高志遠(yuǎn) 胡亞亞 韓美坤 張 靜 于翠紅 趙俊梅,2 劉蘭服 焦偉靜 馬志民

(河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所；河北省作物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室1，石家莊 050035) (河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院2，石家莊 050018) (河北省種子總站3，石家莊 050031)

甘薯作為全球種植的主要作物之一，是重要的糧食、飼料、工業(yè)原料及新型能源作物[1]。甘薯營養(yǎng)成分豐富，含有淀粉、蛋白質(zhì)、多酚、維生素、纖維素等，具有營養(yǎng)保健作用[2，3]。多酚是甘薯諸多營養(yǎng)保健成分之一，因其結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)酚羥基而具有良好的抗氧化活性及清除自由基的作用，據(jù)研究報(bào)道甘薯多酚具有明顯的抑菌活性和抗氧化作用[2-7]。另外多酚類化合物還具有抗癌、降血脂、抗衰老等眾多作用，被稱為人類健康的“第七營養(yǎng)素”，因此逐漸成為研究的熱點(diǎn)[8，9]。

多酚含量測定的方法有很多，福林酚比色法因其靈敏度高、穩(wěn)定性好而廣泛應(yīng)用[10-13]，其原理為在堿性溶液中，鎢鉬酸可以將多酚類化合物定量氧化，自身被還原(使W6+變?yōu)閃5+)生成藍(lán)色的化合物，顏色的深淺與多酚含量呈正比[14，15]。目前，已有研究分別用福林酚比色法測定了甘薯不同部位的多酚含量，但均為分光光度計(jì)測定[16-18]。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，酶標(biāo)儀的應(yīng)用越來越廣，它具有效率高、操作簡單的特點(diǎn)，避免了反復(fù)清洗比色杯，同時(shí)減少試劑使用量，節(jié)約成本[19-22]。胡煒等[23]采用酶標(biāo)儀結(jié)合福林酚法測定了葡萄皮的多酚含量。然而，研究報(bào)道的福林酚法測定多酚含量的條件差異較大[24]。

建立甘薯多酚高效測定方法是開展甘薯種質(zhì)及育種后代篩選評價(jià)的基礎(chǔ)，對于高多酚甘薯品種的開發(fā)利用具有重要意義。因此，本研究將酶標(biāo)儀與福林酚法結(jié)合，優(yōu)化反應(yīng)體系和時(shí)間，以建立甘薯多酚測定的高效方法，并對所保藏的甘薯種質(zhì)資源進(jìn)行多酚含量測定，為選育高多酚甘薯品種，更好地開發(fā)利用甘薯種質(zhì)資源提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甘薯：本實(shí)驗(yàn)室保存的甘薯種質(zhì)資源83份。

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品及福林酚試劑；乙醇、碳酸鈉(Na2CO3)均為分析純。

FSJ-A03D1粉碎機(jī)，TG16G臺式高速離心機(jī)，SynergyMx多功能酶標(biāo)儀，96孔板，eppendorf微量移液器。

1.2 方法

1.2.1 試劑配制

沒食子酸母液：取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品10 mg加蒸餾水定容至10 mL棕色容量瓶，質(zhì)量濃度為1 mg/mL，避光存放于-20 ℃冰箱。

沒食子酸工作液：以1 mg/mL沒食子酸母液分別配制質(zhì)量濃度為20、40、60、80、100 μg/mL的沒食子酸工作液。

1.2.2 樣液的制備

參考GB/T 8313—2008[25]方法并有所改進(jìn)，取同品種大小均勻的3個(gè)薯塊，洗凈，晾干，去皮，采用四分法取樣，擦絲，用粉碎機(jī)打碎，分別稱取1.00 g，加70%乙醇溶液2 mL研磨均勻，轉(zhuǎn)入10 mL離心管，用2 mL70%乙醇溶液沖洗研缽2次，將沖洗液均轉(zhuǎn)入10 mL離心管，混勻后立即70 ℃水浴，浸提10 min (隔5 min混勻一次)，浸提后冷卻至室溫，5 000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶，殘?jiān)? mL 70%乙醇溶液提取，重復(fù)以上操作。合并提取液定容至10 mL，混勻，即為樣液。

1.2.3 提取溶劑濃度的確定[26]

配制40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液，參考上述方法，對甘薯塊根多酚進(jìn)行提取，以確定最優(yōu)提取溶劑濃度。

1.2.4 樣品測定條件優(yōu)化[27]

參考GB/T 8313—2008[25]，分別取不同濃度的沒食子酸工作液、蒸餾水(空白對照)及樣液各200 μL于5 mL離心管，各3個(gè)平行，分別加入1 mL 10%福林酚試劑，搖勻，反應(yīng)5 min，加入800 μL 7.5%碳酸鈉溶液搖勻，室溫下避光放置60 min，在96孔板中每孔加入330 μL，在765 nm波長測定吸光度。

1.2.4.1 碳酸鈉溶液濃度的確定

分別配制2.5%、5%、7.5%、10%、15%碳酸鈉溶液，以確定的最適濃度乙醇提取甘薯多酚，按上述方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測定，加入不同濃度的碳酸鈉溶液反應(yīng)，以確定最優(yōu)碳酸鈉溶液濃度。

1.2.4.2 福林酚濃度的確定

分別配制2.5%、5%、10%、15%、20%福林酚溶液，以確定的最適濃度乙醇提取甘薯多酚，按上述方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測定，加入不同濃度的福林酚進(jìn)行反應(yīng)，加入確定濃度的碳酸鈉溶液后，對甘薯多酚含量進(jìn)行測定，以確定最適福林酚濃度。

1.2.4.3 反應(yīng)時(shí)間的確定

按確定的條件反應(yīng)加入碳酸鈉后，每隔10 min測定一次，以確定最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.3 分析方法的評價(jià)[10]

1.3.1 線性范圍的確定

以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，配制質(zhì)量濃度為20、40、60、80、100 μg/mL的沒食子酸工作液。以蒸餾水為空白對照，按確定的條件進(jìn)行測定，以765 nm吸光度為Y軸，以沒食子酸濃度為X軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定線性范圍。

1.3.2 方法重復(fù)性評價(jià)

取5份甘薯樣品，以最佳的乙醇濃度進(jìn)行多酚提取，按確定的最佳條件測定765 nm吸光度，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，以確定實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。

1.3.3 顯色液穩(wěn)定性評價(jià)

以確定的最佳乙醇濃度對甘薯塊根多酚進(jìn)行提取，在確定的最佳條件下測定，反應(yīng)60 min后，在2 h內(nèi)每隔30 min測定一次吸光度，計(jì)算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，以確定顯色液穩(wěn)定性。

1.3.4 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)[28]

分別取3份已知多酚含量的甘薯塊根樣品各1.00 g，分別加入200 μg沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，按上述確定的最佳條件測定多酚含量，計(jì)算沒食子酸標(biāo)品回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，評價(jià)方法的可靠性。

1.3.5 準(zhǔn)確性評價(jià)

選取10份甘薯樣品，同時(shí)按GB/T 8313—2008[25]和優(yōu)化的方法進(jìn)行甘薯多酚含量測定，比較優(yōu)化方法與GB/T 8313—2008方法的差異。

1.4 83份甘薯種質(zhì)多酚含量測定

由于所測甘薯樣品較多，為保證樣品測定條件一致，首先將所有甘薯樣品統(tǒng)一進(jìn)行預(yù)處理，具體做法為：

每個(gè)甘薯品種取大小均勻的3個(gè)薯塊，洗凈，晾干，去皮，采用四分法取樣，擦絲，粉碎機(jī)打碎，分別稱取1.00 g，加70%乙醇溶液2 mL研磨均勻，轉(zhuǎn)入10 mL離心管中，用2 mL 70%乙醇溶液沖洗研缽2次，沖洗液均轉(zhuǎn)入離心管中，-20 ℃保存。

1.5 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS21.0及Excel 2010軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行分析整理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果所得的數(shù)據(jù)表示為平均值±SD。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳提取溶劑濃度的確定

通過設(shè)置不同的提取溶劑濃度，對各濃度下的提取效果進(jìn)行評價(jià)，確定最佳的提取溶劑濃度，其結(jié)果見圖1。

圖1 提取和顯色反應(yīng)條件實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖1可以看出，提取溶劑乙醇體積分?jǐn)?shù)在40%～90%范圍內(nèi)，隨著提取溶劑乙醇濃度的提高，吸光度逐漸增加，到達(dá)70%時(shí)，吸光度值取得最大值，繼續(xù)增加乙醇濃度則吸光度降低，表明用70%乙醇提取甘薯塊根多酚效果最佳。

2.2 碳酸鈉溶液濃度的確定

福林酚試劑與酚類化合物反應(yīng)后在堿性條件下才可顯色，碳酸鈉溶液則為反應(yīng)體系提供堿性環(huán)境，其含量影響著顯色反應(yīng)效果。通過設(shè)置不同的碳酸鈉濃度，根據(jù)顯色效果確定最佳碳酸鈉濃度，結(jié)果如圖1所示。當(dāng)碳酸鈉溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%時(shí)，765 nm處的吸光度最大，因此確定碳酸鈉溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)最佳為5%。

2.3 福林酚溶液濃度的確定

通過設(shè)置不同的福林酚溶液濃度，比較各濃度下的吸光度值，從而確定最佳的福林酚濃度，結(jié)果如圖1所示。以70%乙醇進(jìn)行甘薯塊根多酚的提取，提取液中加入不同濃度的福林酚溶液，再加入確定的最優(yōu)濃度碳酸鈉溶液，進(jìn)行測定，由圖1可以看出，隨著福林酚溶液濃度的增加，吸光度不斷增加，在15%時(shí)，吸光度達(dá)到最大值，之后吸光度降低，表明福林酚的最適體積分?jǐn)?shù)為15%。

2.4 最佳反應(yīng)時(shí)間的確定

按上述優(yōu)化的反應(yīng)條件進(jìn)行測定，每隔10 min測定一次吸光度，比較評價(jià)不同反應(yīng)時(shí)間對甘薯塊根多酚含量測定的影響，結(jié)果見圖1。隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，吸光度不斷增大，到達(dá)60 min后趨于穩(wěn)定，因此確定最優(yōu)反應(yīng)時(shí)間為60 min。

甘薯多酚測定的最佳反應(yīng)條件為：樣液各200 μL，加入1 mL 15%福林酚試劑，搖勻，反應(yīng)5 min，加入800 μL 5% 碳酸鈉溶液，搖勻，室溫下避光放置60 min，在96孔板中每孔加入330 μL，設(shè)定酶標(biāo)儀參數(shù)，在765 nm波長測定吸光度。

2.5 分析方法的評價(jià)

2.5.1 線性范圍的確定

取不同濃度的沒食子酸工作液，以蒸餾水為空白對照，按確定的條件進(jìn)行測定。以765 nm吸光度為Y軸(均減去空白對照值)，以不同沒食子酸濃度為X軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。沒食子酸質(zhì)量濃度在0～100 μg/mL范圍內(nèi)線性良好，回歸線方程為Y=0.009 6X+0.019 7,R2= 0.997 2。

2.5.2 方法的重復(fù)性評價(jià)

取甘薯樣品5份，以最佳的乙醇濃度進(jìn)行多酚提取，按優(yōu)化后的條件對樣品進(jìn)行福林酚法測定，5份樣品測定結(jié)果如表1所示： 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.57%，表明優(yōu)化后的方法的重復(fù)性良好。

表1 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5.3 顯色液穩(wěn)定性評價(jià)

以確定的最佳乙醇濃度對甘薯塊根多酚進(jìn)行提取，采用優(yōu)化后的條件進(jìn)行測定，反應(yīng)60 min后，在2 h內(nèi)每隔30 min測定一次吸光度，測定結(jié)果如表2所示，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.81%，表明顯色液穩(wěn)定性良好。

表2 顯色液穩(wěn)定性結(jié)果

2.5.4 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

按上述優(yōu)化后的條件進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。

表3 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，平均加標(biāo)回收率為98.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.4%，表明該方法準(zhǔn)確可靠，可用于甘薯多酚含量測定。

2.5.5 準(zhǔn)確性評價(jià)

應(yīng)用優(yōu)化的多酚含量測定方法與國標(biāo)法同時(shí)測定10份甘薯樣品多酚含量，評價(jià)新建方法的準(zhǔn)確性，結(jié)果如表4所示。兩種方法測定甘薯多酚含量結(jié)果差異均不顯著，表明優(yōu)化后的方法測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，且具有高效、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)。

表4 優(yōu)化法和國標(biāo)法測定甘薯多酚含量結(jié)果

2.6 83份甘薯種質(zhì)多酚含量測定

應(yīng)用上述優(yōu)化確定的方法，對本實(shí)驗(yàn)室所保藏的83份甘薯種質(zhì)資源進(jìn)行多酚的提取及含量的測定，以篩選出多酚含量較高的品種，測定結(jié)果見表5。

由表5可以看出，所測定甘薯品種塊根中多酚含量范圍在0.22～2.00 mg/g鮮樣之間，其中多酚含量最高的為漯紫薯4號(2.00 mg/g鮮樣)，其次為徐紫薯8號、煙紫薯3號、臨薯15051、冀薯7-20、冀紫薯3號等；不同品種甘薯多酚含量差異較大，且紫肉品種中的多酚含量均高于其他薯肉品種。

進(jìn)一步對所有甘薯樣品的測定結(jié)果進(jìn)行分布頻率統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見圖2。由圖2可以看出，多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于1.5 mg/g的1個(gè)，占總樣品量的1.20%，在1.0～1.5 mg/g之間的3個(gè)，占總樣品量的3.61%，在0.5～1.0 mg/g之間的17個(gè)，占總樣品量的20.48%，在0.4～0.5 mg/g之間的30個(gè)，占總樣品量的36.14%，在0.3～0.4 mg/g之間的30個(gè)，占總樣品量的36.14%，在0.2～0.3 mg/g之間的2個(gè)，占總樣品量的2.41%。

表5 83份甘薯種質(zhì)多酚含量(鮮樣)

圖2 甘薯品種多酚含量頻率分布圖

3 討論

在甘薯多酚測定中，研究報(bào)道的樣品處理方式多采用干燥處理，如曬干、烘干、凍干等[10,29,30]，然而，不同的干燥方式均會對甘薯多酚含量造成一定的影響[31]，本研究直接選擇鮮樣進(jìn)行多酚的提取與測定，降低了多酚損耗；另外在甘薯多酚含量批量檢測中，為防止甘薯樣品中多酚含量在存放期間發(fā)生變化，本研究在測定開始前對待測樣品進(jìn)行統(tǒng)一預(yù)處理：加提取劑研磨后轉(zhuǎn)10 mL離心管于-20 ℃冰箱保存待測。

在提取溶劑的選擇方面，本研究參考前人研究結(jié)果[16,30-33]，選取乙醇作為提取溶劑，并對其濃度進(jìn)行優(yōu)化，通過設(shè)置濃度梯度實(shí)驗(yàn)，確定乙醇體積分?jǐn)?shù)在70%條件下提取效果較好。

目前，國內(nèi)外關(guān)于甘薯多酚含量測定的報(bào)道相對較少，本研究選擇了應(yīng)用較廣泛的福林酚比色法。由于酶標(biāo)儀與分光光度計(jì)原理相似[19]，應(yīng)用96孔板代替比色杯，操作簡單，適宜批量檢測，節(jié)約成本。本研究將福林酚比色法與酶標(biāo)儀相結(jié)合，對試劑濃度和反應(yīng)時(shí)間等測定關(guān)鍵條件進(jìn)行優(yōu)化集成，具有準(zhǔn)確性高，重復(fù)性好，適宜批量測定等優(yōu)點(diǎn)，且在檢測效率上，較國標(biāo)法可提高約3倍。

應(yīng)用本研究所建立的方法對樣品進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同甘薯品種間多酚含量差異較大：在0.22～2.00 mg/g鮮樣之間，張文婷等[31]也報(bào)道了甘薯薯塊鮮樣的多酚含量在0.44～2.16 mg/g之間，本研究所測含量中最高、最低含量均較低?？赡芘c所測品種、生長地點(diǎn)以及測定方法條件不同有關(guān)。陸國權(quán)等[16]研究發(fā)現(xiàn)甘薯多酚含量的基因型差異和環(huán)境效應(yīng)差異顯著。此外，本研究發(fā)現(xiàn)紫肉品種中的多酚含量高于其他品種甘薯，與唐忠厚等[30]和張文婷等[31,34]報(bào)道結(jié)果一致。在所測定品種中多酚含量最高的是漯紫薯4號(2.00 mg/g鮮樣)，因此可對其進(jìn)行進(jìn)一步的開發(fā)利用。

對于甘薯多酚含量的測定，本研究僅對設(shè)定的水平進(jìn)行了單因素實(shí)驗(yàn)，無法考察到未設(shè)定水平對實(shí)驗(yàn)的影響，有必要進(jìn)一步對各因子水平及其交互作用進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化。此外，福林酚法測定的為總多酚含量，今后應(yīng)進(jìn)行更全面、更深入的研究確定甘薯多酚的具體組成成分，以期為甘薯多酚的進(jìn)一步開發(fā)利用提供更全面的依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究確定了甘薯多酚最佳提取溶劑乙醇的體積分?jǐn)?shù)為70%，建立了福林酚法結(jié)合酶標(biāo)儀高效測定甘薯多酚含量的方法，確定最佳測定條件為福林酚體積分?jǐn)?shù)15%，碳酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%，反應(yīng)時(shí)間60 min。本方法平均加標(biāo)回收率為98.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.4%。該方法準(zhǔn)確性高，重復(fù)性好，可高效測定甘薯多酚的含量。對甘薯樣品進(jìn)行測定，其多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.22～2.00 mg/g鮮樣之間，其中紫肉品種甘薯多酚含量較其他品種甘薯的高，開展高多酚品種的培育時(shí)可將紫甘薯作為重點(diǎn)。