潘張磊，王瑞珩，劉跟莉

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種慢性、復(fù)發(fā)性、特發(fā)性的結(jié)腸和直腸炎性疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，宿主免疫應(yīng)答異常、腸道屏障功能障礙、腸道菌群失調(diào)、環(huán)境和其他因素均與該病的發(fā)生有關(guān)[1-2]。糞便菌群移植是將健康供體糞便轉(zhuǎn)移至腸道微生物穩(wěn)態(tài)失衡的患者體內(nèi)以恢復(fù)腸道穩(wěn)態(tài)的治療方法，該療法在艱難梭菌感染的治療中得到認(rèn)可[3-4]，且諸多研究表明糞便菌群移植具有治療UC的潛力[5-6]。但有關(guān)影響糞便菌群移植療效的因素和深入的作用機(jī)制研究甚少。芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor, AHR)信號通路是連接腸道菌群與黏膜免疫的關(guān)鍵信號通路，其在腸道菌群代謝物激活下發(fā)揮對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)和輔助性T 細(xì)胞17(Th17)的調(diào)節(jié)作用[7]，但在糞便菌群移植治療UC中的作用鮮有報道。本研究旨在通過探究移植菌液pH值對糞便菌群移植治療UC小鼠腸道黏膜免疫的影響和AHR信號通路在其中的可能作用，為糞便菌群移植的規(guī)范化提供參考和為糞便菌群移植機(jī)制研究提供新思路。

1 實驗材料與方法

1.1主要儀器和試劑 葡聚糖硫酸鈉(DSS)購于MP Biomedicals公司；尿糞隱血試劑盒購于中國南京建成生物工程研究所；白細(xì)胞介素-10(IL-10)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、白細(xì)胞介素-17A(IL-17A) ELISA試劑盒購于abcam公司。EasySepTMMouse Na?ve CD4+T Cell isolation試劑盒購于stemcell公司。CellXVivo Mouse Treg Cell Differentiation試劑盒和CellXVivoTMMouse Th17 Cell Differentiation試劑盒購于R&D公司。PrimeScriptTMRT reagent試劑盒、TB Green?PremixEx TaqTM試劑盒購于TAKARA公司。PCR儀為Bio-Rad公司iQ5。

1.2供體糞便質(zhì)量控制和菌液制備 招募6名男性健康志愿者提供糞便濾液，要求年齡20～30歲，排便規(guī)律，依從性良，無與腸道菌群變化有關(guān)的疾病，1個月之內(nèi)未服用過抗生素或益生菌，均進(jìn)行糞便檢測，自愿簽署書面知情同意書。6名志愿者從實驗開始前1周嚴(yán)格按照食譜要求進(jìn)行飲食控制，其中隨機(jī)選取2名志愿者為酸性糞便供體，飲食以糖脂類食物為主；隨機(jī)選取2名志愿者為堿性糞便供體，飲食以瘦肉類食物為主；其余2名志愿者為中性糞便供體，飲食以素食為主。取志愿者6 h內(nèi)的新鮮糞便稱重，按照糞便重量與生理鹽水體積比1∶2的比例將兩者充分混勻；雙層無菌紗布過濾糞便混懸液，收集濾液，離心后棄上清，加入二倍糞便體積的生理鹽水，混勻后即為500 mg/mL菌液。酸性菌液控制pH<6.9，堿性菌液控制pH>7.2，中性菌液控制pH 6.9～7.2。

1.3實驗動物 清潔級雄性7周齡C57BL/6小鼠50只，購買并飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，許可證號：SYXK(黑)2016-004。飼養(yǎng)在黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗室，溫度(23±3)℃，濕度40%～70%，每天12 h/12 h光照/黑暗交替，自由取食飼料和實驗動物飲用水，飼養(yǎng)條件符合《黑龍江省實驗動物管理條例》。

1.4實驗方法

1.4.1分組、造模及干預(yù) 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為對照組、模型組、糞便菌群低pH值組、糞便菌群中pH值組和糞便菌群高pH值組，每組10只。除對照組小鼠外，其余組小鼠自由飲用2% DSS溶液進(jìn)行造模，連續(xù)7 d。造模成功后，糞便菌群低pH值組、中pH值組和高pH值組分別給予對應(yīng)的酸性、中性、堿性糞便菌液灌腸，參照人體糞便菌群移植標(biāo)準(zhǔn)[8]，每只小鼠每次移植的糞菌量為小鼠自身體重的0.2%，對照組與模型組給予等量生理鹽水灌腸，均2次/d，連續(xù)7 d。

1.4.2檢測指標(biāo)及方法

1.4.2.1血漿中Tregs和Th17細(xì)胞因子含量 處死小鼠，采用ELISA法檢測血漿中IL-10、TGF-β1、IL-17A含量。

1.4.2.2結(jié)腸組織中Tregs和Th17細(xì)胞因子及AHR、CYP1A1 mRNA表達(dá)量 采用PCR法檢測：取各組小鼠結(jié)腸組織，液氮研磨后用Trizol試劑提取總RNA，氯仿和異丙醇抽提。紫外分光光度儀和瓊脂糖電泳鑒定RNA的濃度和純度，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，并以β-actin 為內(nèi)參對照，IL-10、TGF-β1、IL-17A、AHR、CYP1A1引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計和合成，引物序列：IL-10上游為5’-TTCTTTCAAACAAAGGACCAGC-3’，下游為5’-GCAACCCAAGTAACCCTTAAAG-3’；TGF-β1上游為5’-CCAGATCCTGTCCAAACTAAGG-3’，下游為5’-CTCTTTAGCATAGTAGTCCGCT-3’；IL-17A 上游為5’-GAGCTTCATCTGTGTCTCTGAT-3’，下游為5’-GCCAAGGGAGTTAAAGACTTTG-3’；AHR上游為5’-CATCGACATAACGGACGAAATC-3’，下游為5’-CTGTTGCTGTTGCTCTAGTTG-3’；CYP1A1上游為5’-ACCCTTACAAGTATTTGGTCGT-3’，下游為5’-GTCATCATGGTCATAACGTTGG-3’；β-actin上游為5’-AGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3’，下游為5’-CCAAGAAGGAAGGCTGGAAAA-3’。PCR反應(yīng)條件為:55 ℃逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)60 min，94 ℃變性2 min→94 ℃ 30 s→55 ℃ 30 s→72 ℃ 1 min，共30循環(huán)，72 ℃延伸7 min。膠回收試劑盒回收目的基因片段。PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像儀采集圖像，PCR儀獲得產(chǎn)物 Ct 值，采用 2-△△Ct相對定量計算公式計算分析。

1.4.2.3結(jié)腸組織中Tregs和Th17細(xì)胞因子原位蛋白表達(dá)情況 采用免疫組化法檢測：結(jié)腸組織樣本石蠟切片常規(guī)脫蠟水化后經(jīng)3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，置于0. 01 mol /L pH 6. 0的檸檬酸鈉緩沖液中加熱至96 ℃進(jìn)行抗原修復(fù)，切片自然冷卻至室溫， 滴加胰酶修復(fù)液，37℃恒溫箱中孵育8 min，冷卻至室溫后，PBS洗滌切片，滴加正常山羊非免疫血清，室溫下保濕盒內(nèi)孵育60 min，滴加單克隆抗體，4 ℃冰箱過夜，次日洗滌后滴加二抗生物素，室溫孵化30 min，顯微鏡下DAB顯色液顯色，采用Olympus BH2正置顯微鏡拍攝，陽性反應(yīng)為切片中出現(xiàn)黃褐色顯影。

1.5細(xì)胞實驗 無菌分離C57BL/6小鼠脾臟，制備脾細(xì)胞懸液，磁珠分選器分選Na?ve CD4+T細(xì)胞，繼而采用試劑盒分別誘導(dǎo)分化Tregs和Th17，繼續(xù)培養(yǎng)5 d后分為2組：細(xì)胞以1×105個/mL鋪于U型底96孔板，對照組常規(guī)培養(yǎng)，AHR激動劑組加入10 nmol/L的吲哚甲醇培養(yǎng)，隔天換液，培養(yǎng)5 d后收集各組培養(yǎng)上清液。采用ELISA法檢測Tregs細(xì)胞上清液中IL-10、TGF-β1和Th17細(xì)胞上清液中IL-17A含量，按照“1.4.2.2”PCR法檢測Tregs細(xì)胞上清液中IL-10、TGF-β1、CYP1A1 mRNA和Th17細(xì)胞上清液中IL-17A、CYP1A1 mRNA表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠血漿中Tregs和Th17細(xì)胞因子含量模型組血漿IL-10、TGF-β1含量明顯低于對照組(P均<0.05)，IL-17A含量明顯高于對照組(P均<0.05)；糞便菌群各組血漿中IL-10、TGF-β1含量均明顯高于模型組(P均<0.05)，IL-17A含量均明顯低于模型組(P均<0.05)，糞便菌群中pH值組各指標(biāo)改善最明顯。見圖1。

圖1 對照組和潰瘍性結(jié)腸炎各組小鼠血漿中IL-10、TGF-β1和IL-17A含量

2.2各組小鼠結(jié)腸組織中Tregs和Th17細(xì)胞因子、AHR及CYP1A1 mRNA表達(dá)情況 模型組結(jié)腸組織中IL-10、TGF-β1、AHR、CYP1A1 mRNA表達(dá)量均明顯低于對照組(P均<0.05)，IL-17A mRNA表達(dá)量明顯高于對照組(P<0.05)；糞便菌群各組結(jié)腸組織中IL-10、TGF-β1、AHR、CYP1A1 mRNA表達(dá)量均明顯高于模型組(P均<0.05)，IL-17A mRNA表達(dá)量均明顯低于模型組(P均<0.05)，糞便菌群中pH值組各指標(biāo)改善最顯著。見圖2。

圖2 對照組和潰瘍性結(jié)腸炎各組小鼠結(jié)腸組織中IL-10、TGF-β1、IL-17A、AHR、CYP1A1 mRNA表達(dá)情況

2.3各組小鼠結(jié)腸組織中Tregs和Th17細(xì)胞因子原位蛋白表達(dá)情況 結(jié)腸組織中IL-10、TGF-β1、IL-17A蛋白原位表達(dá)情況與mRNA表達(dá)一致。見圖3。

2.4Tregs、Th17細(xì)胞中細(xì)胞因子含量 AHR激動劑組Tregs細(xì)胞上清液中IL-10、TGF-β1含量均明顯高于對照組(P均<0.05)，Th17細(xì)胞上清液中IL-17A含量明顯低于對照組(P<0.05)。見圖4。

圖4 Tregs上清液中IL-10、TGF-β1和Th17細(xì)胞上清液中IL-17A含量

2.5Tregs、Th17細(xì)胞中細(xì)胞因子及CYP1A1 mRNA表達(dá)情況 AHR激動劑組Tregs細(xì)胞上清液中IL-10、TGF-β1、CYP1A1 mRNA表達(dá)量均明顯高于對照組(P均<0.05)，見圖5；AHR激動劑組Th17細(xì)胞上清液中IL-17A mRNA表達(dá)量明顯低于對照組(P<0.05)，CYP1A1 mRNA表達(dá)量明顯高于對照組(P<0.05)，見圖6。

圖5 Tregs細(xì)胞上清液中IL-10、TGF-β1及CYP1A1 mRNA表達(dá)情況

圖6 Th17細(xì)胞上清液中IL-17A及CYP1A1 mRNA表達(dá)情況

3 討 論

Tregs和Th17為功能上相互制衡的一對免疫細(xì)胞，二者在UC中存在比例失調(diào)。Tregs通過分泌免疫抑制因子IL-10和TGF-β1等實現(xiàn)免疫抑制功能，Tregs的過度消耗會加重UC。Th17細(xì)胞作為促炎細(xì)胞，其通過分泌IL-17促進(jìn)腸道炎癥，使UC惡化。研究發(fā)現(xiàn)，在DSS處理的BALB/c小鼠結(jié)腸和外周血中，Th17細(xì)胞數(shù)量顯著增加而Tregs細(xì)胞數(shù)量顯著降低[9-10]；通過移植鹽酸小檗堿處理的小鼠糞便可緩解UC，調(diào)節(jié)Tregs/Th17平衡[11]。但關(guān)于移植健康人的糞便菌液對UC中Tregs與Th17影響的研究少見。本實驗結(jié)果顯示，通過移植健康人糞便菌液至UC模型小鼠，結(jié)腸中Tregs發(fā)揮作用的主要細(xì)胞因子IL-10、TGF-β1mRNA和原位蛋白表達(dá)上調(diào)，而Th17發(fā)揮作用的主要細(xì)胞因子IL-17A mRNA和原位蛋白表達(dá)下調(diào)，證實移植健康人糞便菌液可調(diào)節(jié)Tregs/Th17平衡，與既往文獻(xiàn)研究結(jié)果一致。

糞便菌群移植的治療作用基于改變腸道菌群實現(xiàn)，其機(jī)制為改變的腸道菌群通過其代謝物影響宿主腸道黏膜免疫而發(fā)揮治療作用。Tian等[12]研究發(fā)現(xiàn)，糞便菌群移植治療后，UC患者腸道菌群多樣性增加，腸道菌群結(jié)構(gòu)改變，Bacteroides、Prevotella豐度回調(diào)。一些菌群能夠代謝食物中的色氨酸產(chǎn)生吲哚及其衍生物如吲哚甲醇、吲哚乙酸、吲哚乳酸、吲哚乙醛等，其能被腸道黏膜吸收并作用于腸道黏膜免疫細(xì)胞如Tregs和Th17[13]。AHR是一種配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，介導(dǎo)吲哚代謝物與腸道黏膜免疫，其與內(nèi)源性或外源性配體結(jié)合后，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，激活CYP家族包括CYP1A1等基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而激活Tregs的分化和抑制Th17的功能，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[7]。Kawai等[14]報道，青黛可通過激活A(yù)HR及CYP1A1和誘導(dǎo)抗炎細(xì)胞因子如IL-10等的表達(dá)發(fā)揮治療UC的作用。本實驗結(jié)果表明，糞便菌群移植后小鼠結(jié)腸組織中AHR、CYP1A1 mRNA表達(dá)上調(diào)；且采用AHR激動劑吲哚甲醇干預(yù)體外培養(yǎng)的Tregs和Th17后，Tregs中IL-10、TGF-β1含量和IL-10、TGF-β1、CYP1A1 mRNA表達(dá)量均明顯上調(diào)，Th17中IL-17A含量和IL-17A mRNA表達(dá)量均明顯下調(diào)而CYP1A1 mRNA表達(dá)量明顯上調(diào)。提示糞便菌群移植治療UC的機(jī)制與AHR信號通路激活介導(dǎo)的Tregs與Th17功能回調(diào)有關(guān)，且此結(jié)果在體外Tregs和Th17細(xì)胞培養(yǎng)中得到進(jìn)一步驗證。

糞便pH值在生理情況下保持恒定，病理情況下則常出現(xiàn)酸堿平衡失調(diào)。不同菌群對環(huán)境pH的范圍有相對選擇性，菌液pH的差異實為菌群分布的差異。大部分細(xì)菌的最適pH為6.5～7.5，大腸桿菌能夠在pH為4.5～8.0的環(huán)境下生存，但過酸會抑制雙歧桿菌的生長和繁殖[15]。故在糞便菌群移植中，供體菌液pH值的選擇或成為影響療效的關(guān)鍵因素。本實驗結(jié)果顯示，相較于酸性和堿性，中性pH值糞便菌液移植對體內(nèi)和體外Tregs和Th17的功能影響最顯著，對AHR信號通路的激活也最明顯。

綜上所述，糞便菌群移植可通過激活A(yù)HR信號通路而改善DSS誘導(dǎo)的小鼠UC黏膜免疫異常，且中性pH值糞便菌液作用效果最顯著。提示糞便菌群移植治療UC時需將菌液pH值納入規(guī)范，基于AHR通路激活能改善腸道黏膜免疫為UC的治療提供了新的思路。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。