王 格，楊 萌，楊明月，魯 琳＊

1 北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 101300

2 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點實驗室，北京 102206

0 引言

固定化微生物技術(shù)（Imobilized Microorganlsins）是20世紀(jì)60年代在固定化酶技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項新技術(shù)，隨著遺傳工程、細(xì)胞工程、酶催化工程等高新技術(shù)的成熟發(fā)展和促進(jìn)，目前已成為生物工程領(lǐng)域的一個重要分支[1]。固定化微生物具有微生物密度大、反應(yīng)速度快、低污泥產(chǎn)量、耐環(huán)境沖擊和反應(yīng)過程容易控制等優(yōu)點，吸引眾多國內(nèi)外學(xué)者對其研究。相較于固定化酶技術(shù)，固定化細(xì)胞技術(shù)有其獨特的優(yōu)勢，也使得固定化細(xì)胞技術(shù)能夠迅速發(fā)展及完善[2]。

一般載體會選擇顆粒小、疏松、比表面積大并且pH值為中性（不足中性的用前調(diào)整到中性）的物質(zhì)。載體不僅對于一定時間內(nèi)維持菌劑中特定的微生物的活性、數(shù)量有十分重要的作用，還是決定菌劑質(zhì)量的重要因素之一，將影響應(yīng)用效果。但是即便采用相同的培養(yǎng)基和相同單位數(shù)量的載體，若固定化的方法不同，菌體與載體的結(jié)合方式以及結(jié)合程度也將會有所不同。因此，雖然能夠作為載體的材料很多，但并非隨便一種物質(zhì)都可以作為菌劑載體的材料。據(jù)研究報道[3，4]，載體的種類、數(shù)量、大小、結(jié)構(gòu)、形狀等物理性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征對白腐真菌的培養(yǎng)及應(yīng)用均有較大的影響作用。

吸附法是將細(xì)胞直接吸附于惰性載體上，分為物理吸附法和離子結(jié)合法。物理吸附法是利用硅藻土、多孔磚、木屑等材料作為載體，將微生物細(xì)胞吸附住；離子結(jié)合法是利用微生物細(xì)胞表面的靜電荷在適當(dāng)條件下可以為離子交換樹脂進(jìn)行離子結(jié)合和吸附制成固定化細(xì)胞。吸附法的優(yōu)點是操作簡便、載體可再生；缺點是細(xì)胞與載體的結(jié)合力弱，pH值和離子強(qiáng)度等外界條件的變化都可以導(dǎo)致細(xì)胞的解吸，使其從載體上脫落。

一部分學(xué)者認(rèn)為在堆肥過程中沒有必要接種菌劑，但還有大多數(shù)人認(rèn)為，在人工條件下通過接種菌劑可以提高堆肥的微生物數(shù)量并加快堆肥反應(yīng)進(jìn)程。且早在20世紀(jì)40年代，美國就通過接種細(xì)菌從而使堆肥時間縮短了1～3 天。許多研究結(jié)果也充分肯定了接種菌劑在堆肥過程中的促進(jìn)作用，所以，有不少學(xué)者已開始著力研究在堆肥不同階段起關(guān)鍵作用的微生物，并開始進(jìn)行自然界中的優(yōu)質(zhì)高效菌群的篩選以及接種技術(shù)的探討。

本試驗從不同發(fā)酵狀態(tài)的廢棄物中篩選獲得的、纖維素酶活性較高的自選菌種，進(jìn)行了單載體的吸水率、吸菌量，菌劑固定后的過氧化氫酶和纖維素酶的變化研究，為后續(xù)復(fù)合載體吸附微生物的試驗提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本課題組保存，從不同發(fā)酵狀態(tài)的廢棄物中篩選獲得的纖維素酶活性較高的自選菌種：真菌ZZ9、細(xì)菌ZX5及ZH9。

載體：麥麩（MF）、鋸末（JM）、干牛糞（GNF）、硅藻土（GZT）、蛭石（ZS）、珍珠巖（ZZY）、草炭（CT）。

1.2 試驗儀器

滅菌鍋、超凈工作臺、-80 ℃冰箱、搖床、培養(yǎng)箱、烘箱。

1.3 試驗方法

1.3.1 單載體的吸水量測定

在無菌條件下將菌液與各載體充分混勻，每次加入5.0 mL菌液。使載體濕潤，并保持疏松，且不結(jié)塊。以菌劑所含的菌液量為載體吸水率，吸水率反映載體的吸附能力。

1.3.2 單載體的吸菌量測定

將菌劑放置在陰涼處保存，兩天后取l0.00 g樣品加入100 mL生理鹽水在200 r/min下振蕩2 h，然后立即用稀釋平板計數(shù)法測定釋放的菌數(shù)。

1.3.3 單載體吸菌后條件優(yōu)化

（1）菌劑制作

在500 mL三角瓶中裝入200 mL培養(yǎng)液，將ZX5、ZZ9、ZH9分別接種到發(fā)酵液體培養(yǎng)基中。

真菌的培養(yǎng)基為改良的高氏一號培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g，蛋白胨5.00 g，硝酸鉀1.00 g，氯化鈉0.50 g，磷酸氫二鉀0.50 g，硫酸鎂0.50 g，硫酸亞鐵0.01 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.2～7.4。

細(xì)菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3.00 g，蛋白胨5.00 g，氯化鈉5.00 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0～7.2。

在25 ℃下靜置培養(yǎng)至對數(shù)期。

（2）載體制作稱量三角瓶子重量m1，分別稱量各種載體大約100.00 g于三角瓶中，于0.1 MPa，滅菌20 min后，放于烘箱中在60 ℃下烘干48 h直到衡重，稱重為m2，由此得到載體凈重。按載體的吸水率，分別向載體中加入相應(yīng)菌液量，放于30 ℃下儲存。分別在其第1、3、5、9、12、15、30天測定其纖維素酶酶活及過氧化氫酶酶活。

（3）酶活測定

a、纖維素酶活性測定（硝基水楊酸比色法）

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)液含0.2～0.8 mg葡萄糖）繪制：分別取不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL移入25.0 mL容量瓶中，加3.0 mL二硝基水楊酸溶液。將試管放在沸騰水浴上5 min，然后迅速冷卻3 min。定容，15 min后在分光光度計上于波長540 nm處比色測定。以光密度值為縱坐標(biāo)，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

操作步驟：稱1 g菌劑于50.0 mL三角瓶中，加20 mL 1%羧甲基纖維素溶液、5.0 mL pH值為5.5磷酸鹽緩沖液及1.5 mL甲苯，將三角瓶放在37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束后，過濾并定容25.0 mL。取1.0 mL濾液，然后按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線顯色法比色測定。纖維素酶活，以72 h，10.00 g土壤生成葡萄糖毫克數(shù)表示。

b、過氧化氫酶活性測定

酶液提?。喝?0.0 mL試管4 支，2 支為樣品測試管，2 支為對照，各管分別加入粗酶液0.2 mL。磷酸緩沖液（0.2 M，pH值7.8）1.5 mL，水1.0 mL。對照管加入的酶液為沸水浴中保持2 min的酶液。

活性測定：25 ℃預(yù)熱后，逐管加入0.3 mL的H2O2溶液（0.1 M），每加完一管立即計時，并迅速測定其在240 nm下的吸光值，每隔1 min讀數(shù)1 次，共測4 min，待4 支試管全部測完后，計算其過氧化氫酶酶活。

以1 min內(nèi)A240減少0.1的酶量為1 個酶活單位：過氧化氫酶活性=（△A240·VT）（0.1V1·t·wF）-1

式中：A0為對照管加入煮死酶液吸光值；A1、A2為樣品管吸光值；VT為粗酶液提取液總體積（mL）；V1為測定用粗酶液體積（mL）；wF為樣品鮮重（g）；0.1為A240每下降0.1為1 個酶活單位；t為加過氧化氫到最后一次讀數(shù)時間（min）

2 試驗結(jié)果

2.1 單載體的吸水率

載體的吸水率越高，表明對菌的吸附能力越強(qiáng)。從表1可以看出，鋸末、珍珠巖、硅藻土的吸水率比較高，也就說明這3 種載體的吸附能力比較好，對菌的吸附能力較強(qiáng)，吸水率依次是鋸末＞珍珠巖＞硅藻土。其中，吸水率最高的鋸末是吸水率最低的草炭的5.7 倍，也是吸水率第2高的珍珠巖的1.2倍。但載體的選擇還應(yīng)看隨著時間的增長，其對菌的釋放力，菌劑在載體上的存活時間以及菌劑的活力如何。

表1 單載體的吸水率

2.2 單載體的吸菌量

由圖1可以看出，載體對于ZX5的吸附能力普遍較強(qiáng)，能達(dá)到1.0×1010～2.0×1010CFU/g，其中鋸末、珍珠巖以及硅藻土的表現(xiàn)比較優(yōu)秀；ZZ9次之，普遍在1.0×1010g，其中也是鋸末、珍珠巖、硅藻土的表現(xiàn)比較好；而對于ZH9的吸附能力則很弱，只有1.0×109g左右，鋸末、珍珠巖和硅藻土的表現(xiàn)較為突出。這也驗證了吸水率較好的載體對于菌的吸附性也很好。

圖1 單載體的吸菌量

2.3 菌劑固定后的過氧化氫酶變化

過氧化氫酶（Catalase）又叫接觸酶，可以促進(jìn)堆肥中有機(jī)物的氧化分解。過氧化氫是代謝過程中產(chǎn)生的廢物，會對機(jī)體造成一定損害，因此，必須迅速將過氧化氫轉(zhuǎn)化為其他無害或毒性較小的物質(zhì)。而過氧化氫酶便是用與催化細(xì)胞中的過氧化氫分解的工具，幾乎所有的生物機(jī)體都存在過氧化氫酶，其酶促活性為機(jī)體提供了抗氧化防御機(jī)理。本研究通過測定各菌種固定后的過氧化氫酶活性，各菌種固定后隨著儲存時間延長，其酶活性的變化表現(xiàn)不同。據(jù)此將3 種菌固定在7 種載體上的酶活變化：菌種ZH9和ZZ9，二者固定在麥麩及干牛糞上的過氧化氫酶活性變化呈現(xiàn)“山峰”型，即均經(jīng)歷了先升高再降低的過程，并且其酶活性在第2～4 天達(dá)到最高峰。

由圖2可以看出，菌ZH9在麥麩及干牛糞上的過氧化氫酶活性較高，尤其是在麥麩上的表現(xiàn)較好。在第4天幾乎所有載體的過氧化氫酶活性均出現(xiàn)峰值，隨后都開始降低，除麥麩外的載體在第5天以后活性都接近0；而在麥麩上的過氧化氫酶活性則逐漸降低，在第7天的時候活性才消失。

圖2 ZH9的過氧化氫酶活性

由圖3可以看出，菌ZZ9在麥麩上的過氧化氫酶活性表現(xiàn)較為突出，其次為干牛糞，但在第4天以后幾乎所有載體上ZZ9的過氧化氫酶活性都幾乎為0，只有干牛糞上的過氧化氫酶活性持續(xù)性較好，穩(wěn)定性也較好。

圖3 ZZ9的過氧化氫酶活性

由圖4可以看出，菌ZX5在載體上的過氧化氫酶活性相對于其他菌劑來說普遍不高。ZX5在干牛糞上的過氧化氫酶活性較其他載體一直偏高，在第3天時出現(xiàn)峰值?？傮w來說，ZX5菌的過氧化氫酶活性普遍較高。

圖4 ZX5的過氧化氫酶活性

2.4 菌劑固定后的纖維素酶變化

纖維素酶（Cellulase）是酶的一種，在分解纖維素的過程中起生物催化作用。細(xì)菌、真菌、動物體內(nèi)等都可以產(chǎn)生纖維素酶。纖維素是地球上分布最廣、含量最豐富的碳水化合物，占全球植物總干重的30%～50%，是植物細(xì)胞壁的主要成分[5]。而且纖維素還是牛糞堆肥原料中比較難分解的成分，它可在纖維素酶作用下水解為纖維二糖，進(jìn)而水解為葡萄糖[6]。本研究纖維素酶活性是以72 h后1 g肥生成的葡萄糖mg數(shù)表示。

由圖5可以看出，菌ZH9在麥麩上的纖維素酶活性比較高，其走勢呈現(xiàn)一種先下降后緩慢上升的過程；在鋸末上的纖維素酶活性次之，但相對來說比較平穩(wěn)。在其他載體上的活性幾乎為0。而在接種初始階段，該菌在麥麩與鋸末上的纖維素酶活性較高；而在接種的最后階段亦是這兩種載體上的纖維素酶活性較高。

圖5 ZH9的纖維素酶活性

由圖6可以看出，菌ZZ9在麥麩上的纖維素酶活性表現(xiàn)較好，其走勢經(jīng)歷一個先下降后緩慢上升的的變化，并在最后達(dá)到其高峰。而該菌在其他載體上表現(xiàn)一般，其纖維素酶活性都接近0。

圖6 ZZ9的纖維素酶活性

由圖7可以看出，菌ZX5的纖維素酶活性在麥麩上的表現(xiàn)最為突出，其酶活經(jīng)歷了一個先下降，后上升的過程，并在接種的最后達(dá)到了峰值。該菌在鋸末上的表現(xiàn)次之，其纖維素酶活性較之麥麩偏低，但其酶活的變化不是很顯著，比較平穩(wěn)。而其他幾種載體顯然不適合ZX5菌的保存及再繁，其纖維素酶活性幾乎為0。

圖7 ZX5的纖維素酶活性

3 結(jié)論

在過氧化氫酶酶活的測定中，麥麩及干牛糞的表現(xiàn)均比較優(yōu)秀且3 種菌都在第6～8天的時候出現(xiàn)峰值。在纖維素酶酶活的測定中，亦是麥麩與干牛糞的表現(xiàn)較為突出，而在后期接到麥麩上的3 種菌的纖維素酶酶活都大幅度提高，可能是到后期載體中的營養(yǎng)物質(zhì)比較少，微生物便開始分泌纖維素酶消化載體中的纖維素。

綜上所述，從單載體試驗中可以挑出以下4 種適合ZX5、ZZ9、ZH9三種菌吸附的載體：麥麩、硅藻土、干牛糞及鋸末。因此，在復(fù)合載體的試驗中，表現(xiàn)比較好的有機(jī)載體麥麩可以為微生物提供所需要的營養(yǎng)，而鋸末的吸水性較好且疏松透氣，適合作為載體的支架物質(zhì)，3 種菌在干牛糞因其蓬松，富含有機(jī)質(zhì)的特點表現(xiàn)相對較好，尤其將干牛糞作為載體可以縮短其接種到牛糞后的適應(yīng)期，而硅藻土則主要作為無機(jī)載體來吸附微生物。