周 艷，儲丹丹

（南通大學1 醫(yī)學院生化與分子生物學系，2 教育部/江蘇省共建神經再生重點實驗室/神經再生協(xié)同創(chuàng)新中心，南通 226001)

阿爾茨海默?。ˋlzheimer′s disease，AD)，俗稱老年性癡呆，是一種中樞神經系統(tǒng)變性病[1]。AD 起病隱襲，病程呈慢性進行性，是老年期癡呆最常見的一種類型；主要癥狀為漸進性記憶障礙、認知功能障礙、人格改變及語言障礙等神經精神癥狀，嚴重影響社交、職業(yè)與生活功能。目前全球有5 000 萬人罹患AD，到2050 年預計患者總數將增加到1.52 億。中國AD 患者人數居世界之最，到2050 年將超過2 000 萬。可以預見在不久的將來，AD 將是中國醫(yī)療保健系統(tǒng)、家庭和社會的沉重負擔。

AD 是多因素相關疾病，老化是其最主要的病因。AD 分為散發(fā)性和家族性，擁有共同的病理特征:患者大腦中神經元外大量β-淀粉樣蛋白（β-amyloid protein，Aβ)沉淀形成的老年斑、神經元內大量的異常過度磷酸化的tau 聚集形成的神經元纖維纏結（neurofibrillary tangles，NFTs)和廣泛的神經元退化。一直以來在AD 研究領域都是以Aβ 為靶標作為藥物開發(fā)的重點，遺憾的是該領域臨床試驗失敗率高達99.6%[2]，所以尋找新的靶點非常必要。NFTs 的聚集是AD 另一病理特征，其數量和患者的癡呆程度呈明顯正相關，被認為是AD 患者神經元纖維退化的病理基礎[3]。研究tau 病理發(fā)生、發(fā)展的分子機制，開發(fā)以tau 為靶標的AD 藥物，已成為當今AD 領域的研究熱點。

1 Tau 蛋白的結構與功能

Tau 是大腦中與微管相關的主要蛋白質之一。人類tau 蛋白由位于染色體17q21.31 上的微管相關蛋白tau（microtubule associated protein tau，MAPT)基因編碼。MAPT 基因由16 個外顯子組成。在大腦中，外顯子2、3 和10 的可變剪接產生6 種tau 亞型，包含0（0N)，1 個（1N)或2 個（2N)N 末端插入片段以及3 個（3R-tau)或4 個（4R-tau)C 末端微管結合重復序列[4]。人腦tau 的最長亞型由441 個氨基酸（2N4R，tau441)組成，分子質量為45.85 ku。Tau441包含4 個結構域，從N 端開始依次為:（1)從微管表面突出的N 末端突出結構域；（2)負責與SH3 結構域相互作用的脯氨酸富集區(qū)；（3)微管結合結構域，促進微管蛋白組裝和tau 聚集；（4)C 末端[5]。

正常腦中tau 蛋白的功能是與微管蛋白結合促進其聚合形成微管，維持微管穩(wěn)定性，降低微管蛋白分子的解離，并誘導微管成束[6]。4R-tau 比3Rtau 具有更大的微管親和力，在促進微管組裝方面更有效。在AD 腦中，病理性tau 會從微管上脫離，使微管對katanin 之類的切割蛋白敏感，從而穩(wěn)定性急劇下降。Tau 蛋白還可調節(jié)沿軸突的細胞內運輸；或存在于細胞核中，應激反應時可能保護DNA 的完整性[4]。另外，tau 在少突膠質細胞和星形膠質細胞中也有表達[7]。然而，AD 中的tau 病理主要發(fā)生于神經元。

2 Tau 在AD 中的病理變化

隨著AD 病程的進展，異常過度磷酸化tau 聚集形成的NFTs 呈現(xiàn)特定的進行模式，即Braak 分級[8-9]。早期tau 病理主要在腦干藍斑核和內嗅皮層移行區(qū)（Braak Ⅰ～Ⅱ級)，而后進展到包括海馬在內的邊緣系統(tǒng)（Braak Ⅲ～Ⅳ級)，最后擴展到廣泛的新皮層區(qū)域（Braak Ⅴ～Ⅵ)[8]。AD 腦內tau 聚集信號的進展模式與Braak 分級基本一致[9]。

AD 患者腦內tau 病理總是沿解剖聯(lián)系路徑進展的特定模式促使tau 朊樣聚集和傳播假設的提出:病理性tau 以自身為模板，誘導正常tau 蛋白發(fā)生構象改變，從而更易聚集并誘導周邊更多tau 發(fā)生病理性改變，致使tau 病理向更廣泛的腦區(qū)傳播[10]。20 多年前即發(fā)現(xiàn)從AD 患者腦中分離的異常過度磷酸化的寡聚體tau 能獵獲正常的tau，這種獵獲依賴于tau 的磷酸化，并呈現(xiàn)不飽和性[11]。從2009 年開始，研究[10]發(fā)現(xiàn)病理性tau（特別是寡聚體tau)作為毒性種子，在體外和動物體內均能誘導正常的tau 聚集形成成束的纖維并在腦內傳播，證實病理性tau具有朊樣特性。

2.1 Tau 翻譯后修飾與tau 病理 作為一種親水性蛋白質，tau 包含許多絲氨酸/蘇氨酸、脯氨酸、精氨酸/賴氨酸/組氨酸殘基，易于磷酸化。除了磷酸化，tau 蛋白還含有多種翻譯后修飾，包括截斷、糖基化、泛素化、硝基化、甲基化、脂過氧化、磺酰化和乙?；萚4]。翻譯后修飾的失調與tau 病理的發(fā)生和朊樣聚集傳播密切相關。

2.1.1 Tau 的過度磷酸化 Tau 是一種磷酸化蛋白。Tau441 含有80 個絲氨酸/蘇氨酸和5 個酪氨酸殘基，這些殘基均有被磷酸化的可能，在AD 中已鑒定出至少40 個絲氨酸/蘇氨酸和2 個酪氨酸磷酸化位點。在AD 腦中，tau 的磷酸化水平提高了2～3 倍[12]。AD 腦中常見的tau 各種異常磷酸化位點，包括Thr181，Ser195，Ser198，Ser199，Ser202，Thr205，Thr212，Ser214，Thr217，Thr231，Ser235，Ser262，Ser353，Ser396，Ser400，Ser404，Ser409和Ser422等[2]。

Tau 的異常磷酸化是AD 和其他tau 病變疾病引起病理的關鍵因素[12]。根據磷酸化狀態(tài)和溶解度，AD 腦中的tau 可分為:非過磷酸化的正常功能性tau（AD-tau)、異常過度磷酸化tau（AD P-tau，約40%以寡聚體形式存在于細胞質)和tau 聚合形成的不溶性雙螺旋絲（paired helical filaments，PHF-tau)。正常tau 蛋白具有“回形針”結構，其中N 和C 末端在微管結合域上方折疊以防止蛋白質自聚集[5]。Tau 的過度磷酸化改變了蛋白質的電荷和構象，暴露微管結合域，從而導致tau 蛋白的聚集，使其正常的促進微管組裝功能受損[12]。AD P-tau 還能夠獵獲其他與微管相關的蛋白質，如微管相關蛋白（microtubule-associated proteins，MAP)1 和MAP2，進一步破壞微管的組裝。不溶性PHF-tau 則對微管組裝沒有影響，表明異常過度磷酸化的tau 寡聚體而非不溶性高聚體具有細胞毒性。用蛋白磷酸酶對AD P-tau 進行去磷酸化可恢復tau 體外促進微管裝配的生物學活性，并減少體內的tau 病理，進一步表明異常過磷酸化在tau 病理中至關重要[13]。除了對微管穩(wěn)定性有影響外，tau 的過度磷酸化還可能影響蛋白質降解、截斷和聚集[14]。

Tau 在體內被脯氨酸指導的蛋白激酶[如糖原合酶激酶-3β（glycogen synthase kinase3β，GSK-3β)，細胞周期蛋白依賴性激酶5（cyclin-dependent kinase 5，CDK5)，雙特異性酪氨酸磷酸化調節(jié)激酶1A（dualspecificity tyrosine phosphorylation regulated kinase，DYRK1A)]和非脯氨酸指導的蛋白激酶（如鈣離子鈣調素依耐性蛋白激酶Ⅱ、蛋白激酶A、酪蛋白激酶1和微管親和力調節(jié)激酶) 等磷酸化。在AD 腦中，這些激酶的活性或表達顯著上升[4]。Tau 去磷酸化是由蛋白磷酸酶，主要是蛋白磷酸酶2A（protein phosphate 2A，PP2A)調節(jié)，占人腦中tau 磷酸酶活性的70%以上[15]。在AD 大腦中，tau 磷酸酶活性降到一半，加劇tau 的異常過度磷酸化[15]。因此，tau 激酶和磷酸酶活性之間的不平衡被認為是tau 過度磷酸化的根源。

2.1.2 Tau 的截斷 作為一種內在無序的蛋白質（也稱為天然未折疊的蛋白質)，tau 對蛋白酶消化敏感，在體外和體內均可被鈣蛋白酶和其他蛋白酶裂解。Tau 的截斷會破壞蛋白質的“回形針”結構并增加其過度磷酸化和形成聚集體的傾向[16]。已鑒定出tau 在AD 腦的NFTs 中至少有3 種特異性截斷（Asn368、Glu391 和Asp421)，且與Braak 分級的進展相關。在不同的tau 病理小鼠模型中也發(fā)現(xiàn)了類似的截斷[14]。

與NFTs 的C 端截斷不同，tau 蛋白的N 端截斷體與過度磷酸化的高分子質量tau 寡聚物相關[17]。本課題組[17-18]研究發(fā)現(xiàn)，AD 腦中過度磷酸化的高分子質量tau 聚集體缺少N 端部分，提示tau 發(fā)生了N端截斷。截斷tau 蛋白的N 端150 個或230 個氨基酸（amino acid，a.a.)可增強其位點特異性磷酸化、自我聚集及被AD P-tau 誘導的聚集，如僅截斷前50個a.a.則無此效果。截斷tau 蛋白C 端的50 個a.a.同樣會增加tau 的位點特異性磷酸化，促進tau 自身聚集、被AD P-tau 捕獲并進入聚集狀態(tài)，但僅截斷C端20 個a.a.不會產生上述效應。對tau 各種截斷體的系統(tǒng)性分析表明，tau151-391 展現(xiàn)最強的病理活性[19]。因此，抑制tau 截斷是抑制AD 和相關tau 蛋白病中tau 病理的潛在方法。

2.1.3 Tau 的O-連N-乙酰氨基葡萄糖（O-linked Nacetyglucosamine，O-GlcNAc)修飾 糖基化是將寡糖共價連接到蛋白質側鏈的一種酶促過程。包括半乳糖、甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖和唾液酸在內的幾種寡糖可修飾人腦中的tau。通常，tau 被O-GlcNAcylated 修飾（單糖β-N-乙?；咸前沸揎椊z氨酸或蘇氨酸殘基的羥基)[20]。然而，來自AD 腦的tau 通過N-鍵異常糖基化（聚糖連接到天冬酰胺殘基的酰胺基)[21]。AD 腦中，tau 的糖基化可能先于磷酸化，促進磷酸化發(fā)生[22]。相反，tau 的O-GlcNAcylation 通過競爭蛋白質上的磷酸化位點，使tau 磷酸化降低[20]。

2.1.4 Tau 的乙?；?Tau 被組蛋白乙?；D移酶p300 或CREB 結合蛋白乙酰化，并被組蛋白去乙酰化酶和組蛋白脫乙?；? 脫乙?；au 還具有內在的乙酰轉移酶活性，可以進行自乙?；痆4]。乙酰化修飾位點不同產生不同的tau 病理。例如，Lys274，Lys280，Lys281和Lys369的乙?；瘯p害tau 功能，并在AD 腦中上調[23]。相比之下，KXGS 模體（motif)中的Lys259，Lys290，Lys321和Lys353通常被乙?；苑乐箃au磷酸化和聚集，在AD 腦中這些位點的乙?；浇档蚚24]。

2.1.5 Tau 的泛素化 作為天然非折疊的蛋白質，正常的tau 降解可通過ATP/泛素非依賴性途徑。盡管如此，tau 還可以被各種泛素連接酶泛素化，這些酶包括Hsc70 相互作用蛋白的C 端，腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF)受體相關因子6 和促軸蛋白/MARCH7[25-26]。質譜分析顯示，從AD 腦分離出的可溶性PHF-tau 在微管結合域的Lys254、Lys311和Lys353殘基處泛素化，PHF 主要是單泛素化的而不是多泛素化的，這使其不足以誘導泛素-蛋白酶體系統(tǒng)介導的tau 聚集體的蛋白水解[27]。因此，增強tau 的多泛素化和降解可能是對抗tau 病理的潛在方法。

Tau 蛋白除了上述的翻譯后修飾外，還能被小的泛素樣修飾蛋白（small ubiquitin-like modifier protein，SUMO)進行翻譯后修飾，即SUMO 化；或發(fā)生糖化、硝基化等，這些修飾與tau 病理的關聯(lián)尚需更多深入研究[4]。

2.2 Tau 的聚集 天然非折疊的tau 單體通常具有無規(guī)則卷曲結構，幾乎不會形成聚集體[28]。部分折疊后，tau 蛋白則更多地形成β 折疊以助于tau 單體間的相互作用。Tau 微管結合重復序列上的兩段六肽基序（275VQIINK280和306VQIVYK311)有促使其蛋白構象向β 折疊轉變的傾向[6]。一旦觸發(fā)了tau 單體的部分折疊，tau 便從穩(wěn)定不活潑形式轉變?yōu)榫哂写呋钚缘摹胺N子”[29]，引發(fā)tau 依次聚集形成二聚體、可溶性低聚物、不溶性PHF 和最終NTFs。Tau 聚集成PHF 和NFTs 已在AD 和其他相關的神經退行性疾病中發(fā)現(xiàn)，其6 種亞型都可以在AD 腦的PHF中檢測到[30]。

Tau 過度磷酸化和截斷影響其聚集。首先，過度磷酸化可通過多種方式促進tau 聚集。（1)過度磷酸化的tau 從微管中分離出來，可為聚集提供更多的游離蛋白質。（2)過度磷酸化的tau 能以朊樣方式將更多的正常tau 招募到聚集體中。（3)過度磷酸化的tau 可以改變tau 的降解和截斷，間接影響tau 聚集。全長tau 蛋白僅僅過度磷酸化并不足以誘導不溶性聚集物的形成；只有在同時存在截斷的情況下，過度磷酸化tau 才能被誘導形成聚集體[31]。而單純的tau截斷足以誘導tau 過度磷酸化和聚集體形成[16]。這些證據[32]表明，tau 的截斷對于tau 聚集體的形成至關重要，其原因可能是截斷暴露了微管結合重復序列，使單體間更容易接觸。

2.3 病理性tau 的傳播 病理性tau 傳播包括毒性種子的攝取和釋放，主要包含以下步驟:（1)細胞攝取病理性tau 種子；（2)以tau 種子為模板誘導細胞內正常tau 蛋白聚集；（3)新的病理性tau 種子的分泌；（4)病理性tau 種子跨細胞轉移。

目前認為，細胞攝取病理性tau 種子的可能機制有:硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycans，HSPG)介導的內吞作用、外泌體融合、受體介導的內吞作用和巨胞飲[33]。其中，HSPG 介導的內吞作用研究較為深入。HSPG 覆蓋所有細胞，參與介導細胞與其他細胞、信號分子和細胞外基質的相互作用。Tau 單體或聚集體可直接與細胞表面的HSPG 結合。HSPG 合成下降、干擾HSPG 硫酸化及裂解神經元的肝素均可阻止細胞攝取tau 單體或聚集體。另外，糖胺聚糖肝素等類似物可以掩蓋tau 的HSPG 結合位點，從而阻止了其與細胞表面結合，抑制細胞攝取和傳播病理性tau[33]。

被細胞攝取的病理性tau 種子以自身為模板誘導細胞內正常tau 蛋白聚集，形成新的病理性tau，并向其他細胞轉移。Tau 聚集體直接釋放、或者細胞膜的微小缺失，都可能會導致細胞外tau 聚集體結合到相鄰細胞的表面并觸發(fā)tau 聚集體的吸收。盡管tau 不包含信號肽，但它在生理條件下能夠以單體和（或)截短的非磷酸化形式分泌，其釋放的機制和功能尚不十分清楚。Tau 聚集體可以通過細胞膜破裂釋放，胞吐作用，外泌體或通過與鄰近細胞膜融合進行傳播[34]。Tau 截斷和過磷酸化有利于其分泌[35-36]。神經元活性的增加也可在體外刺激tau 釋放，促進體內tau 病理傳播[34]。在小鼠模型中，已證實tau 蛋白存在跨神經元運動[37]。另外，小膠質細胞同時吸收可溶和不可溶的tau，并可能通過外泌體促進tau 病理的播散[38]。這些結果表明，小膠質細胞介導的神經炎癥也可能是tau 病理學傳播的一種方式。

3 基于tau 的AD 療法

迄今為止，美國食品和藥物管理局僅批準了5種處方藥用于治療AD。這些藥物中的3 種（多奈哌齊、加蘭他敏和利凡斯的明)是膽堿酯酶抑制劑，可防止腦內乙酰膽堿的分解。第4 種藥物美金剛胺是一種非競爭性的N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑。第5 種藥物是緩釋多奈哌齊和美金剛的組合。然而，這些藥物對癥狀的改善有限，且都不能阻止或減緩AD 的發(fā)展。隨著對AD 中tau 病理發(fā)生發(fā)展機制了解的增多，越來越多的基于tau 病理機制、旨在減緩或阻止AD 進展的治療方法得到了深入開發(fā)。

3.1 阻斷tau 釋放 通過阻斷病理性tau 聚集體從細胞中的釋放可以阻止跨細胞的傳播。一方面，這個過程可能是由于細胞死亡或局部膜破裂而引發(fā)的。另一方面，如果蛋白質聚集體是非常規(guī)釋放到細胞外，這在理論上是可以治療的。目前，tau 釋放機制還不清晰，尚無特定抑制劑可用于治療AD。

3.2 抑制細胞攝取 目前已經提出的神經元攝取tau 聚集體的幾種方式，多數機制尚不明確。以HSPG 介導tau 的結合和攝取為例，利用靶向HSPG的小分子抑制劑或結合tau 并抑制其與細胞表面結合的分子均可作為AD 潛在的治療方法[33]。另外，功能性HSPG 需要在分泌途徑中進行酶介導的成熟，因此相應的酶也可能成為有效靶點。

3.3 抑制tau 的過度磷酸化 Tau 的過度磷酸化是病理播種的基礎，抑制其過度磷酸化可成為治療方法之一。Tau 被激酶（如cdk5、GSK-3β、ERK 和Dyrk1A)磷酸化；其磷酸酶主要是PP2A，70%以上的tau 去磷酸化由PP2A 催化[15]。在小鼠模型中，一種針對GSK-3β 的特異性抑制劑氯化鋰和cdk5，ERK1、GSK-3β非特異性抑制劑K252a，可降低不溶性和過度磷酸化的tau[39]。還有抑制GSK-3β 的一些小分子化合物，如SRN-003-556、CHIR-98014SB 216763 和SB 216763目前處于臨床前階段。靶向PP2A 的幾種藥物目前正在進行開發(fā)或臨床評估[2]。

3.4 免疫療法 靶向tau 病理的一種有前途的方法是免疫治療，即用抗體結合病理性tau 蛋白并促進其清除。免疫療法的原理主要基于兩條途徑:首先，tau病理主要影響的腦細胞——神經元，可以從細胞外液中提取抗體。被細胞吸收的抗體有利于細胞內病理性tau 的清除。其次，病理性tau 蛋白已證明可從細胞中釋放出來并被鄰近的細胞吸收?？贵w則可能在細胞外與病理性tau 結合并阻止其擴散。目前，超過10 個tau 蛋白靶向候選藥物正在進行臨床試驗[2]。

免疫治療策略有主動和被動兩種，各有利弊。主動免疫策略是給機體提供目標蛋白和佐劑以激發(fā)免疫反應。使用這種策略，機體自發(fā)產生抗體，效果持續(xù)時間長。然而，在AD 患病情況下觸發(fā)免疫反應，面臨較大的不良反應風險。被動免疫策略則直接給予患者tau 特異性抗體，這種方法會降低不良反應風險，但效應不夠持續(xù)。集中施用抗體可以有效清除轉基因小鼠腦內的病理性tau 蛋白。有兩種抗體作用于tau 蛋白氨基末端，可在體外促進小膠質細胞攝取tau 蛋白抗原抗體混合物，進而清除tau 聚集體。另一種抗體靶向識別tau 微管結合重復序列，直接抑制神經元攝取tau 聚集體，但不會影響小膠質細胞的攝取[40]?？傮w而言，不同的抗tau 抗體有不同機制，針對大小不同的聚集體產生不同的清除效果。

3.5 細胞內清除 長期以來，提高tau 聚集體的清除率也是治療的一個目標[41]。異?；蝈e誤折疊的蛋白質和衰老、受損細胞成分主要經由泛素蛋白酶體途徑和自噬溶酶體途徑清除。泛素蛋白酶體途徑主要降解細胞短壽命蛋白，而自噬溶酶體途徑則消化細胞質中的長壽命胞質蛋白和受損的細胞器。眾多研究[42-43]證明泛素蛋白酶體途徑和自噬溶酶體途徑均參與tau 的降解?？扇苄詔au 和聚集的tau 都可以通過自噬而降解。自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤可導致細胞tau 蛋白積累，促進tau 蛋白的聚集而產生毒性作用[44]，而用自噬的激活劑雷帕霉素則減少了tau 的聚集，改善了其病理變化[45]。然而，長期服用自噬激活劑給AD 患者帶來的不良反應尚待觀察。

反義寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASOs)和RNA 干擾也是重要的清除細胞內毒性蛋白的方法。ASOs 可治療與細胞內蛋白聚集相關的多種神經退行性疾病[46]。以tau 為靶標的ASOs 可降低小鼠tau 的病理和傳播活性[47]。

3.6 抑制細胞內播種 進入細胞后，病理性聚集的tau 充當正常tau 蛋白的模板，誘導毒性寡聚體形成。直接抑制tau 毒性寡聚體可以采用多種機制，包括穩(wěn)定單體、抑制原纖維生長、加速聚集以形成聚集度更大而毒性更小的組件、減少原纖維斷裂或基于細胞內tau 聚集機制的其他新方法。例如，熱休克蛋白70/40 伴侶系統(tǒng)可以分解原纖維，從而阻止其繼續(xù)生長[48]。然而，哪些亞型可成為治療的靶標以抑制相應蛋白聚集尚需要深入研究。

自從1986 年首次發(fā)現(xiàn)tau 在PHF 中異常磷酸化以來，tau 在AD 腦中發(fā)生的許多病理變化不斷被發(fā)現(xiàn)，主要包括過度磷酸化、截斷、聚集、播種和擴散[49]。Tau 低聚物而非纖維狀聚集體是破壞突觸功能、導致神經元死亡和tau 病理發(fā)展的細胞毒性物質。因此，在形成PHF 和NFTs 之前的早期，檢測和清除有毒的tau 低聚物將成為預防和延緩AD 病程發(fā)展的重要途徑。