武光宇，楊 萌，楊明月，魯 琳＊

1 北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 101300

2 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206

0 引言

固定化細(xì)胞技術(shù)是從20世紀(jì)70年代開(kāi)始逐漸由固定化酶技術(shù)發(fā)展而來(lái)，利用物理或化學(xué)方法，使微生物細(xì)胞與固體的不溶性支持物，即載體相結(jié)合，從而可保持其方便儲(chǔ)存與運(yùn)輸，又能保持其活性。 用此方法，酶無(wú)需從細(xì)胞被分離和純化，因此，酶的活性也只是輕微降低。微生物固定化技術(shù)因其細(xì)胞密度高、反應(yīng)速度快、穩(wěn)定性好、抗毒害能力強(qiáng)、微生物損失小、產(chǎn)品容易分離、污泥含量低而被廣泛應(yīng)用于廢棄物處理[1～4]。該項(xiàng)技術(shù)可高濃度選擇性地固定各種優(yōu)勢(shì)菌種，是近代工業(yè)微生物學(xué)上的重要革新，展示著廣闊的前景。

最常用的微生物固定化載體可分為三類(lèi)：無(wú)機(jī)載體、有機(jī)聚合物載體和復(fù)合載體。復(fù)合載體是一種結(jié)合了無(wú)機(jī)載體和有機(jī)載體的新型載體，兩類(lèi)材料的特性相互補(bǔ)充，體現(xiàn)了復(fù)合載體的優(yōu)越性，有效地克服了生物固定化應(yīng)用中遇到的問(wèn)題，如形成的球粒容易碎裂和喪失活性，在降低成本和改善廢物管理方面有明顯的長(zhǎng)處[5，6]。用作載體的硅藻土的主要成分是SiO2，已被證明可以穩(wěn)定活性成分，而且這種作用隨著K2O和Na2O含量的增加而增加。當(dāng)硅藻土被酸處理后，氧化物含量減少，SiO2含量增加，比表面積和孔隙體積增加，使經(jīng)過(guò)處理的硅藻土成為比天然硅藻土更好的載體。

近年來(lái)，關(guān)于固定化生物催化劑的研究發(fā)展迅速[7]，并提出了一個(gè)基于共培養(yǎng)技術(shù)的新概念。共同培養(yǎng)方法通常使用具有相似培養(yǎng)條件的菌株，而這些菌株差異大，會(huì)使共同培養(yǎng)變得困難，但先以共同培養(yǎng)方法通過(guò)單獨(dú)培養(yǎng)菌株，然后將它們共固定起來(lái)的共固定技術(shù)克服了這些差異[8]。

本試驗(yàn)選擇了不同比例的麥麩、鋸末、干牛糞和硅藻土制備復(fù)合載體，研究了復(fù)合載體對(duì)微生物的吸附效果，旨在固化微生物時(shí)有相對(duì)固定的方法可尋，節(jié)約時(shí)間，提高效率。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 復(fù)合載體的吸水量測(cè)定

在無(wú)菌條件下將菌液與各載體充分混勻，每次加入5 mL菌液，使載體濕潤(rùn)，并保持疏松，不結(jié)塊。以菌劑所含的菌液量為載體吸水率，反映載體的吸附能力。

1.2 復(fù)合載體吸菌后的條件優(yōu)化

1.2.1 菌劑制作

在500 mL三角瓶中裝入200 mL培養(yǎng)液，將細(xì)菌ZX5、細(xì)菌ZH9、真菌ZZ9分別接種到發(fā)酵液體培養(yǎng)基中。

細(xì)菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3.00 g，蛋白胨5.00 g，氯化鈉5.00 g，蒸餾水1 000 mL，pH值為7.0～7.2。

真菌的培養(yǎng)基為改良的高氏一號(hào)培養(yǎng)基：葡萄糖10.00 g，蛋白胨5.00 g，硝酸鉀1.00 g，氯化鈉0.50 g，磷酸氫二鉀0.50 g，硫酸鎂0.50 g，硫酸亞鐵0.01 g，蒸餾水1 000 ml，pH值為7.2～7.4。在25 ℃下靜置培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。

1.2.2 載體制作

稱(chēng)量三角瓶子重量m1，分別稱(chēng)量復(fù)合載體，選擇不同比例的麥麩、鋸末、干牛糞和硅藻土制備復(fù)合載體A、B、C，配比見(jiàn)表2-1。大約100 g于三角瓶中，于0.1 MPa，滅菌20 min后，放于烘箱中，在60 ℃下烘干48 h直到恒重，稱(chēng)重為m2，由此得到載體凈重。按載體的吸水率，分別向載體中加入相應(yīng)菌液量，分別放入30 ℃、40 ℃、50 ℃下儲(chǔ)存（表2、3）。分別在其第1、3、15、30天測(cè)定其纖維素酶酶活、脲酶酶活及過(guò)氧化氫酶酶活。

表1 復(fù)合載體配比

表2 復(fù)合載體接種不同菌種的樣本標(biāo)號(hào)

表3 復(fù)合載體接種不同菌種后在不同溫度下的樣本標(biāo)號(hào)

1.2.3 酶活測(cè)定

（1）纖維素酶活性測(cè)定（硝基水楊酸比色法）

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 mL標(biāo)準(zhǔn)液含0.2～0.8 mg葡萄糖）繪制：分別取不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL移入25 mL容量瓶中，加3 mL二硝基水楊酸溶液。將試管放在沸騰水浴上5 min，然后迅速冷卻3 min，定容。15 min后在分光光度計(jì)上于波長(zhǎng)540 nm處比色測(cè)定。以光密度值為縱坐標(biāo)，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

操作步驟：稱(chēng)1 g菌劑于50 mL三角瓶中，加20 mL 1%羧甲基纖維素溶液、5 mL pH值為5.5磷酸鹽緩沖液及1.5 mL甲苯，將三角瓶放在37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束后，過(guò)濾并定容25 mL。取1 mL濾液，然后按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線顯色法比色測(cè)定。纖維素酶活，以72 h，10 g土壤生成葡萄糖毫克數(shù)表示。

（2）脲酶活性測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)溶液的繪制：精確的稱(chēng)量0.471 7 g硫酸銨在水中，稀釋到1 000 mL，進(jìn)而獲得1 mL含有0.1 mg氮的標(biāo)準(zhǔn)溶液。該溶液可以再作稀釋處理，稀釋倍數(shù)為10。將1 mL、3 mL、5 mL、7 mL、9 mL、11 mL、13 mL稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)溶液移入50 mL容量瓶中，并加入20 mL蒸餾水，繼續(xù)加入4 mL苯酚鈉溶液和3 mL次氨酸鈉溶液，邊加邊搖，使其充分混合，20 min后，溶液顏色穩(wěn)定，定容。用分光光度計(jì)在578 nm處進(jìn)行色譜分析，此操作在1 h內(nèi)進(jìn)行，以光密度值和溶液濃度為依據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

操作步驟：取1.00 g菌劑置于50 mL三角瓶中，加1 mL甲苯。15 min后加入10 mL10.0%尿素液和20 mLpH值為6.7的檸檬酸鹽緩沖液。搖勻后在37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h。過(guò)濾后取3 mL濾液注入50 mL容量瓶中，然后按繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線顯色方法進(jìn)行比色測(cè)定。脲酶活性以24 h后1.00 g土壤中NH3-N的毫克數(shù)表示。

（3）過(guò)氧化氫酶活性測(cè)定

取1.00 g菌劑置于100 mL三角瓶中，并注入40 mL蒸餾水和5 mL 0.3%過(guò)氧化氫溶液。將三角瓶放在往復(fù)式振蕩機(jī)上，振蕩20 min。而后加入5 mL 的0.6 mol/L硫酸，以穩(wěn)定未分解的過(guò)氧化氫，再將瓶懸液用慢速型濾紙過(guò)濾。然后，吸取25 mL濾液，和0.02 mol/L高錳酸鉀滴定至淡粉紅色終點(diǎn)。過(guò)氧化氫酶活性以20 min后1.00 g土壤的0.02 mol/L高錳酸鉀的毫升數(shù)表示。

2 試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單載體的優(yōu)化試驗(yàn)，選出幾個(gè)表現(xiàn)較好的載體：麥麩，鋸末，干牛糞和硅藻土。將這幾種載體按照一定比例配成復(fù)合載體，進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1 復(fù)合載體的吸水率

復(fù)合載體的吸水率見(jiàn)表4。

表4 復(fù)合載體的吸水率

2.2 復(fù)合載體吸菌后的優(yōu)化條件

從圖1可以看出， ZH9過(guò)氧化氫酶活性測(cè)定中，24號(hào)的表現(xiàn)最為突出，各樣本除23、24號(hào)在培養(yǎng)第30天左右出現(xiàn)峰值，其余普遍在培養(yǎng)第3天時(shí)出現(xiàn)峰值。而從其纖維素酶活性的測(cè)定（圖2）可以知道各樣本的酶活相差不大，但纖維素酶的活性隨著時(shí)間的增加而增大，在培養(yǎng)第15天的時(shí)候出現(xiàn)峰值。其脲酶活性普遍偏低（圖3），而且各樣本出現(xiàn)峰值的時(shí)間沒(méi)有規(guī)律可言，但考慮到固定化菌劑的儲(chǔ)存問(wèn)題，只有24號(hào)在培養(yǎng)第30天左右出現(xiàn)峰值。由此可見(jiàn)，24號(hào)樣本為固定ZH9菌劑的最優(yōu)條件。24號(hào)：復(fù)合載體B（麥麩25.0%，鋸末25.0%，干牛糞20.0%，硅藻土30.0%），儲(chǔ)存溫度：40 ℃。

圖1ZH9菌過(guò)氧化氫酶活性

圖2ZH9菌纖維素酶活性

圖3ZH9菌脲酶活性

圖4ZZ9過(guò)氧化氫酶活性

從圖4可以看出，ZZ9過(guò)氧化氫酶活性測(cè)定中，10、11、12號(hào)的表現(xiàn)均較為突出，但3 個(gè)樣本的過(guò)氧化氫酶活性出現(xiàn)峰值的時(shí)間卻有些差異，10號(hào)在培養(yǎng)到第30天左右出現(xiàn)峰值，而11、12號(hào)則是在培養(yǎng)到第15天左右出現(xiàn)峰值，且11號(hào)＞12號(hào)。而從其纖維素酶活性的測(cè)定（圖5）可以看出，各樣本的酶活相差不大，但纖維素酶的活性隨著時(shí)間的增加而增大，在培養(yǎng)第15天的時(shí)候出現(xiàn)峰值。其脲酶活性普遍偏低（圖6），而且各樣本出現(xiàn)峰值的時(shí)間大部分在培養(yǎng)第3天左右出現(xiàn)峰值，而10號(hào)樣本在各個(gè)階段的脲酶活性較其他樣本均偏高。綜上所述，10號(hào)樣本為固定ZZ9菌劑的最優(yōu)條件。10號(hào)：復(fù)合載體A（麥麩50.0%，鋸末10.0%，干牛糞20.0%，硅藻土20.0%），儲(chǔ)存溫度：30 ℃。

從圖7可以看出，ZX5過(guò)氧化氫酶活性普遍較低，1、5號(hào)的表現(xiàn)均較為突出，但這兩者的過(guò)氧化氫酶活性出現(xiàn)峰值的時(shí)間卻有些差異，15號(hào)在培養(yǎng)到第15天左右出現(xiàn)峰值，而1號(hào)則是在培養(yǎng)到第1天左右出現(xiàn)峰值，而從其纖維素酶活性的測(cè)定（圖8）可以知道各樣本的酶活相差不大，但纖維素酶的活性隨著時(shí)間的增加而增大，在培養(yǎng)第15天的時(shí)候出現(xiàn)峰值，其脲酶活性普遍偏低（圖9），而且各樣本出現(xiàn)峰值的時(shí)間大部分在培養(yǎng)第3天左右出現(xiàn)峰值，而5號(hào)樣本在各個(gè)階段的脲酶活性較其他樣本普遍偏高。綜上所述，5號(hào)樣本為固定ZX5菌劑的最優(yōu)條件。5號(hào)：復(fù)合載體C（麥麩35.0%，鋸末35.0%，干牛糞20.0%，硅藻土10.0%），儲(chǔ)存溫度：40 ℃。

圖5ZZ9菌纖維素酶活性

圖6ZZ9菌脲酶活性

圖7ZX5菌過(guò)氧化氫酶活性

圖8ZX5菌纖維素酶的活性

圖9ZX5菌脲酶的活性

3 結(jié)論

研究表明，細(xì)菌ZX5及ZH9的儲(chǔ)存溫度均在40 ℃時(shí)為最佳，但ZX5的最適復(fù)合載體為C，而ZH9的最適復(fù)合載體為B，復(fù)合載體C的麥麩、鋸末量均高于復(fù)合載體B，而硅藻土含量卻遠(yuǎn)小于復(fù)合載體B，麥麩、鋸末的透氣性及養(yǎng)分含量要遠(yuǎn)高于硅藻土，由此可見(jiàn)，ZX5對(duì)氧氣及養(yǎng)分的需求要高于ZH9；而真菌ZZ9的最適儲(chǔ)存溫度為30 ℃，最佳復(fù)合載體為A，其麥麩的含量占到50%，說(shuō)明ZZ9對(duì)于養(yǎng)分需求較高。

綜上所述，即使使用相同的底物和載體單位數(shù)量，不同的固定化方法將導(dǎo)致細(xì)菌與載體結(jié)合的模式和水平不同，而且沒(méi)有適用于所有類(lèi)型微生物的通用固定化方法。這意味著微生物細(xì)胞的固定化是具特異性的。