梅仁 蔡夢潔 戴蘭 沈文紅 朱明清

噬血細(xì)胞綜合征（HLH）被認(rèn)為是一種淋巴單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)反應(yīng)增生的組織細(xì)胞病，主要是由于殺傷性T細(xì)胞（CTL）及NK細(xì)胞功能缺陷導(dǎo)致抗原清除障礙，刺激巨噬細(xì)胞活化增殖，分泌大量炎癥細(xì)胞因子而導(dǎo)致的一組臨床綜合征[1]。噬血細(xì)胞綜合征主要分為兩種，原發(fā)性（遺傳性）存在明確基因缺陷或家族史，為常染色體隱性遺傳或X連鎖遺傳，常見的基因有PRF1基因；繼發(fā)性可由感染（主要為EB病毒感染）、惡性腫瘤、自身免疫性疾病、藥物、獲得性免疫缺陷（如移植）等多種因素引起[2]。目前診斷主要參照國際組織細(xì)胞協(xié)會2004年修訂標(biāo)準(zhǔn)[3]。HLH的診斷比較復(fù)雜，臨床表現(xiàn)不典型，特異性差，診斷難度大。因此，探求有效診斷方式，及時采取干預(yù)措施以減少預(yù)后風(fēng)險極為重要。研究表明，HLH患者的NK細(xì)胞功能和CTL細(xì)胞功能存在缺陷[4-5]。本文旨在探索NK細(xì)胞功能和CTL細(xì)胞功能在輔助診斷繼發(fā)性噬血細(xì)胞綜合征中的作用，為臨床早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療提供參考依據(jù)。

資料與方法

1 一般資料 選取蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院2018年2月～2021年2月收治的26例繼發(fā)性HLH患者。入選標(biāo)準(zhǔn)：符合國際組織細(xì)胞協(xié)會制定的2004年診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。26例患者男性18例，女性8例，中位年齡45歲。同期選擇17例在我院門診接受體檢的健康者作為對照組，男性12例，女性5例，中位年齡41歲。本研究通過院倫理委員會審批。

2 試劑及儀器 儀器采用Navios流式細(xì)胞儀（Beckman coulter公司），離心機(jī)，渦旋振蕩儀等。單抗：CD3-ECD、CD56-PC7、CD8-APC（Beckman coulter公司）、CD158a-PCP5.5（Invitrogen）、CD158b-FITC（Novus Biologicals）、CD158e-PE（mitengi Biotec）、CD158i-APC（Novus Biologicals）、Perforin-FITC（BD Pharmingen）、GranzymeB-PE（BD Pharmingen），氯化銨溶血劑（QIAGEN公司），破膜劑Intracell（Dako公司）。

3 方法 以EDTA-K2抗凝管采集患者外周血2 mL，1管取100 μL外周血加入CD3，CD56，CD158a，CD158b，CD158e，CD158i抗體各5 μL混勻，室溫避光孵育15 min，溶血劑溶血，加2 mL PBS，1500 rpm離心洗滌5 min，棄上清，加500 μL PBS懸浮，上機(jī)分析。2管取100 μL外周血加CD3，CD56，CD8抗體各5 μL混勻，室溫避光孵育15 min，加固定劑A 100 μL，混勻，室溫避光固定15 min，加2 mL PBS，1 500 r/min離心洗滌5 min，棄上清，震蕩懸浮細(xì)胞，加破膜劑B 100 μL，打孔5 min，加Perforin和Granzyme B抗體各2 μL，混勻，室溫避光孵育15 min，加2 mL PBS，1 500 r/min離心洗滌5 min，棄上清，加500 μL PBS懸浮，上機(jī)分析。

4 統(tǒng)計學(xué)處理 若數(shù)據(jù)為非正態(tài)分布，采用非參數(shù)Mann-Whitney秩和檢驗(yàn)，以四分位數(shù)法表示。若數(shù)據(jù)為正態(tài)分布，則采用T檢驗(yàn)進(jìn)行分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。運(yùn)用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析和繪圖。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 繼發(fā)性 HLH患者淋巴細(xì)胞的比例變化 檢測繼發(fā)性HLH組和對照組淋巴細(xì)胞各組分比例，對照組淋巴細(xì)胞比例為（33.2±1.9）%，T細(xì)胞比例為65.2（54.8，71.1）%，NK細(xì)胞比例為（20.4±2.1）%，CTL細(xì)胞比例為35.2（30.2，37.9）%。而繼發(fā)性HLH組淋巴細(xì)胞比例為（18.4±2.4）%，T細(xì)胞比例為71.6（45.825，80.65）%，NK細(xì)胞比例為（7.7±1.6）%，CTL細(xì)胞比例為45.5（35.275，50.375）%。結(jié)果顯示，與對照組相比，繼發(fā)性HLH組淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞的比例顯著降低（P＜0.000 1，圖1A；P＜0.000 1，圖1B），CTL細(xì)胞比例顯著增高（P=0.005），且具有統(tǒng)計學(xué)差異。但是，繼發(fā)性HLH組和對照組T淋巴細(xì)胞比例無顯著差異（P=0.513）。

圖1 對照組與繼發(fā)性HLH組淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞比例比較

2 NK細(xì)胞KIR以及穿孔素和顆粒酶B表達(dá)情況 由于對照組和繼發(fā)性HLH組NK細(xì)胞具有顯著差異，為進(jìn)一步研究NK細(xì)胞功能在繼發(fā)性HLH中的作用，我們通過流式細(xì)胞術(shù)對兩組NK細(xì)胞的殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體（KIR）以及穿孔素和顆粒酶B的表達(dá)水平進(jìn)行檢測。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，繼發(fā)性HLH組KIR限制性表達(dá)率低于對照組（對照組：0/17，HLH組：7/26，P=0.031 0）。穿孔素和顆粒酶B表達(dá)情況不符合正態(tài)分布，對照組穿孔素四分位數(shù)法比例為96.6（95.1，97.8）%，繼發(fā)性HLH組穿孔素表達(dá)比例為93（67.35，97）%，P=0.016 5；繼發(fā)性HLH組NK細(xì)胞顆粒酶B四分位數(shù)法比例為85（72.125，92.75）%，略高于對照組83.8（80.6，89）%，P=0.871 7，無統(tǒng)計學(xué)意義。

3 CTL細(xì)胞穿孔素和顆粒酶B表達(dá)情況 由于對照組和繼發(fā)性HLH組CTL細(xì)胞具有明顯差異，為進(jìn)一步研究CTL細(xì)胞在繼發(fā)性HLH中的作用，我們通過流式細(xì)胞術(shù)對兩組CTL細(xì)胞穿孔素和顆粒酶B的表達(dá)水平進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，繼發(fā)性HLH組穿孔素比例為（45.34+5.38）%，略高于對照組比例（37.49+5.03）%；繼發(fā)性HLH組顆粒酶B比例為（49.31+5.97）%，略高于對照組比例為（45.18+4.67）%。兩組數(shù)據(jù)比較均無統(tǒng)計學(xué)意義（穿孔素：P=0.3207，圖2C；顆粒酶B：P=0.6219，圖2D）。

圖2 對照組與繼發(fā)性HLH組CTL細(xì)胞穿孔素與顆粒酶B表達(dá)比例比較

討 論

HLH是一種因淋巴細(xì)胞或組織細(xì)胞過度增生引發(fā)無效免疫應(yīng)答，致使多個器官出現(xiàn)高炎癥反應(yīng)的臨床綜合征，可發(fā)生于各個年齡段，病情進(jìn)展迅速，預(yù)后較差。若未及時有效治療，可直接危及生命，病死率相對較高[6]。研究表明，經(jīng)過不同方案治療的成人HLH患者30 d死亡率為20%～44%，總死亡率為50%～75%，腫瘤相關(guān)HLH的預(yù)后相對更差[7-8]。HLH主要特征為全血細(xì)胞減少，持續(xù)發(fā)熱，肝脾腫大，高血清鐵蛋白，高甘油三酯，低纖維蛋白原，并可在骨髓、肝、脾、淋巴結(jié)組織發(fā)現(xiàn)噬血現(xiàn)象。HLH-2004診斷標(biāo)準(zhǔn)補(bǔ)充說明：無論兒童或成人患者，HLH-2004診斷指南都是目前臨床診斷HLH應(yīng)該遵循的原則。2018 HLH診治中國專家共識中提到運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測NK細(xì)胞殺傷活性，到目前為止，國內(nèi)外對NK細(xì)胞活性的檢測方法尚沒有統(tǒng)一規(guī)定，有待完善，而NK細(xì)胞的活性與其受體和功能有關(guān)[9-10]。本研究運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測繼發(fā)性HLH患者NK細(xì)胞KIR受體及穿孔素和顆粒酶B表達(dá)的變化，以此判斷是否可以通過此項(xiàng)檢查來輔助診斷繼發(fā)性HLH。

NK細(xì)胞在機(jī)體中主要起抗腫瘤和抗病毒效應(yīng)，在天然免疫和獲得性免疫中均發(fā)揮重要作用[11]。NK細(xì)胞活性受其表面多種調(diào)節(jié)性受體的調(diào)控，根據(jù)功能可以分為活化性受體和抑制性受體兩大類。研究發(fā)現(xiàn)，KIR除了發(fā)揮抑制性受體作用阻遏殺傷功能外，還具有激活殺傷細(xì)胞的作用，其通過識別表達(dá)于靶細(xì)胞的HLA-I類分子來調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的殺傷活性。正常情況下，活化性受體和抑制性受體表達(dá)水平處于平衡狀態(tài)，共同調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的活性，而表達(dá)水平一旦失衡，NK細(xì)胞的殺傷活性便會減弱[12-14]。NK細(xì)胞主要通過穿孔素及顆粒酶B介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷及細(xì)胞毒性發(fā)揮作用，而一旦穿孔素和顆粒酶B的分泌水平不足，機(jī)體不能有效的清除病毒，持續(xù)的抗原刺激將導(dǎo)致淋巴細(xì)胞和組織細(xì)胞增殖并釋放多種細(xì)胞因子（即“細(xì)胞因子風(fēng)暴”），從而導(dǎo)致全身各個臟器功能受損，甚至死亡[15-16]。CTL細(xì)胞為CD8+T細(xì)胞活化后分化的效應(yīng)細(xì)胞，其主要功能是特異性直接殺傷靶細(xì)胞，主要通過兩種機(jī)制發(fā)揮細(xì)胞毒作用，其中一種也是分泌穿孔素和顆粒酶B等物質(zhì)直接殺傷靶細(xì)胞，如果分泌水平不足，機(jī)體同樣不能有效殺傷靶細(xì)胞[17]。

本研究結(jié)果顯示，繼發(fā)性HLH患者無論是淋巴細(xì)胞數(shù)量及比例，還是NK細(xì)胞數(shù)量及比例都明顯低于正常人，說明繼發(fā)性HLH患者體內(nèi)NK細(xì)胞確實(shí)受到了一定程度的破壞。同時，本研究結(jié)果顯示26例繼發(fā)性HLH患者中存在7例患者NK細(xì)胞KIR受體限制性表達(dá)（僅僅表達(dá)其中一種受體），而其中4例患者都是表達(dá)抑制性受體（另外3例不在所檢測試劑內(nèi)），活化性受體缺失，從而抑制了NK細(xì)胞的活化，使其殺傷作用減弱。所以繼發(fā)性HLH患者中部分患者NK細(xì)胞受體平衡狀態(tài)受到了破壞，從而減弱了NK細(xì)胞的殺傷作用。而對于NK細(xì)胞和CTL細(xì)胞穿孔素和顆粒酶B的表達(dá)，結(jié)果顯示都沒有明顯的降低，這與秦強(qiáng)等[18]的研究一致。另有文獻(xiàn)報道[19]PRF1基因突變的原發(fā)性HLH，其NK細(xì)胞與CTL細(xì)胞的穿孔素表達(dá)明顯降低，而本研究中繼發(fā)性HLH患者穿孔素的表達(dá)未見明顯變化，所以可以通過穿孔素的檢測，快速鑒別PRF1基因突變引起的原發(fā)性HLH和繼發(fā)性HLH。同時研究結(jié)果顯示，HLH患者淋巴細(xì)胞數(shù)量降低（均值0.5×109/L），低于正常人參考值下限0.8×109/L，NK細(xì)胞比例嚴(yán)重降低，CTL細(xì)胞比例明顯高于對照組，總體上NK細(xì)胞CTL細(xì)胞分泌穿孔素和顆粒酶B水平呈下降趨勢，但其表達(dá)水平與對照組差異無顯著意義，有待進(jìn)一步研究其內(nèi)在機(jī)制。

綜合分析，繼發(fā)性HLH患者僅僅存在淋巴細(xì)胞數(shù)量和比例的降低，而NK細(xì)胞和CTL細(xì)胞穿孔素和顆粒酶B的表達(dá)水平并沒有下降。穿孔素的檢測有可能作為臨床鑒別PRF1基因突變引起的原發(fā)性HLH和繼發(fā)性HLH的一個檢測指標(biāo)。但由于例數(shù)相對較少，需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行研究并加以驗(yàn)證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突