朱凌霄 張 蘭 張雪鵬 李昊鑫

華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤外科，河北唐山 063000

三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是乳腺癌中一種難治性亞型，由于缺乏特異性受體，目前TNBC 主要采用傳統(tǒng)的化療和手術(shù)治療，但預(yù)后較差，所以尋找新的治療手段，尤其是靶向治療是目前的研究熱點(diǎn)[1-2]。微RNA（microRNA，miRNA）是強(qiáng)大的“基因調(diào)節(jié)劑”，其中miR-145 作為表達(dá)較為顯著的一類抑癌基因，可抑制TNBC 的增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲[3-4]。本課題組前期發(fā)現(xiàn)，miR-145 通過調(diào)控解聚素-金屬蛋白酶17（adisintegrin and metalloproteinase 17，ADAM17）可影響MCF-7 乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲[5]。為進(jìn)一步觀察其在TNBC 中的作用，本研究在降低TNBC 細(xì)胞中miR-145 的表達(dá)水平后，通過測定和分析下游ADAM17 及與其密切相關(guān)的表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）相關(guān)指標(biāo)的變化后，觀察其對TNBC 細(xì)胞增殖和侵襲的影響，并探討其作用機(jī)制，為TNBC 的靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

人TNBC MDA-MB-231 細(xì)胞株（CL-0150）購于武漢普諾賽生命科技有限公司；miR-145 無義序列（miR2N0000001-1-1）、miR-145 inhibitors（miR20000）以及引物（miR01101）均由廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)與合成；Leibovitz L-15 培養(yǎng)基（10-045-CVR）購于美國Corning 公司；胎牛血清（A0100-3210）購于德國Cegrogen 公司；實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒（RK21 203）購于武漢愛博泰克生物科技有限公司；Lipofec tamine 2000 試劑（11668027）購于美國Invitrogen 公司；ADAM17（GTX101358）購于美國GeneTex 公司；EGFR抗體（ARG66204）購于上海Arigo 公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

使用L-15 完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%雙抗）培育本研究的目標(biāo)細(xì)胞，MDA-MB-231 細(xì)胞置于37℃、無CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)分為空白組（細(xì)胞無特殊處理）、miR-145 NC 組（轉(zhuǎn)染miR-145 無義序列）、miR-145 inhibitors 組（轉(zhuǎn)染miR-145 inhibitors）。轉(zhuǎn)染后分析確定各組miR-145 的表達(dá)水平以及轉(zhuǎn)染效率。

1.3 實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)檢測各組miR-145 和ADAM17、EGFR mRNA 的表達(dá)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染后繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，Trizol 法提取各組的總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（銳博生物，ZR102-2）合成cRNA。以U6 和β-actin 分別作為miR-145 和ADAM17、EGFR 的內(nèi)參，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。在電腦上預(yù)先設(shè)置好反應(yīng)需要的相關(guān)程序，并按順序進(jìn)行45 個(gè)循環(huán)，過程主要包括：預(yù)變性（95℃，10 min）、變性（95℃，10 s）、退火（56℃，25 s）、延伸（72℃，1 min）。反應(yīng)完畢后收集各組數(shù)據(jù)，各組mRNA 的表達(dá)量用相對定量法表示。實(shí)驗(yàn)所需引物序列如表1所示。

表1 引物序列

1.4 Western blot 檢測各組ADAM17 及EGFR 蛋白的表達(dá)

不同處理組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h 后，提取各組細(xì)胞的總蛋白并測定蛋白濃度。配制SDS-PAGE 膠并進(jìn)行凝膠電泳，而后進(jìn)行電轉(zhuǎn)以及封閉，置于一抗工作液中，4℃冰箱中孵育過夜。次日置于二抗工作液中孵育，凝膠成像儀對條帶進(jìn)行顯像并分析光密度（optical density，OD）值。

1.5 CCK-8 法測定細(xì)胞增殖活性

不同處理組細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功后接種于96 孔板中培養(yǎng)，每組可設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。分別在轉(zhuǎn)染后24、48、72 h 時(shí)加入CCK-8 試劑，并檢測各孔的OD 值（450 nm）并記錄。

1.6 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞的侵襲能力

轉(zhuǎn)染成功后的各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行消化重懸，加入提前鋪好Matrigel 基質(zhì)膠的小室中（約5×105個(gè)細(xì)胞/孔）。同時(shí)Transwell 下室加入L-15 完全培養(yǎng)基，36 h 后對侵襲細(xì)胞進(jìn)行固定以及著色。待其明顯著色后在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)，記錄各組細(xì)胞的穿膜數(shù)目。

1.7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞的遷移能力

各組MDA-MB-231 細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功6 h 后，用100 μl 無菌槍頭對三組細(xì)胞劃3 條直線，此時(shí)記為劃痕實(shí)驗(yàn)0 h，計(jì)時(shí)24 h，觀察并記錄轉(zhuǎn)染后顯微鏡下細(xì)胞的形態(tài)以及分布。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 23.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)。以P <0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Lipofectamine 2000 介導(dǎo)的miR-145 轉(zhuǎn)染率比較

miR-145 inhibitors 組miR-145 表達(dá)量低于miR-145 NC 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；miR-145 NC組與空白組miR-145 表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見圖1。

圖1 Lipofectamine 2000 介導(dǎo)的miR-145 轉(zhuǎn)染率比較

2.2 各組MDA-MB-231 細(xì)胞增殖情況比較

空白組與miR-145 NC 組比較：轉(zhuǎn)染后時(shí)間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05），而組間、交互作用比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，組內(nèi)比較：轉(zhuǎn)染后72 h，空白組、miR-145 NC 組OD值均大于轉(zhuǎn)染后24 h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。組間比較：轉(zhuǎn)染后24、48、72 h，miR-145 NC 組與空白組OD 值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見表2。

miR-145 NC 組與miR-145 inhibitors 組比較：轉(zhuǎn)染后時(shí)間、組間、交互作用比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，組內(nèi)比較：轉(zhuǎn)染后72 h，miR-145 inhibitors 組OD 值大于轉(zhuǎn)染后24、48 h；差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。組間比較：轉(zhuǎn)染后72 h，miR-145 inhibitors 組OD 值大于miR-145 NC 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。轉(zhuǎn)染后24、48 h，miR-145 inhibitors 組與miR-145 NC 組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見表2。

表2 各組轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)OD 值比較（，n=3）

表2 各組轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)OD 值比較（，n=3）

注：空白組與miR-145 NC 組比較：F時(shí)間=1059.059，P時(shí)間＜0.001；F組間=0.442，P組間=0.543；F交互=5.109，P交互=0.087。miR-145 NC組與miR-145 inhibitors 組比較，F(xiàn)時(shí)間=281.070，P時(shí)間＜0.001；F組間=20.413，P組間=0.011；F交互=73.391，P交互=0.001。與本組轉(zhuǎn)染后24 h比較，aP ＜0.05；與本組轉(zhuǎn)染后48 h 比較，bP ＜0.05；與miR-145 NC 組同期比較，cP ＜0.05

2.3 各組細(xì)胞侵襲能力比較

miR-145 inhibitors 組跨膜細(xì)胞數(shù)多于miR-145 NC 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；miR-145 NC 組與空白組跨膜細(xì)胞數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見圖2～3。

圖2 各組細(xì)胞的跨膜結(jié)果（200×）

圖3 各組細(xì)胞侵襲能力比較（n=3）

2.4 各組細(xì)胞的遷移能力比較

miR-145 inhibitors 組劃痕愈合率高于miR-145 NC 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05）；miR-145 NC 組與空白組細(xì)胞愈合率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見圖4～5。

圖4 各組細(xì)胞的遷移情況（200×）

圖5 各組劃痕愈合率比較（n=3）

2.5 各組ADAM17、EGFR mRNA 的表達(dá)情況比較

miR-145 inhibitors 組ADAM17 mRNA 相對表達(dá)量高于miR-145 NC 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；miR-145 NC 組與空白組ADAM17 mRNA 相對表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P >0.05）。miR-145 inhibitors 組 和miR-145 NC 組EGFR mRNA 的 相 對表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P >0.05）；miR-145 NC組與空白組EGFR mRNA 相對表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P >0.05）。見圖6。

圖6 各組ADAM17、EGFR mRNA 的表達(dá)情況比較（n=3）

2.6 各組ADAM17、EGFR 蛋白表達(dá)情況比較

miR-145 inhibitors 組ADAM17、EGFR 蛋白相對表達(dá)量高于miR-145 NC 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05）；miR-145 NC 組與空白組ADAM17、EGFR 蛋白相對表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P >0.05）。見圖7～8。

圖7 Western blot 檢測各組ADAM17、EGFR 蛋白條帶

圖8 各組ADAM17 和EGFR 的蛋白表達(dá)量比較（n=3）

3 討論

臨床上TNBC 生存率低，復(fù)發(fā)率高，早期容易發(fā)生轉(zhuǎn)移且侵襲性較其他亞型強(qiáng)[6]。由于TNBC 特殊的生物學(xué)特性（多種受體表達(dá)明顯缺陷），現(xiàn)有的分子靶向治療并不能獲得較好的臨床效果。而目前主要采用傳統(tǒng)的化療和手術(shù)治療方式在大約30%的TNBC 患者中可以有效地發(fā)揮作用，但許多患者對于上述治療方式?jīng)]有反應(yīng)或只有部分反應(yīng)，且最終以遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的形式復(fù)發(fā)，可以說目前臨床上患者的預(yù)后及生存期仍然不甚理想，所以尋找TNBC 的治療靶點(diǎn)迫在眉睫[7-8]。已有研究證明，在miRNA 家族中存在很多與腫瘤發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)的miRNA，他們通過與目標(biāo)mRNA 結(jié)合并激發(fā)原癌基因或者抑癌基因的表達(dá)，參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展乃至預(yù)后的過程，即有的miRNA 促進(jìn)腫瘤的增殖與侵襲，而有的miRNA 則參與負(fù)向調(diào)控腫瘤的生物學(xué)進(jìn)程[9-10]。眾所周知，miR-145 作為抑癌效果顯著的miRNAs 之一，已經(jīng)被證明與許多惡性腫瘤的病理進(jìn)程有緊密的聯(lián)系，比如在甲狀腺惡性腫瘤中，miR-145 主要是靶向抑制PI3K/AKT3 信號通路，從而抑制甲狀腺癌細(xì)胞的多種生物學(xué)特性[11]。當(dāng)然，miR-145 靶向調(diào)控不同的信號通路來影響惡性腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲等生物學(xué)行為的這一特性在胃癌、結(jié)直腸癌等疾病中亦有顯著表現(xiàn)[12-13]。所以miR-145 有可能作為乳腺癌的治療靶點(diǎn)[14]。本課題組前期研究證實(shí)，miR-145 過表達(dá)抑制MCF-7 乳腺癌細(xì)胞的增殖及侵襲[15-16]。我們進(jìn)一步研究抑制miR-145 的表達(dá)對TNBC 細(xì)胞的影響，主要應(yīng)用增殖實(shí)驗(yàn)（CCK-8 實(shí)驗(yàn)）以及Transwell 實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)證明miR-145 在TNBC 細(xì)胞中表達(dá)明顯受到抑制時(shí)，可以有效促進(jìn)細(xì)胞的生長增殖以及侵襲和遷移能力。

本實(shí)驗(yàn)還探究了miR-145 在TNBC 中可能存在的作用機(jī)制，通過分別檢測ADAM17 和EGFR 在細(xì)胞中的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)ADAM17 mRNA 和蛋白質(zhì)水平均上調(diào)；而EGFR mRNA 水平無變化，但蛋白表達(dá)水平上調(diào)。提示miR-145 可能直接調(diào)控ADAM17，但不直接調(diào)控EGFR。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，在許多惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，miR-145 均可通過靶向調(diào)控ADAM17 來參與病理進(jìn)程[17-18]。前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-145 與ADAM17 存在堿基互補(bǔ)序列，這一信息主要來源于生物學(xué)信息庫（TargetScan、PicTar 及miRanda），并據(jù)此預(yù)測了二者的關(guān)聯(lián)性[16]。提示miR-145 靶向調(diào)控ADAM17 的信號通路在TNBC 中存在合理性。研究顯示，EGFR 在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的信號通路中，是通過被上游的ADAM17 錨定以及激活后，經(jīng)歷自身的二聚化以及磷酸化的過程，進(jìn)而繼續(xù)激活下游的差異信號通路，從而調(diào)控多種腫瘤發(fā)生機(jī)制[19-20]。本研究中EGFR 蛋白水平上調(diào)，可能是因?yàn)锳DAM17 上調(diào)，其作為下游，蛋白表達(dá)亦升高，查閱相關(guān)文獻(xiàn)亦支持這一結(jié)論[21]。

綜上，miR-145 inhibitor 通過靶向激活A(yù)DAM17/EGFR 通路，促進(jìn)TNBC 細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。這可能為未來TNBC 的臨床治療提供新的分子靶點(diǎn)和治療思路。