、提取時(shí)間 2.0 h。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)，在最優(yōu)條件下提取的甘露醇平均提取量為5.636 mg/g。試驗(yàn)結(jié)果豐富了利用馬尾藻提取甘露醇的研究，可為以馬尾藻為原料的甘露醇產(chǎn)業(yè)化提供參考。