賈濮元 ，郭華陽(yáng), ，朱克誠(chéng), ，劉寶鎖, ，郭 梁, ，張 楠, ，江世貴, ，張殿昌,

（1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，河北 秦皇島 066003； 2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300； 3. 廣東省海洋生物種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510300）

魚(yú)類精子冷凍是一種有效保護(hù)魚(yú)類種質(zhì)資源的生物技術(shù)，具有極大的商業(yè)應(yīng)用潛力[1-2]，可有效簡(jiǎn)化對(duì)親魚(yú)的管理，解決魚(yú)類雌、雄配子發(fā)育不同步或地理隔離的問(wèn)題，從而有助于瀕危物種資源保護(hù)和重要模式物種的譜系構(gòu)建，為魚(yú)類遺傳學(xué)研究不間斷提供優(yōu)質(zhì)的配子材料，增加養(yǎng)殖親魚(yú)的遺傳變異性。Blxater[3]于1953年成功冷凍保存大西洋鯡 (Clupea harengus) 精子，開(kāi)啟了魚(yú)類精子冷凍保存的先河。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已建立了魚(yú)類精子冷凍保存技術(shù)體系，構(gòu)建了白斑狗魚(yú) (Esox lucius)[4]、翹嘴鲌 (Culter alburnus)[5]、紅點(diǎn)鮭 (Salvelinus leucomaenis)[1]、烏克蘭鱗鯉 (Cyprinus carpoio)[6]、小黃魚(yú) (Larimichthys polyactis)[7]等重要經(jīng)濟(jì)魚(yú)類的冷凍精子庫(kù)，并成功應(yīng)用在魚(yú)類的雌核發(fā)育和性別控制等方面。魚(yú)類精子冷凍保存已成為長(zhǎng)期保存魚(yú)類優(yōu)質(zhì)資源的有效途徑之一，然而不同魚(yú)類精子的生理特性不盡相同，導(dǎo)致其冷凍保存技術(shù)具有特異性，因此對(duì)特定養(yǎng)殖品種，需要優(yōu)化確定其精子冷凍保存技術(shù)參數(shù)，建立適宜的精子冷凍保存技術(shù)體系。

黃鰭棘鯛 (Acanthopagrus latus)，又名黃鰭鯛、黃腳立、赤翅等，為淺海暖水性底層魚(yú)類[8]，因其肉質(zhì)鮮美、口感極佳、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，加之其適應(yīng)力強(qiáng)、生長(zhǎng)快，已成為我國(guó)南方池塘和網(wǎng)箱養(yǎng)殖的重要對(duì)象之一[9]。黃鰭棘鯛是雌雄同體魚(yú)類，單個(gè)個(gè)體時(shí)，雄性1齡時(shí)可發(fā)育成熟，到3齡時(shí)雄魚(yú)轉(zhuǎn)化為成熟雌性，雌、雄發(fā)育不同步以及地理隔離的問(wèn)題致使其育種受到限制，制約了黃鰭棘鯛養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。利用低溫冷凍技術(shù)可有效解決雌、雄發(fā)育不同步的問(wèn)題，保證在人工授精時(shí)獲得充足的魚(yú)類精子供應(yīng)，使育種更加順利，保障其產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展[10]。自20世紀(jì)80年代起國(guó)內(nèi)外開(kāi)始了鯛科魚(yú)類精子超低溫冷凍保存的研究工作；江世貴等[9,11]對(duì)黑鯛 (A. schlegelii)、黃鰭棘鯛、平鯛 (Rhabdosargus sarba) 和真鯛 (Pagrus major) 4種鯛科魚(yú)類精子的適鹽性、精子激活條件以及pH對(duì)精子活力的影響等方面進(jìn)行了研究；李加兒等[12]研究了環(huán)境因子對(duì)平鯛精子活力的影響；其他學(xué)者在黑鯛[13-14]、真鯛[11,15]和金鯛 (Sparus aurata)[16]等精子冷凍保存方面進(jìn)行了研究。而目前關(guān)于黃鰭棘鯛精子冷凍保存的報(bào)道僅見(jiàn)Gwo[17]在冷凍保存稀釋液、抗凍劑、降溫程序等方面的研究。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)黃鰭棘鯛精子超低溫冷凍保存條件進(jìn)行優(yōu)化篩選，探索出適用于其精子簡(jiǎn)便有效的超低溫冷凍保存方法，以期為該種優(yōu)良種質(zhì)資源的保護(hù)以及開(kāi)展其他魚(yú)類精子超低溫冷凍保存提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2齡黃鰭棘鯛親魚(yú)來(lái)自于中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所熱帶研究開(kāi)發(fā)中心，體質(zhì)量為300～450 g，養(yǎng)于海南陵水新村港。2020年12月挑選性腺發(fā)育良好的雄性親魚(yú)，采用輕輕擠壓腹部的方法收集精液。采集精子時(shí)用干毛巾擦去魚(yú)體體表水分，避免光線直射、避免血液、尿液及糞便的污染，待精液流出后用潔凈的注射器將精液收集于離心管并置于冰浴上 (4 ℃) 備用。

1.2 稀釋液的篩選

將采集的精子進(jìn)行鏡檢，收集活力90%以上的精子進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取50 μL精子，分別加入100 μL的4種稀釋液 (表1)，立即在顯微鏡下進(jìn)行觀察，并以精子原地顫動(dòng)為指標(biāo)檢測(cè)稀釋液是否將精子激活。隨后立即加入100 μL潔凈滅菌的海水進(jìn)行激活，再次觀察，以檢測(cè)稀釋液是否對(duì)精子產(chǎn)生毒性以及能否有效保存精子，篩選出精子活力最高的稀釋液種類。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)6個(gè)平行，精子活力為隨機(jī)視野中被激活運(yùn)動(dòng)的精子占該視野全部精子的百分?jǐn)?shù)。

1.3 葡萄糖濃度的篩選

使用篩選出的稀釋液，將稀釋液中葡萄糖質(zhì)量濃度調(diào)整至5、10、15和20 g·L-1，并將精子與稀釋液以1∶1的比例稀釋，總體積為100 μL，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)6個(gè)平行。稀釋后立即加入100 μL潔凈滅菌的海水進(jìn)行激活，在顯微鏡下觀察并記錄精子活力、運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命。精子運(yùn)動(dòng)時(shí)間為其由激活開(kāi)始到90%的精子原地顫動(dòng)為止所經(jīng)歷的時(shí)間 (s)。精子壽命為其從激活開(kāi)始運(yùn)動(dòng)到90%的精子停止運(yùn)動(dòng)的時(shí)間 (s)。依據(jù)精子活力、運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命篩選出適宜的葡萄糖濃度。

1.4 抗凍劑的篩選

選用甲醇 (MeOH)、乙二醇 (EG)、甘油 (Gly)和二甲基亞砜 (DMSO) 4種常見(jiàn)滲透性抗凍劑來(lái)檢測(cè)其對(duì)黃鰭棘鯛精子的冷凍保護(hù)效果。分別以4種體積分?jǐn)?shù) (5%、10%、15%和20%) 添加甲醇、乙二醇、甘油和二甲基亞砜至篩選出的稀釋液，配制成精子冷凍稀釋保護(hù)液，與新鮮精子及不添加抗凍劑的冷凍精子進(jìn)行篩選比較。冷凍稀釋保護(hù)液配制完成后置于4 ℃保存?zhèn)溆?。為篩選黃鰭棘鯛精子冷凍保存的最優(yōu)抗凍劑，將精子與配制好的冷凍稀釋保護(hù)液以1∶1的比例稀釋，置于冰上平衡1～2 min使其混勻，總體積為100 μL，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)6個(gè)平行。將精子稀釋混勻液置于4 ℃冰箱中平衡30 min，后置于液氮液面上方10 cm處熏蒸5 min，最后投入液氮中保存供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。2 h后取出精子進(jìn)行復(fù)蘇，將凍精放入37 ℃水浴中快速解凍至完全融化后，取少許精液均勻涂抹在載玻片上，滴加100 μL滅菌海水激活，利用顯微鏡觀察并記錄精子活力、測(cè)定快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命，篩選出適宜冷凍精子的抗凍劑及濃度。

1.5 稀釋比例的篩選

確定最優(yōu)的稀釋液和抗凍劑后，將精子與冷凍稀釋保護(hù)液分別按照1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶7和1∶9的比例稀釋，總體積為100 μL，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)6個(gè)平行。按照1.4的方法冷凍、解凍，觀察和記錄精子活力、測(cè)定快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命，篩選出適宜冷凍精子的稀釋比例。

1.6 降溫程序的篩選

使用篩選出的最優(yōu)稀釋液、抗凍劑，將精子與保護(hù)液以最優(yōu)的稀釋比例進(jìn)行稀釋，檢測(cè)不同降溫程序?qū)S鰭棘鯛精子冷凍保存活力的影響。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)6個(gè)平行，將精子凍存混勻液于4 ℃冰箱平衡30 min后，置于液氮液面上方2.5、5.0、7.5和10.0 cm的4種高度熏蒸5 min，然后移至液氮中冷凍保存供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。按照1.4的方法解凍，觀察和記錄精子的活力、運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命，篩選出最優(yōu)的降溫程序。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用Excel 2010和SPSS 26.0軟件處理分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以單因素方差分析法 (One-way ANOVA) 檢驗(yàn)各組精子活力、運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命的差異顯著性，再用多重比較檢驗(yàn)各處理組之間的差異顯著性，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著，并用Origin (2019) 軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)做柱狀圖。

2 結(jié)果

2.1 黃鰭棘鯛精子冷凍保存稀釋液的篩選

本實(shí)驗(yàn)選取4種常見(jiàn)的稀釋液來(lái)檢測(cè)其對(duì)黃鰭棘鯛精子保存的效果，并與新鮮精子進(jìn)行比較 (表2)。黃鰭棘鯛新鮮精子的平均活力為 (94.83±1.47)%，加入Hank's、MPRS、Cortland、RS 4種稀釋液后精子活力分別達(dá)到 (84.67±1.75)%、(2.00±1.41)%、(5.00±2.61)%和 (25.83±4.92)%。MPRS液和Cortland液的精子活力之間無(wú)顯著性差異 (P＞0.05)，均極顯著低于其他實(shí)驗(yàn)組 (P＜0.01)。加入滅菌海水激活精子，其活力分別達(dá)到 (74.50±4.18)%、(90.17±2.79)%、(33.17±4.07)% 和 (72.50±5.01)%。MPRS液對(duì)黃鰭棘鯛精子保存的效果顯著低于新鮮精子的活力 (P＜0.01)，但顯著高于其他各組稀釋液(P＜0.01)。由上述結(jié)果得出MPRS液是適合黃鰭棘鯛精子保存的基礎(chǔ)稀釋液。

表2 黃鰭棘鯛新鮮精子加入4種稀釋液以及激活前后活力對(duì)比Table 2 Comparison of sperm activity before and after addition of four diluents to fresh sperm of A. latus

2.2 黃鰭棘鯛精子冷凍保存葡萄糖濃度的篩選

以MPRS液為稀釋液，將其葡萄糖質(zhì)量濃度分別調(diào)整至5、10、15和20 g·L-1，加入激活液后立即使用顯微鏡觀察。隨著葡萄糖質(zhì)量濃度由5 g·L-1增加至20 g·L-1，精子的活力、運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命均呈先上升后下降的趨勢(shì) (圖1)。其中葡萄糖質(zhì)量濃度為10 g·L-1時(shí)，精子的活力、運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命均最高，分別可達(dá)到 (83.33±3.98)%、(73.81±17.28) s和 (138.75±20.70) s，顯著高于其他葡萄糖濃度組 (P＜0.01)。

圖1 不同葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)精子活力、運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命的影響精子運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命以左邊縱軸為準(zhǔn)，精子活力以右邊縱軸為準(zhǔn)；不同字母表示組間差異顯著 (P＜0.05)；后圖同此。Figure 1 Effects of different glucose concentration on sperm motility, sperm movement time and sperm life spanSperm movement time and sperm life are based on the left vertical axis,and sperm motility is based on the right vertical axis; different letters indicate significant difference among the groups (P＜0.05); the same case in the following figures.

2.3 黃鰭棘鯛精子冷凍保存抗凍劑的篩選

以MPRS液為黃鰭棘鯛精子冷凍保存稀釋液，分別以終體積分?jǐn)?shù)為5%、10%、15%和20%加入抗凍劑甲醇、乙二醇、甘油和二甲基亞砜，超低溫冷凍保存黃鰭棘鯛精子，檢測(cè)凍精活力、運(yùn)動(dòng)時(shí)間及壽命來(lái)確定抗凍劑的保護(hù)效果 (圖2)。結(jié)果表明甘油對(duì)黃鰭棘鯛的精子基本無(wú)抗凍保護(hù)作用，各濃度組之間無(wú)顯著性差異 (P＞0.05，圖2-c)；甲醇組和二甲基亞砜組體積分?jǐn)?shù)由5%增加到20%，精子活力、運(yùn)動(dòng)時(shí)間及壽命均有先上升后下降的趨勢(shì) (圖2-a，2-d)，兩組中保存效果最好的分別是10%甲醇組和15%二甲基亞砜組，精子活力分別為 (46.00±4.97)%和 (41.25±2.99)%，精子運(yùn)動(dòng)時(shí)間分別為 (19.83±4.44) s和 (22.18±2.61) s，壽命分別為 (84.59±12.76) s和 (65.34±12.85) s，兩者之間無(wú)顯著性差異 (P＞0.05)；乙二醇各濃度組中隨著濃度的增高，其對(duì)黃鰭棘鯛精子抗凍保護(hù)的作用逐漸減弱，其中以5%乙二醇作為抗凍劑，冷凍精子激活后的活力、運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命最高，分別為(89.67±3.44)%、(74.02±11.32) s和 (341.33±13.83) s，均顯著低于新鮮精子的活力 [(94.83±1.47)%]、運(yùn)動(dòng)時(shí)間 [(110.62±10.34) s] 和壽命 [(408.79±16.16) s](P＜0.05，圖2-b)，表明5%乙二醇對(duì)黃鰭棘鯛精子抗凍保護(hù)效果最好。

圖2 同種稀釋液、不同濃度的4種抗凍劑對(duì)精子活力的影響Figure 2 Effects of different concentrations of four kinds of cryoprotectant on sperm motility with same solution as diluent

2.4 黃鰭棘鯛精子冷凍保存稀釋比例的篩選

以MPRS液為稀釋液，以5%乙二醇為抗凍劑，不同稀釋比例下精子冷凍保存的效果見(jiàn)圖3。黃鰭棘鯛精子與保護(hù)液稀釋比例為1∶2時(shí)凍精激活后活力最高 [(89.67±4.63)%]，但與稀釋比例為1∶3、1∶4和1∶5時(shí)差異不顯著 (P＞0.05)，稀釋比例為1∶7和1∶9時(shí)差異不顯著 (P＞0.05)，均顯著低于稀釋比例1∶2 (P＜0.05)，活力最低的是稀釋比例1∶1。精子運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命均以稀釋比例為1∶2時(shí)最高，分別為 (68.54±12.91) s和 (206.87±33.08) s，均顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組 (P＜0.05)，稀釋比例為1∶3、1∶4、1∶5、1∶7和1∶9時(shí)精子運(yùn)動(dòng)時(shí)間無(wú)顯著差異 (P＞0.05)，均顯著高于稀釋比例1∶1組 (P＜0.01)。綜合精子活力、運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命可知，稀釋比例為1∶2時(shí)黃鰭棘鯛精子冷凍保存的效果最優(yōu)。

圖3 冷凍保存中不同稀釋比例對(duì)精子活力、運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命的影響Figure 3 Effects of different dilution ratios on sperm motility,sperm movement time and sperm life span

2.5 黃鰭棘鯛精子冷凍保存降溫程序的篩選

以MPRS液為稀釋液，葡萄糖質(zhì)量濃度為10 g·L-1，以5%乙二醇為抗凍劑，以1∶2的比例稀釋精液，分別將精子凍存混勻液置于液氮液面上方不同高度進(jìn)行黃鰭棘鯛精子的冷凍保存。解凍復(fù)蘇后檢測(cè)精子冷凍保存的效果 (圖4)。隨著降溫高度由2.5 cm升高至10 cm，凍精解凍后的精子活力、運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命均呈先上升后下降趨勢(shì)，其中5.0 cm組的精子壽命為 (94.29±9.55) s，顯著高于其他高度組 (P＜0.01)，精子活力 [(85.17±3.66)%]和運(yùn)動(dòng)時(shí)間 [(59.16±7.70) s] 與7.5 cm組精子活力[(78.80±6.53)%] 和運(yùn)動(dòng)時(shí)間 [(53.12±6.87) s] 無(wú)顯著性差異 (P＞0.05)，10.0 cm組各項(xiàng)指標(biāo)均顯著低于其他高度組。綜上，5.0 cm組對(duì)黃鰭棘鯛冷凍精子有良好的保護(hù)作用，而10.0 cm組的保護(hù)作用較弱。

圖4 冷凍保存中不同液氮液面上方高度對(duì)精子活力、運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命的影響Figure 4 Effects of different height above liquid nitrogen surface on sperm motility, sperm movement time and sperm life span

3 討論

3.1 稀釋液對(duì)黃鰭棘鯛精子活力的影響

通常精子被排出體外后與水或非等滲溶液結(jié)合后就會(huì)被激活發(fā)生劇烈運(yùn)動(dòng)。而稀釋液可以為精子提供一個(gè)適宜的生存環(huán)境，并為其提供一定營(yíng)養(yǎng)，提高精子離體后的生存時(shí)長(zhǎng)，減輕抗凍劑對(duì)精子的毒害作用，降低精子冷凍保存中的負(fù)面影響，有效預(yù)防精子被激活。因此稀釋液應(yīng)該對(duì)精子無(wú)毒或是毒性較小，防止精子被激活[18]，且組成成分應(yīng)盡可能簡(jiǎn)單[11]。目前魚(yú)類精子稀釋液尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)根據(jù)不同物種魚(yú)類精子的生理特性篩選出該種所適宜的稀釋液種類。目前Hank's、MPRS、Cortland和RS都是常用的精子冷凍保存稀釋液，研究發(fā)現(xiàn)Hank's液較適用于鱸形目魚(yú)類精子的保存，D-15稀釋液常用于草魚(yú) (Ctenopharyngodon idella)、鯉 (Cyprinus carpio)、團(tuán)頭魴 (Megalobrama amblycephala) 等鯉科魚(yú)類精子的冷凍保存中[19]。尤穎哲[10]研究表明適宜雙斑東方鲀 (Takifugu bimaculatus) 精子冷凍保存的稀釋液是MPRS液。江世貴[11]在進(jìn)行黑鯛、真鯛及平鯛精子超低溫冷凍保存時(shí)發(fā)現(xiàn)5%葡萄糖溶液、1%氯化鈉溶液、3%檸檬酸鈉溶液都是適宜的稀釋液。精子離開(kāi)魚(yú)體后環(huán)境變化、營(yíng)養(yǎng)消耗、能量代謝等致使其存活時(shí)間縮短而死亡，稀釋液則能維持精子在體外的生理狀態(tài)，使其不受損害并延長(zhǎng)壽命[18]。稀釋液中鈉離子 (Na+)、鉀離子 (K+) 可以較好地維持精子的滲透壓[20]；鈣離子 (Ca2+) 能引起精子聚集，使精子活力降低，對(duì)精子的活動(dòng)具有抑制作用；也有研究證實(shí)葡萄糖可以增強(qiáng)精子活力，延長(zhǎng)精子壽命[21]，但至今關(guān)于稀釋液還沒(méi)有一個(gè)統(tǒng)一的說(shuō)法[22]，應(yīng)根據(jù)不同魚(yú)類進(jìn)展特性進(jìn)行逐個(gè)實(shí)驗(yàn)篩選。本實(shí)驗(yàn)中加入不同稀釋液后黃鰭棘鯛精子活力差異較大，Hank's液不能較好地抑制精子的活動(dòng)，保存期間精子活力有一定程度的損耗，激活后由(84.67±1.75)%降低至 (74.50±4.18)%；而加入MPRS液和激活液激活前后，精子活力由 (2.00±1.41)%升高至 (90.17±5.01)%，保存過(guò)程中精子損耗小且更易被激活，結(jié)果證實(shí)適宜黃鰭棘鯛精子超低溫冷凍保存的稀釋液為MPRS液，可獲得80%以上的凍精活力，與雙斑東方鲀的研究結(jié)果相同。由此說(shuō)明MPRS液可為黃鰭棘鯛精子提供更為適宜的存活環(huán)境及營(yíng)養(yǎng)。其他種類稀釋液得到的精子活力顯著低于MPRS液，可能是其他稀釋液未能為黃鰭棘鯛精子提供適合生存的冷凍環(huán)境，或不能稀釋抗凍劑，使精子處于一個(gè)毒性較高的環(huán)境，因此不適用于黃鰭棘鯛精子的冷凍保存。

3.2 葡萄糖濃度對(duì)黃鰭棘鯛精子活力的影響

葡萄糖可以在精子冷凍保存期間為其提供能量以維持正常的生理活動(dòng)和功能，具有較低的毒性，并可以幫助精子在冷凍期間預(yù)防冰晶的形成，降低精子形成冰晶的可能性，保持精子活力、延長(zhǎng)精子壽命[23-24]。適宜的葡萄糖濃度可以提高精子耐受冷凍損傷的能力，但過(guò)高的葡萄糖濃度則不利于精子活力的保持。冷凍保存條件下葡萄糖濃度繼續(xù)增加會(huì)使糖酵解產(chǎn)物過(guò)多，積累后產(chǎn)生較多的活性氧破壞了精子結(jié)構(gòu)[25-26]，進(jìn)而致使精子凋亡[24,27]。不同種魚(yú)類對(duì)葡萄糖的需求有差異，哲羅鮭 (Hucho taimen)[28]精子冷凍保存過(guò)程中30%的葡萄糖有益于提高其精子活力；江世貴[11]使用5%的葡萄糖超低溫冷凍保存真鯛精子209 d后的激活率可達(dá)80%；本實(shí)驗(yàn)中，隨著葡萄糖濃度的增加，黃鰭棘鯛精子活力先升高后降低，在葡萄糖質(zhì)量濃度為10 g·L-1時(shí)精子活力最高，但當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度達(dá)到20 g·L-1時(shí)精子活力、運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命均明顯降低。

3.3 抗凍劑的種類和濃度對(duì)黃鰭棘鯛精子活力的影響

精子超低溫保存過(guò)程中，較低的溫度可能會(huì)對(duì)精子產(chǎn)生冰晶損傷，破壞精子的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使其喪失生理功能，抗凍劑則可以降低冰點(diǎn)進(jìn)而降低冰晶對(duì)精子結(jié)構(gòu)的損傷[29]，達(dá)到保護(hù)精子的目的。理論上抗凍劑濃度越高，在精子冷凍保存期間對(duì)精子的保護(hù)效果越好，但抗凍劑濃度與其對(duì)精子的毒性呈正相關(guān)[30]，濃度過(guò)高可能對(duì)精子有毒甚至致死。目前常用滲透性抗凍劑有甲醇、乙二醇、甘油、丙二醇 (PG)、乙二醇甲醚 (MG) 和二甲基亞砜等，這些抗凍劑在溶液中可自由通過(guò)細(xì)胞膜，減緩精子冷凍過(guò)程中的收縮[18]，降低超低溫冷凍保存中對(duì)精子的冰晶損傷，從而達(dá)到保護(hù)精子的目的，有效減小超低溫冷凍保存中對(duì)精子的冰晶損傷。其中甘油多被用于魚(yú)類精子的冷凍保存，并在花鱸 (Lateolabrax japonicus)、大黃魚(yú) (L. crocea) 等精子的保存中取得較好的抗凍效果；二甲基亞砜和甲醇多用于淡水魚(yú)類精子的冷凍保存，二甲基亞砜在鯉[31]、大鱗副泥鰍 (Paramisgurnus dabryanus)[32]、光唇魚(yú) (Acrossocheilus fasciatus)[33]等精子的保存中有較為理想的效果；使用10%甲醇作為抗凍劑冷凍保存暗色唇魚(yú) (Semilabeo obscures)[30]、圓口銅魚(yú) (Coreius guichenoti)[34]等魚(yú)類精子時(shí)得到較高的激活率；真鯛精子按V(精液)∶V (二甲基亞砜)∶V (葡萄糖)=10∶75∶15進(jìn)行超低溫冷凍保存可獲得較高的凍精活力[35]。Gwo[17]使用10%二甲基亞砜為抗凍劑冷凍保存黃鰭棘鯛精子，冷凍30 min取出檢測(cè)后獲得約75%的凍精活力，使用10%甲醇為抗凍劑則對(duì)精子無(wú)保護(hù)作用。在本實(shí)驗(yàn)中任何濃度的二甲基亞砜、甘油和甲醇對(duì)超低溫冷凍保存的黃鰭棘鯛精子均有一定的保護(hù)作用，但乙二醇實(shí)驗(yàn)組中5%的終體積分?jǐn)?shù)可獲得黃鰭棘鯛冷凍精子復(fù)蘇后的最佳活力，在其精子冷凍保存期間起到良好的抗凍作用。

3.4 稀釋比例對(duì)黃鰭棘鯛精子活力的影響

在魚(yú)類精子冷凍保存實(shí)驗(yàn)中，精子與冷凍稀釋保護(hù)液一般以1∶1～1∶20的體積比稀釋時(shí)可以取得良好的冷凍保存效果[36]，過(guò)高或過(guò)低的稀釋比例都會(huì)降低精子活力甚至致死，因此適宜的稀釋比例能夠更好地保持精子良好的活力和穩(wěn)定性，減輕高度稀釋對(duì)精子產(chǎn)生的不利影響。張崇英等[37]研究發(fā)現(xiàn)以D-17為稀釋液稀釋胭脂魚(yú) (Myxocyprinus asiaficus) 精子時(shí)最佳的稀釋比例為1∶3，以D-20為稀釋液稀釋比例為1∶3與1∶6無(wú)顯著性差異，均有較好的保存效果。Lee等[38]研究發(fā)現(xiàn)較高的稀釋率與解凍后精子活力降低有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)隨著稀釋率的增加，黃鰭棘鯛精子解凍后的活力、運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命先增加后降低，這與大鱗副泥鰍[32]精子超低溫冷凍保存得到的精子活力趨勢(shì)變化一致，其中解凍精子活力在稀釋比例為1∶2時(shí)達(dá)到最高，但稀釋率過(guò)高會(huì)導(dǎo)致精子活力顯著降低，這與Lee等[38]研究結(jié)論一致，而與其他鯛科魚(yú)類精子超低溫冷凍保存中精液與保存液的比例1∶4～1∶9[11]有所不同，這可能是由于采取了不同的操作程序或改變了某些工作參數(shù)導(dǎo)致最適稀釋比有差異。

3.5 降溫程序?qū)S鰭棘鯛精子活力的影響

不同種魚(yú)類精子冷凍保存時(shí)所適用的降溫程序有所差異，需逐步對(duì)精子降溫，尋求適宜的降溫程序使其對(duì)低溫冷凍有一個(gè)逐步適應(yīng)的過(guò)程，以獲取最好的保存效果。目前二步法、三步法和程序降溫儀降溫法常用于魚(yú)類精子的降溫，鯉形目[33]多用二步法，鰈形目[39]與鯡形目[40]多用三步法。程序降溫儀是連續(xù)降溫，具有合理的降溫梯度，但設(shè)備昂貴、操作煩瑣，實(shí)際過(guò)程中多采用簡(jiǎn)便的二步法和三步法。Koh等[41]在七帶石斑魚(yú) (Epinephelus septemfasciatus) 精子的冷凍保存實(shí)驗(yàn)中于液氮液面上方2.5、5、7.5和10 cm處降溫至-50 ℃后投入液氮保存，各組凍精解凍后活力無(wú)顯著性差異；雙斑東方鲀[10]精子冷凍采用三步法降溫可獲得接近鮮精水平、高達(dá)83%的凍融精子活力；江世貴[11]在黑鯛精子超低溫保存中未采用降溫平衡，直接將精子浸入液氮中保存，取得了最好的保存效果；Gwo[17]在冷凍保存黃鰭棘鯛精子的實(shí)驗(yàn)中，于液氮液面上方1.0、4.0、8.0 cm和置于干冰中得到的精子活力沒(méi)有差異。本實(shí)驗(yàn)中黃鰭棘鯛精子直接投入液氮未獲得激活精子，使用二步法對(duì)黃鰭棘鯛精子進(jìn)行降溫，經(jīng)過(guò)4 ℃平衡后分別置于液面上方2.5、5.0、7.5和10 cm熏蒸5 min后，投入液氮2 h后得到了一定的凍精活力，且由結(jié)果可知5.0 cm組精子活力、運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命顯著高于其他組，10.0 cm組為最低，可能是采取不同的稀釋液、稀釋比例以及冷凍保存時(shí)間等導(dǎo)致結(jié)果與Gwo[17]的研究有所差異。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)黃鰭棘鯛精子稀釋液、抗凍劑、精子與保護(hù)液稀釋比例、葡萄糖濃度篩選以及降溫程序優(yōu)化，確定了以含10 g·L-1葡萄糖、5%乙二醇的MPRS溶液與精子按1∶2比例稀釋，4 ℃平衡30 min，液氮面上5 cm熏蒸5 min，最后投入液氮保存的方法，可有效冷凍保存其精子，液氮冷凍2 h后可恢復(fù) (85.17±3.66)%的黃鰭棘鯛冷凍精子活力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為黃鰭棘鯛精子冷凍保存技術(shù)及其精子冷凍庫(kù)的建立提供一定的技術(shù)支持，有關(guān)黃鰭棘鯛精子冷凍保存技術(shù)還需要進(jìn)一步優(yōu)化完善，以獲取更高質(zhì)量的精子。