仲雪婷，徐 鴻，李鑫鑫，孫若嘉，付文英，李佳鵬，楊蓮蓮，吳酬飛，張立欽，王占旗

(1.湖州師范學院 生命科學學院，浙江 湖州 313000；2.湖州師范學院 浙江省媒介生物學與病原控制重點實驗室，浙江 湖州 313000)

鋁(Al)是地殼中含量最豐富的金屬元素，也是土壤無機礦物的主要元素[1].在酸性條件下，特別是當pH低于5.5時，鋁會從化合態(tài)轉變?yōu)殡x子態(tài)釋放到土壤溶液中[2].此時，即使在微摩爾(μM)濃度下，鋁離子(Al3+)也會對植物造成傷害，抑制植物根的生長，影響植物對水分和養(yǎng)分的吸收，從而增加植物對其它類型脅迫的敏感性[3].因此，鋁脅迫被認為是威脅全球作物生產(chǎn)和糧食安全的主要環(huán)境限制因素之一[4-5].

脂氧合酶(LOX，EC 1.13.11.12)是一種非血紅素含鐵雙加氧酶，具有催化多不飽和脂肪酸雙加氧生成相應的過氧化物能力[6].LOX結構域是由5個保守的組氨酸(His)殘基形成的與鐵原子結合相關的功能結構[His-(X)4-His-(X)4-His-(X)17-His-(X)8-His].根據(jù)多不飽和脂肪酸碳原子氧化的位置，植物LOX可分為2個亞家族，即9-LOX和13-LOX[7].LOX廣泛參與植物的生長、發(fā)育，以及生物和非生物的脅迫應答[8-10].

苦蕎是一種被廣泛種植的藥食同源作物，具有較高的經(jīng)濟和營養(yǎng)價值[11].近年來，隨著種植規(guī)模的不斷擴大和極端天氣的肆虐，苦蕎受到了寒冷[12]、干旱[13]、高溫[14]等非生物脅迫的嚴重危害.然而，苦蕎對鋁脅迫的響應機制卻很少受到關注.本研究通過生物信息學方法系統(tǒng)地鑒定苦蕎LOX基因家族，分析其染色體定位、進化關系和組織表達模式，并進一步利用熒光定量PCR(qRT-PCR)分析苦蕎FtLOX基因在鋁脅迫條件下的表達水平，最終鑒定出6個鋁響應的FtLOX基因，其中FtLOX6、FtLOX8和FtLOX9可能在苦蕎鋁脅迫應答中起著重要作用.

1 材料與方法

1.1 FtLOX基因的鑒定

苦蕎基因組序列下載自Tartary Buckwheat Genome Project(http:∥mbkbase.org/Pinku1)[11].根據(jù)擬南芥、水稻和番茄LOX的蛋白序列，利用HMMER軟件(v.3.2.1)[15]構建LOX蛋白的隱馬爾可夫模型(HMM)，并檢索苦蕎全蛋白質數(shù)據(jù)庫.通過InterPro數(shù)據(jù)庫(http:∥www.ebi.ac.uk/interpro)進一步分析在苦蕎候選LOX蛋白中是否含有保守的結構域PLAT/LH2(IPR001024)和LOX(IPR036226)[16]，去除不包含PLAT/LH2和LOX結構域的候選蛋白，其對應的編碼基因即為FtLOX基因家族，并利用pI/Mw工具(https:∥web.expasy.org/compute_pi/)對FtLOX蛋白的等電點(pI)和分子量(MW)進行計算.

1.2 多序列比對和系統(tǒng)進化樹構建

利用MEGA 7.0中的MUSCLE程序進行多序列比對，并采用neighbor-joining(NJ)法和MEGA 7.0[17]進行系統(tǒng)進化樹構建，每個分支抽樣1 000次.

1.3 基因結構分析

基因結構和啟動子數(shù)據(jù)下載自Tartary Buckwheat Genome Project(http:∥mbkbase.org/Pinku1)[11].使用在線工具GSDS 2.0(http:∥gsds.gao-lab.org/)[18]分析基因結構.

1.4 基因染色體定位和進化分析

基因定位數(shù)據(jù)下載自Tartary Buckwheat Genome Project(http:∥mbkbase.org/Pinku1)[11]，并利用TBtools(v.1.045)[19]進行基因定位可視化.串聯(lián)重復和片段重復分析按照Yang[20]和Wang[21]等方法進行.利用DnaSP 6[22]計算重復基因對的Ka、Ks和Ka/Ks值.

1.5 基因組織特異性分析

基因組織特異性分析數(shù)據(jù)下載自RNA-Seq數(shù)據(jù)，主要包括SRR5433734、SRR5433731、SRR5433730、SRR5433732、SRR5006770和SRR5433733[11].苦蕎不同組織的選取按照Liu等[23]的研究方法進行，主要包括根、莖、葉、花、果實和種子等，分析結果利用TBtools(v.1.045)[19]進行基因組織表達可視化.

1.6 鋁脅迫處理

本研究采用苦蕎栽培種“西蕎2號”為實驗材料，種子購于四川省涼山州喬良種業(yè)有限責任公司.首先用1% NaCIO(V/V)對苦蕎種子消毒5 min，滅菌水洗滌8次，再用去離子水在25 ℃的黑暗條件下浸種 12 h；將發(fā)芽的種子轉移到浮漂上，置于0.5 mM的CaCl2溶液(pH 5.5)中，在25 ℃的黑暗條件下培養(yǎng)3 d后將生長一致的苦蕎幼苗置于0.5 mM的CaCl2溶液(pH 4.5)中培養(yǎng)12 h，再將其隨機分組分別置于含有0或50 μM AlCl3的0.5 mM的CaCl2溶液(pH 4.5)中處理6 h；收集根尖(0～1 cm)和基本根(1～2 cm)用于RNA提取.每個處理進行3個生物學重復.

1.7 RNA提取、逆轉錄和qRT-PCR分析

利用試劑盒Plant RNeasy Kit(Qiagen)，按照說明書對樣品總RNA進行提取.利用試劑盒ReverTra Ace qPCR Master Mix(Toyobo)從1 μg總RNA逆轉合成cDNA.在CFX96熒光定量PCR儀(Bio-Rad)上進行qRT-PCR，采用2-ΔΔCT方法計算基因相對表達量，F(xiàn)tH3用作內(nèi)參基因[23].本研究使用的引物見表1.結果顯示為3個生物學重復的平均值±標準差.使用統(tǒng)計軟件(DPS,v15.10)對數(shù)據(jù)進行顯著性分析，P<0.05表示差異具有顯著性[24].

表1 研究中的引物Tab.1 List of primers used in this study

2 結 果

2.1 FtLOX基因家族的鑒定

本研究共鑒定10個FtLOX基因家族成員，根據(jù)染色體位置，將其命名為FtLOX1～FtLOX10(表2).鑒定出FtLOX基因的基因組DNA大小為3 711～8 621 bp，其編碼的FtLOX蛋白大小為732～906 aa，它們的等電點和分子量分別為5.6～7.9和83.1～102.3 kDa(表2).多序列比對分析表明：在FtLOX蛋白中存在一個典型的由38個氨基酸組成的基序[His-(X)4-His-(X)4-His-(X)17-His-(X)8-His][6]，該基序在所有的FtLOX蛋白中是嚴格保守的(圖1A).對這10個苦蕎FtLOXs、6個擬南芥AtLOXs、14個水稻OsLOXs和14個番茄SlLOXs進行系統(tǒng)進化分析，結果表明：FtLOXs可分為9-LOX和Ⅱ型13-LOX兩個亞家族，其中9-LOX包括FtLOX5、-8和-9，Ⅱ型13-LOX包括FtLOX1、-2、-3、-4、-6、-7和-10(圖1B).分析結果還表明：苦蕎FtLOXs與番茄SlLOXs的親緣關系比與擬南芥和水稻LOXs的親緣關系更相近，這與目前建立的高等植物LOX基因間的進化關系一致[8,10,25].

圖1 苦蕎FtLOXs多序列比對和系統(tǒng)進化分析Fig.1 Multiple sequence alignment and phylogenetic analyses of FtLOXs in tartary buckwheat

表2 苦蕎脂氧合酶(FtLOX)基因家族的基因結構和理化特性Tab.2 Structural and physicochemical features of lipoxygenase (LOX)gene family in tartary buckwheat

2.2 FtLOX基因的結構分析

基因家族中基因結構的差異性通常在該基因家族的進化中起著重要作用[26].為進一步獲得FtLOX基因結構與進化的關系，本研究用鄰接法(NJ)構建FtLOX基因家族的系統(tǒng)進化樹，并利用在線工具GSDS 2.0[18]分析FtLOX基因家族的基因結構.如圖2所示，F(xiàn)tLOX家族含有7～10個外顯子，其中FtLOX3的外顯子最少(7個)，F(xiàn)tLOX7的外顯子最多(10個)，且無論它們屬于哪個亞家族，大多數(shù)FtLOX基因的外顯子數(shù)量和大小都是相似的.這表明苦蕎FtLOX的兩個亞家族之間存在相似的進化和擴展進程.

圖2 苦蕎FtLOXs的基因結構和分子進化的關系Fig.2 Molecular phylogenetic and gene structure relationship of FtLOXs in tartary buckwheat

2.3 FtLOX基因的染色體定位和復制分析

為進一步了解FtLOX基因家族在苦蕎基因組上的分布，本研究利用從苦蕎基因組中提取的位置信息對FtLOX基因進行染色體定位分析.如圖3所示，10個FtLOXs可定位到苦蕎的6條染色體上，其中染色體Ft3、Ft5、Ft6、Ft7和Ft8各定位一個FtLOX基因，染色體Ft1定位5個FtLOXs.

本研究還分析了苦蕎FtLOXs的基因復制模式，在苦蕎基因組中共檢測到4個片段重復的FtLOX基因對(80%)和1個串聯(lián)重復的FtLOX基因對(20%)(圖3、表3).這說明片段重復可能是苦蕎FtLOXs進化的主要驅動力.為進一步估算進化日期和隨后的選擇對基因復制的影響，使用DnaSP 6[22]計算其基因對的非同義替換率(Ka)和同義替換率(Ks).前期研究表明：在植物中，Ka/Ks的比值小于0.5，表示片段重復和串聯(lián)重復事件的凈化選擇[25].本研究中4個片段重復(FtLOX1/FtLOX7、FtLOX2/FtLOX3、FtLOX2/FtLOX10、FtLOX3/FtLOX10)和1個串聯(lián)重復(FtLOX3/FtLOX4)的Ka/Ks比值都小于0.5(表3)，說明凈化選擇在苦蕎FtLOX基因進化中起著主導作用.按照Koch、Haubold等[27]的研究方法對這些重復事件的進化時間推算表明，4個片段重復可能發(fā)生在約4 290萬年至9 250萬年前，1個串聯(lián)重復發(fā)生在約4 720 萬年前(表3).

圖3 苦蕎FtLOXs的染色體定位和復制情況Fig.3 Localization and duplication events of FtLOXs in tartary buckwheat

表3 苦蕎FtLOXs重復基因對差異Tab.3 Divergence between duplicated FtLOXs gene pairs in tartary buckwheat

a:Ka/Ks ratio<0.5認為是凈化選擇.

2.4 FtLOX基因的組織表達模式

本研究進一步使用公開的RNA-Seq數(shù)據(jù)[11]分析FtLOXs在苦蕎不同組織(根、莖、葉、花、果實和種子)中的表達模式，結果表明(表4、圖4)：所有的FtLOXs至少在一個組織中表達；6個FtLOX基因(FtLOX3和FtLOX5-9)均能在所有的受試組織中檢測到(FPKM ≥ 1.0)，在莖和葉中能檢測到所有FtLOX基因中有8個基因(FtLOX1、FtLOX3、FtLOX5-10)在根中高水平表達，其中表達水平最高的兩個基因是FtLOX6(FPKM ≥ 92.0)和FtLOX5(FPKM ≥ 68.0);串聯(lián)重復的基因(FtLOX3和FtLOX4)在受試組織中呈現(xiàn)出顯著的不同表達模式，說明它們在功能上是不同的.這些結果符合植物LOX串聯(lián)重復基因的功能進化特性[10].

表4 苦蕎FtLOXs的組織表達模式Tab.4 Tissue expression profiles of FtLOXs

圖4 苦蕎FtLOXs在不同組織中的表達模式Fig.4 Expression patterns of FtLOXs in different tissues of tartary buckwheat

2.5 鋁脅迫下FtLOX基因的表達分析

已有研究表明，LOX基因可能參與植物鋁脅迫的應答[28].本研究利用qRT-PCR技術研究在鋁脅迫下苦蕎根尖和基本根中FtLOX基因的表達譜，結果表明：FtLOX1和FtLOX10在基本根中的表達不受鋁的影響，F(xiàn)tLOX10在根尖中的表達略有增加(圖5中(a)(h)).相反，F(xiàn)tLOX5和FtLOX7在根尖中的表達不受鋁的影響，但在基本根中的表達受到鋁的抑制(圖5中(c)(e)).此外，鋁能夠顯著地誘導FtLOX3、FtLOX6、FtLOX8和FtLOX9在苦蕎根尖和基本根中的表達(圖5中(b)(d)(f)(g))，說明這些FtLOX基因可能在鋁脅迫應答中發(fā)揮重要作用.考慮到FtLOXs在根中的表達模式(表4、圖4)，推測FtLOX8、FtLOX9特別是FtLOX6可能在苦蕎鋁脅迫應答中起著關鍵作用.

注：“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01，n.s.表示不具有顯著性差異.圖5 qRT-PCR分析鋁脅迫下苦蕎FtLOX基因的表達水平Fig.5 qRT-PCR analysis of FtLOX genes expression of tartary buckwheat under aluminum stress

3 討 論

本研究鑒定了苦蕎的LOX基因家族，該家族由10個FtLOX成員組成.根據(jù)擬南芥、水稻和番茄LOX蛋白的氨基酸序列與系統(tǒng)發(fā)育關系，這10個FtLOXs可以分為兩個亞家族，即9-LOX和13-LOX(圖1B).這一結果與之前對其它植物中LOXs的研究結果一致[8,10,25].此外，基因結構分析也支持FtLOXs的這一分類，每個亞家族成員間都有相似的結構域和基因結構(圖2).序列分析表明：所有的FtLOXs都具有保守的植物LOX蛋白結構域和典型的基序，包括一個由38個氨基酸組成的基序[His-(X)4-His-(X)4-His-(X)17-His-(X)8-His](圖1中A)，這個保守基序對高等植物LOX的穩(wěn)定性和酶活性至關重要[8,25].

基因復制事件包括片段重復和串聯(lián)重復，在基因組重排和基因家族的擴增中起著重要作用[21].本研究鑒定到4個片段重復基因對和1個串聯(lián)重復基因對參與FtLOX基因的復制(圖3、表3)，表明片段重復可能是FtLOX基因家族擴增的主要基因復制事件.這一發(fā)現(xiàn)與之前的研究結果一致[11].此外，本研究中片段重復基因對和串聯(lián)重復基因對的Ka/Ks比值都小于0.5，表明凈化選擇在FtLOX基因家族的進化中起主導作用.

研究表明，LOX基因在植物生長、發(fā)育和果實成熟中發(fā)揮著重要作用[9-10]，基因表達模式往往可以提供基因潛在功能的關鍵信息[4].本研究使用公開的RNA-Seq數(shù)據(jù)分析FtLOXs在根、莖、葉、花、果實和種子中的表達水平，結果表明：大多數(shù)FtLOXs在所有受試組織中均有表達(表4、圖4)，說明它們可能在苦蕎的生長和發(fā)育中起重要作用.這一結果證實了先前的報道，LOXs在植物生長和發(fā)育中具有重要功能[8,10].研究還發(fā)現(xiàn)，某些FtLOX基因在特定組織中的表達水平明顯較高，如葉中的FtLOX3和FtLOX4、根中的FtLOX5、根和莖中的FtLOX6，以及葉和花中的FtLOX7(表4、圖4)，說明這些基因在這些組織中可能具有重要功能.

鋁脅迫是威脅全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一個主要問題.盡管苦蕎是一種耐鋁作物，但在生長和發(fā)育過程中也常常受到鋁脅迫的影響[11,29].qRT-PCR分析表明，鋁能夠顯著地誘導FtLOX6、FtLOX8和FtLOX9在苦蕎根尖和基本根中的表達(圖5中(d)(f)(g))，說明這些基因在鋁脅迫應答中可能發(fā)揮了作用.因此，本研究結果有助于闡明LOX基因家族的擴增和進一步分析其在苦蕎鋁抗性中的功能.

4 結 論

本研究在苦蕎全基因組范圍內(nèi)鑒定了10個FtLOX基因，為苦蕎FtLOX基因家族的功能分析提供了重要信息.組織特異性表達分析表明，F(xiàn)tLOX基因可能參與苦蕎營養(yǎng)器官和生殖器官的發(fā)育.qRT-PCR分析表明，鋁脅迫可以顯著地誘導FtLOX3、FtLOX6、FtLOX8和FtLOX9基因的表達，抑制FtLOX5和FtLOX7基因的表達.這些結果有助于進一步探索FtLOX基因介導的鋁脅迫響應過程和分子機制，能為系統(tǒng)地研究苦蕎FtLOX基因家族的功能提供重要依據(jù).