蔣明星，張 鈺，何禧夢(mèng)，趙云潔，李 翠， 易夢(mèng)鐲，李黎仙，劉 萍，畢曉旭*

(1. 昆明學(xué)院 農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650214； 2. 云南白藥集團(tuán)健康產(chǎn)品有限公司，云南 昆明 650214)

齲齒作為口腔最常見的疾病之一，在人群中的發(fā)病率一直居高不下．研究[1-2]表明，變異鏈球菌是引起齲齒的最主要致病菌，其會(huì)在牙齒的表面形成牙菌斑生物膜，從而形成一個(gè)局部的微生態(tài)環(huán)境．此外，由于其能夠充分利用碳水化合物并代謝為乳酸，且這些酸性物質(zhì)會(huì)在局部環(huán)境中持續(xù)產(chǎn)生腐蝕牙齒的主要結(jié)構(gòu)物質(zhì)—磷酸鈣[3]．目前，雖然市場(chǎng)上已有針對(duì)這類口腔致病菌，且具有顯著作用的殺菌劑，但由于其殺菌的廣譜型，可能會(huì)進(jìn)一步破壞口腔生態(tài)菌群的平衡，以及增加細(xì)菌的抗藥性[4]和對(duì)宿主細(xì)胞的細(xì)胞毒性[5]．然而，生物酶制劑與這類抑菌化合物相比較，則顯得更加安全、有效．

右旋糖酐酶是一種能夠裂解高分子右旋糖酐中的α-1,6葡萄糖酐鍵的水解酶[6]，其變異鏈球菌生物膜的主要成分是葡聚糖，為生物膜結(jié)構(gòu)的建筑支架．由于右旋糖酐酶能夠有效地水解葡聚糖，從而破壞生物膜結(jié)構(gòu)、抑制牙菌斑的形成[7]．而羥基磷灰石(HAP)是一種具有生物活性和生物相容性的材料，其化學(xué)組成與人類牙釉質(zhì)的磷灰石晶體很相似[8]．研究[9-11]表明，羥基磷灰石可以吸附到牙齒表面，促進(jìn)牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)表面再礦化，增強(qiáng)釉質(zhì)的抗齲力．此外，羥基磷灰石具有特殊的孔狀結(jié)構(gòu)和表面化學(xué)性質(zhì)，從而具有良好的吸附性能[12]，且對(duì)蛋白質(zhì)也具有較好的吸附作用[13-14]．因此，可嘗試?yán)昧u基磷灰石吸附和固定化右旋糖酐酶，以消除牙菌斑生物膜，緩解齲齒．

本文對(duì)羥基磷灰石吸附和固定化右旋糖酐酶的方法進(jìn)行探索，并通過體外模擬變異鏈球菌生物膜，以及使用吸附右旋糖酐酶的羥基磷灰石進(jìn)行干預(yù)，旨在為生物酶牙膏研發(fā)提供一種方法．

1 材料與方法

1.1 材料

右旋糖酐酶(寧夏夏盛實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)；羥基磷灰石和羥基磷灰石圓片(云南白藥集團(tuán)健康產(chǎn)品有限公司惠贈(zèng))；葡聚糖T40(源葉生物公司)；異麥芽糖(合肥巴斯夫生物科技有限公司)；TaKaRa BCA Protein Assay Kit(寶生物工程有限公司)；LIVE/DEADTMBacLightTMBacterial Viability Kit(Thermo Fisher 科技公司)；變異鏈球菌ATCC25175(廣東省微生物研究所)．

1.2 儀器

酶標(biāo)儀(SPECTRA MAX 190)；水浴震蕩培養(yǎng)箱(上海一恒)；高速冷凍臺(tái)式離心機(jī)(Eppendorf 5810R)；24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning-Costar)；厭氧培養(yǎng)罐(日本三菱)；水浴鍋(常州國(guó)華)；超高分辨共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP8 STED)．

1.3 方法

1.3.1 右旋糖酐酶的吸附和吸附率

稱取一定質(zhì)量的羥基磷灰石置于10 mL離心管中，向其中加入2 mL的右旋糖酐酶溶液(質(zhì)量濃度為15 mg/mL)，渦旋混勻后將離心管置于37 ℃水浴中100 r/min震蕩吸附1，8，16，24 h，隨后5 000 r/min離心20 min，將酶液倒入干凈的離心管中，用1 mL PBS緩沖液漂洗羥基磷灰石3次，5 000 r/min 離心20 min將上清液轉(zhuǎn)入酶液離心管中，渦旋混勻后，利用BCA法測(cè)定其蛋白質(zhì)量濃度，根據(jù)體積計(jì)算蛋白質(zhì)量，計(jì)算公式如下：

羥基磷灰石所吸附的蛋白量=總蛋白質(zhì)量-上清液中蛋白質(zhì)量；

吸附率=(羥基磷灰石所吸附的蛋白質(zhì)量/所加入右旋糖酐酶的質(zhì)量)×100%．

1.3.2 右旋糖酐酶的固定和固定化率

稱取100 mg羥基磷灰石置于10 mL離心管中，向其中加入5 mL體積分?jǐn)?shù)分別為0.02%、0.10%、0.20%、0.25%的戊二醛溶液，25 ℃ 100 r/min 震蕩交聯(lián)2 h和8 h．交聯(lián)結(jié)束后，用ddH2O漂洗載體3次，再加入2 mL酶液，37 ℃水浴下，100 r/min震蕩交聯(lián)1 h．

固定化條件優(yōu)化：稱取100 mg羥基磷灰石，首先在5 mL 0.2 mol/L NaOH溶液中40 ℃水浴震蕩活化 90 min，活化結(jié)束后，用ddH2O漂洗載體3次．再重復(fù)上述戊二醛交聯(lián)實(shí)驗(yàn)步驟．固定化率的計(jì)算公式如下：

固定化率=(羥基磷灰石所固定的蛋白質(zhì)量/所加入右旋糖酐酶的質(zhì)量)×100%．

1.3.3 右旋糖酐酶的吸附和固定化酶活

酶活測(cè)定方法：取2%的葡聚糖T40溶液 950 μL，加入吸附或固定化右旋糖酐酶后的羥基磷灰石載體，37 ℃水浴反應(yīng)30 min后，5 000 r/min離心20 min后取上清液，根據(jù)DNS法并參照文獻(xiàn)[15]測(cè)定酶活．

右旋糖酐酶水解葡聚糖，產(chǎn)物為異麥芽糖．將酶活定義為1 mg羥基磷灰石載體、1 min水解得到1 μmol異麥芽糖的量為1個(gè)酶活單位(U)，活力單位為1 U/mg或1 000 U/g．

1.3.4 唾液收集與預(yù)處理

唾液收集：選擇10名18～30歲的健康志愿者收集其唾液(要求志愿者無吸煙史，在收集前1 h內(nèi)沒有進(jìn)食、飲水、飲酒等；沒有生病、服用藥物，尤其1個(gè)月內(nèi)未服用抗生素類藥物；3 d內(nèi)未食用酸奶、益生菌飲料；無齲病、牙周病等口腔疾病患者)，健康成人在進(jìn)食2 h后用清水漱口，口含棉棒10 min左右，用50 mL離心管收集無刺激性唾液．

唾液預(yù)處理：4 ℃ 8 000 r/min離心15 min后取上清液，與PBS等體積混合后，添加終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的蔗糖，過濾除菌后分裝，保存于 -20 ℃ 備用．

1.3.5 變異鏈球菌生物膜模擬及干預(yù)

變異鏈球菌生物膜模擬：高壓滅菌的羥基磷灰石片置于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(每孔中一個(gè)圓盤，圓盤不可接觸孔壁)，用上述預(yù)處理好的唾液(1.0 mL/孔)37 ℃包衣4 h后，1.0 mL PBS漂洗2次．變異鏈球菌在37 ℃接種兩代至生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，5 000 r/min 離心10 min，棄上清液，PBS洗滌2次，懸浮于1.0 mL預(yù)處理的唾液中，37 ℃ 40 r/min 厭氧培養(yǎng)1 h后，置于37 ℃厭氧培養(yǎng)罐中靜置培養(yǎng) 24 h 形成生物膜．

羥基磷灰石載體干預(yù)：向100 mg吸附右旋糖酐酶的羥基磷灰石載體中加入1.0 mL PBS，懸浮載體后加入模擬好的變異鏈球菌生物膜羥基磷灰石圓片上，40 r/min厭氧培養(yǎng)1 h后，PBS洗滌2～3次，洗去羥基磷灰石載體．

1.3.6 激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)生物膜

生物膜樣本使用LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit進(jìn)行染色，加入1.0 mL PBS后，再加入混合染料2 μL，染色時(shí)間為10 min，染色后再用PBS漂洗2～3次，洗去染料．

將羥基磷灰石圓片固定在激光共聚焦顯微鏡平臺(tái)上，采用488 nm Ar/Ar-Kr激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行共聚焦成像．使用40×物鏡觀察，對(duì)羥基磷灰石片上的中間區(qū)域5 mm范圍進(jìn)行掃描，選擇至少3個(gè)獨(dú)立且具有代表性的位置進(jìn)行測(cè)量，通過圖像處理軟件TCS SP8 STED 3X量化和表征生物膜的三維結(jié)構(gòu)．

2 結(jié)果

2.1 吸附和固定化條件

2.1.1 最佳載體量和吸附時(shí)間

為了探索不同量的羥基磷灰石載體在不同時(shí)間條件下的最佳吸附效率．固定右旋糖酐酶體積為 2 mL (酶質(zhì)量濃度為15 mg/mL)，在離心管中分別添加10，50，100 mg羥基磷灰石，在37 ℃水浴中分別吸附1，8，16，24 h，比較不同量的羥基磷灰石在不同時(shí)間條件下的吸附率，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次．

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，100 mg羥基磷灰石在 2 mL 酶液中吸附1，8，16 h的吸附率均高于 10 mg 和50 mg羥基磷灰石在2 mL酶液中吸附率，并且在1 h時(shí)100 mg羥基磷灰石吸附率最高，達(dá)到23.9%，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，吸附效率逐漸下降，可能是由于時(shí)間延長(zhǎng)，羥基磷灰石上吸附的蛋白又出現(xiàn)了脫落．

圖1 不同質(zhì)量的羥基磷灰石在不同時(shí)間條件下的吸附率

2.1.2 離子強(qiáng)度對(duì)吸附率的影響

研究[16]表明，離子強(qiáng)度的變化會(huì)改變羥基磷灰石的ζ電位，從而影響其對(duì)蛋白的吸附量．因此，實(shí)驗(yàn)中分別添加終濃度為0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30 mol/L的NaCl，探索不同離子強(qiáng)度下羥基磷灰石對(duì)右旋糖酐酶的吸附率．

圖2 不同離子強(qiáng)度下羥基磷灰石對(duì)右旋糖酐酶的吸附率

如圖2所示，在NaCl終濃度為0.05，0.10，0.15，0.20 mol/L時(shí)，吸附率分別為26.6%、25.6%、27.7%和26.8%，均高于直接吸附的最大吸附率23.9%．當(dāng)NaCl終濃度為0.25，0.30 mol/L 時(shí)，吸附率為22.0%和20.6%．這與文獻(xiàn)[13～14]報(bào)道的一致，離子強(qiáng)度對(duì)羥基磷灰石的Zeta電位的影響具有雙重性，低濃度的離子強(qiáng)度有利于其形成雙電層，增加羥基磷灰石表面的吸附作用，高離子強(qiáng)度又壓縮了雙電層，從而抑制了羥基磷灰石表面的吸附作用．

2.1.3 戊二醛體積分?jǐn)?shù)和交聯(lián)時(shí)間

戊二醛作為一種廣泛使用的蛋白質(zhì)交聯(lián)劑，能夠使蛋白質(zhì)緊密的交聯(lián)在載體上，相比普通的化學(xué)吸附，其更加牢固，且不容易脫落[17]．實(shí)驗(yàn)中探索了100 mg羥基磷灰石在體積分?jǐn)?shù)分別為0.02%、0.10%、0.20%、0.25%的戊二醛溶液中分別交聯(lián)2 h和8 h，隨后再交聯(lián)右旋糖酐酶，比較不同體積分?jǐn)?shù)的戊二醛及交聯(lián)時(shí)間對(duì)羥基磷灰石固定化右旋糖酐酶效率的影響．

結(jié)果如圖3所示，羥基磷灰石在不同時(shí)間、不同體積分?jǐn)?shù)的戊二醛交聯(lián)下，對(duì)右旋糖酐酶的固定化率影響不大．當(dāng)戊二醛體積分?jǐn)?shù)為0.02%，交聯(lián)時(shí)間為2 h的固定化率達(dá)到最高，為17.6%，而其余體積分?jǐn)?shù)的戊二醛及交聯(lián)時(shí)間下固定化效率則略低于此值，并且最高的固定化率低于直接吸附的吸附率，可能是羥基磷灰石表面的羥基數(shù)較少，導(dǎo)致交聯(lián)上去的蛋白量較低．

2.2 羥基磷灰石吸附和固定化右旋糖酐酶酶活比較

為了進(jìn)一步比較羥基磷灰石吸附和固定化右旋糖酐酶的效果，對(duì)吸附和固定化右旋糖酐酶的羥基磷灰石載體的酶活力進(jìn)行測(cè)定．因?yàn)楦淖冸x子強(qiáng)度與直接吸附右旋糖酐酶的效率相差不大，所以分別比較了100 mg羥基磷灰石直接吸附法和戊二醛交聯(lián)法的酶活．

圖3 不同體積分?jǐn)?shù)戊二醛及交聯(lián)時(shí)間 下羥基磷灰石對(duì)右旋糖酐酶的固定化率

采用直接吸附法，則100 mg羥基磷灰石吸附1 h的酶活力最高，為0.32 U/mg(圖4a)．使用戊二醛交聯(lián)法，不同體積分?jǐn)?shù)的戊二醛、不同時(shí)間交聯(lián)，固定化右旋糖酐酶后的酶活力相差不大，最高為0.35 U/mg，最低為0.33 U/mg(圖4b)．

圖4 羥基磷灰石吸附和固定化右旋糖酐酶的酶活

2.3 吸附和固定化右旋糖酐酶的載體對(duì)生物膜的影響

為了進(jìn)一步驗(yàn)證吸附和固定化右旋糖酐酶的羥基磷灰石對(duì)變異鏈球菌生物膜的影響，在羥基磷灰石圓片上模擬了變異鏈球菌生物膜模型，使用吸附和固定化右旋糖酐酶的羥基磷灰石載體對(duì)變異鏈球菌生物膜進(jìn)行干預(yù)．

結(jié)果如圖5所示，通過激光共聚焦顯微鏡對(duì)羥基磷灰石圓片中5 mm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，吸附右旋糖酐酶的羥基磷灰石(圖5b)和固定化右旋糖酐酶的羥基磷灰石(圖5c)與未干預(yù)對(duì)照組(圖5a)相比，生物膜的結(jié)構(gòu)完整性遭到了破壞，生物膜的菌體之間更加稀疏，說明吸附和固定化右旋糖酐酶的羥基磷灰石載體能夠有效清除變異鏈球菌生物膜的完整性．

(a)未干預(yù)對(duì)照組 (b)吸附右旋糖酐酶的羥基磷灰石 (c)固定化右旋糖酐酶的羥基磷灰石圖5 吸附右旋糖酐酶的羥基磷灰石對(duì)變異鏈球菌生物膜的影響

3 討論

羥基磷灰石對(duì)右旋糖酐酶具有較好的吸附效果，最佳吸附比為1∶20(m/V)，吸附時(shí)間為1 h，吸附率可達(dá)23.9%．通過戊二醛交聯(lián)進(jìn)行固定化，固定化率低于吸附率，可能是由于羥基磷灰石表面的羥基數(shù)有限，不能固定較多的右旋糖酐酶．

羥基磷灰石對(duì)右旋糖酐酶的固定化率低于吸附率，但是固定化酶酶活與直接吸附的酶活相當(dāng)，可能是通過固定化后，酶活性中心的構(gòu)象發(fā)生了略微變化，導(dǎo)致其更加容易與底物分子接觸，從而酶活有所提高．也可能是由于羥基磷灰石載體吸右旋糖酐酶的數(shù)量較多，從而壓縮了酶的生存空間，其與底物接觸的空間位阻增加，因此酶活并未出現(xiàn)顯著提高．

右旋糖酐酶通過水解變異鏈球菌生物膜基質(zhì)葡聚糖的α-1，6糖苷鍵，從而破壞生物膜的結(jié)構(gòu)，阻止其在牙齒表面附著[18]．羥基磷灰石可以通過封堵牙小管本質(zhì)[19]，促進(jìn)牙釉質(zhì)表面再礦化，增強(qiáng)釉質(zhì)的抗齲能力[20]．將羥基磷灰石吸附或固定化右旋糖酐酶后，不僅能增加抗齲力，而且能夠顯著抑制口腔致齲菌對(duì)牙齒的附著，降低牙菌斑，預(yù)防齲病和牙周?。芯縖7]表明，將具有防齲作用的NaF和右旋糖酐酶聯(lián)合使用也能顯著抑制變異鏈球菌生物膜的形成．羥基磷灰石與氟化鈉的再礦化和預(yù)防脫礦作用并沒有顯著差別[21-22]，但是NaF不能吸附或固定化右旋糖酐酶，而羥基磷灰石由于具有多孔性質(zhì)，不僅能吸附或固定化右旋糖酐酶，而且具有一定的緩釋性能，能夠保證右旋糖酐酶持續(xù)發(fā)揮作用[23]．

目前，牙膏中應(yīng)用較多的生物酶主要為溶菌酶、葡聚糖酶和右旋糖酐酶等． 溶菌酶通過水解細(xì)菌細(xì)胞壁，從而抑制致病菌；葡聚糖酶通過切斷α-1，6糖苷鍵來分解牙菌斑．將葡聚糖酶添加到牙膏中能夠較好地去除牙菌斑[24]，如溶菌酶牙膏能有效地抑制口腔致病菌[25]，海藻酸鈉微球包埋右旋糖酐酶能有效地抑制變異鏈球菌生物膜的形成[26]．通過在牙膏中添加復(fù)合酶和功效成分，可以使其具有多重功效，如FE生物酶復(fù)合牙膏，同時(shí)添加了溶菌酶、蛋白水解酶和氯化鍶，不僅能增強(qiáng)抑菌作用，還具有抗牙本質(zhì)敏感作用[27]．隆力奇DL復(fù)合酶牙膏，同時(shí)添加了溶菌酶和葡聚糖酶，不僅能夠降低變異鏈球菌的粘附性，還能有效抑制伴放線桿菌、牙齦卟啉單胞菌和黏性放線菌[28]．

吸附和固定化右旋糖酐酶的羥基磷灰石載體都能夠較好地消除變異鏈球菌生物膜的完整性，這將為更好地消除牙菌斑生物膜、促進(jìn)牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)再礦化、提高釉質(zhì)的抗齲力提供一種可行的方法．但是，目前僅做了單一酶的吸附和固定化，后續(xù)工作還將嘗試使用多種酶，以期賦予其更多的功效．