張 偉 奚肇宏 劉夢茹 邱仁靜 田耀洲

1.南京中醫(yī)藥大學附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院消化科，江蘇南京 210028；2.南京中醫(yī)藥大學第三臨床醫(yī)學院，江蘇南京 210046

胃食管反流病（gastroesophageal reflux disease，GERD）是臨床常見疾病，全球基于人群每周至少發(fā)作1 次GERD 癥狀的患病率為13%[1]。對于難治性GERD 目前治療仍較為棘手，研究顯示弱酸或非酸反流與難治性GERD 癥狀密切相關(guān)[2-4]。十二指腸胃食管反流（duodenal gastroesophageal reflux，DGER）或十二指腸食管反流（duodenoesophageal reflux，DER）（潛在的膽汁反流）可能是形成難治性GERD 的因素之一[5]。課題組前期運用膽胃方治療DGER 肝胃不和證取得較為滿意的療效[6]。本研究觀察膽胃方對DER 模型大鼠食管黏膜形態(tài)、病理及蛋白酶激活受體-2（protease activated receptor-2，PAR-2）、E-鈣黏蛋白表達的影響，以探討膽胃方治療DER 的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SPF 級SD 大鼠，雌雄各半，6 周齡，購自南京大學[生產(chǎn)許可證：SCXK（蘇）2018-0008，合格證號：202004471]，于空調(diào)下架式分籠飼養(yǎng)，每籠6 只，環(huán)境溫度20～26℃，濕度50%～60%，光照、黑暗各12 h交替，標準顆粒飼料、滅菌注射用水喂養(yǎng)。已通過南京中醫(yī)藥大學附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院動物倫理審查（AEWC-20171220-26）。

1.2 儀器與試藥

膽胃方：柴胡10 g、郁金10 g、香附10 g、枳殼10 g、黃連6 g、吳茱萸3 g 等，由天江制藥提供免煎顆粒。枸櫞酸莫沙比利片（瑞琪）（江蘇豪森藥業(yè)集團有限公司生產(chǎn)，批號：124200906，5 mg/片）、鋁碳酸鎂片（達喜）（拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號：JS09356，0.5 g/片）。蘇木精染液（719054）、伊紅染液（719062），珠海貝索生物技術(shù)有限公司；組織固定液（1809330），江蘇世泰實驗器材有限公司。E-鈣黏蛋白抗體（14472S，使用濃度1∶100），Cell Signaling 公 司；PAR-2 抗 體（ab180953，使用濃度1∶100），Abcam 公司。生物組織攤烤片機（型號CT-9），德國Leica 公司；倒置生物顯微鏡（型號CKX31），日本Olympus 公司等。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組與造模 根據(jù)隨機數(shù)字表法將72 只SD 大鼠分為正常組、模型組、西藥組和膽胃方低、中、高劑量組，各12 只。6 周齡SD 大鼠分籠飼養(yǎng)1 周以適應(yīng)環(huán)境，自由進食標準顆粒飼料及飲水。術(shù)前24 h禁食固體食物，術(shù)前6 h 禁水。術(shù)后6 h 進水，術(shù)后24 h 正常進食。模型組及給藥組均采用“賁門縫合+食管十二指腸吻合術(shù)”造模[7]：0.3%戊巴比妥鈉1 ml/100 g劑量行腹腔注射麻醉，上腹正中切口，進腹后將食管下段分離神經(jīng)和血管，結(jié)扎賁門，切斷食管，賁門口結(jié)扎并荷包包埋，于距殘端約1 cm 處縱行切開十二指腸壁0.5 cm，與食管下端行端側(cè)吻合，將腸管及食管放歸原位后逐層縫合關(guān)閉腹腔。術(shù)后注射400 000 U青霉素，予5%葡萄糖氯化鈉溶液飼養(yǎng)3 d 后正常飼養(yǎng)，造模4 周。于第3、4 周末模型組分別麻醉1 只大鼠，取食管組織觀察形態(tài)及病理學變化，當出現(xiàn)食管黏膜縱行皺襞扭曲、充血水腫、糜爛及光鏡下見鱗狀上皮明顯增生，固有層乳頭伸長明顯，炎癥細胞浸潤等表現(xiàn)，證實模型制備成功。

1.3.2 給藥 造模成功后，膽胃方低、中、高劑量組分別予膽胃方低、中、高劑量，膽胃方顆粒臨用前用蒸餾水配成1.46、2.92、5.84 g/ml 溶液，根據(jù)每天成人用藥等效量（按70 kg/200 g 人鼠轉(zhuǎn)換系數(shù)W=6.25 計算）的1 倍（1.46 g/ml）、2 倍（2.92 g/ml）、4 倍（5.84 g/ml）給藥；西藥組予枸櫞酸莫沙比利、鋁碳酸鎂，臨用前蒸餾水配成0.003 g/ml 混合溶液；模型組予生理鹽水灌胃。按1 ml/100 g 劑量灌胃，每日灌胃1 次，共4 周。

1.3.3 標本制備與采集 給藥4 周后處死大鼠，取食管下段（含吻合口）行縱行剖開，予甲醛溶液固定、石蠟包埋、組織切片、HE 染色、免疫組化等制作。

1.4 觀察指標及檢測方法

1.4.1 一般情況 觀察大鼠的精神狀態(tài)、鼠毛、活動情況及食欲等。

1.4.2 食管黏膜形態(tài)及病理學觀察 食管縱行剖開后肉眼觀察大體形態(tài)改變，并進行反流性食管炎洛杉磯分級[8]及評分：正常（0 分）；A 級（1 分）：食管黏膜有破損，但無融合，病灶長徑≤0.5 cm；B 級（2 分）：食管黏膜有破損，但無融合，病灶長徑＞0.5 cm；C 級（3 分）：食管黏膜有破損且有融合，范圍小于食管周徑的75%；D 級（4 分）：食管黏膜有破損且有融合，范圍大于等于食管周徑的75%。繼以10%甲醛固定，石蠟包埋，4 μm 距離連續(xù)切片，HE 染色，光學顯微鏡下專人盲法觀察病理改變，并進行病理分級[9]及評分：正常（0 分）；輕度（1 分）：鱗狀上皮增生，黏膜固有層乳頭延伸，上皮細胞層內(nèi)炎癥細胞浸潤；中度（2 分）：鱗狀上皮增生，黏膜固有層乳頭延伸，上皮細胞層內(nèi)炎癥細胞浸潤，黏膜糜爛；重度（3 分）：鱗狀上皮增生，黏膜固有層乳頭延伸，上皮細胞層內(nèi)炎癥細胞浸潤，潰瘍形成，伴或不伴Barrett 食管改變。

1.4.3 免疫組化法測定PAR-2、E-鈣黏蛋白的表達將食管組織從組織固定液內(nèi)取出，進行脫水、石蠟包埋、切片。嚴格按照免疫組化說明書步驟操作，用免疫組化法測定食管組織PAR-2、E-鈣黏蛋白的表達；應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析系統(tǒng)，選用陽性區(qū)域積分光密度及陽性面積對免疫組化進行統(tǒng)計分析，計算陽性表達的平均光密度。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，兩組間比較采用t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P <0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況

造模期間，模型組大鼠毛色欠光澤，抓取時易脫落，倦怠喜臥，進食量少；藥物干預(yù)4 周后，與模型組比較，給藥組精神狀態(tài)較好，行為較活躍，毛色稍光澤，進食量一般。實驗過程中正常組大鼠死亡1 只，模型組、西藥組各死亡4 只，膽胃方低、中劑量組各死亡3 只，膽胃方高劑量組死亡5 只。

2.2 各組大鼠洛杉磯分級積分及病理分級積分比較

與正常組比較，模型組大鼠洛杉磯分級積分及病理分級積分升高，差異有統(tǒng)計學意義（P <0.05）；與模型組比較，西藥組、膽胃方低劑量組大鼠洛杉磯分級積分及病理分級積分降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

表1 各組大鼠洛杉磯分級積分及病理分級積分比較（分，）

表1 各組大鼠洛杉磯分級積分及病理分級積分比較（分，）

注：與正常組比較，aP <0.05；與模型組比較，bP <0.05

2.3 各組大鼠PAR-2、E-鈣黏蛋白免疫組化結(jié)果

PAR-2、E-鈣黏蛋白正常表達于上皮細胞，呈完整的胞膜表達，鏡下見棕黃色顆粒狀為表達陽性。與正常組比較，模型組陽性顆粒數(shù)、面積、密度及顏色強度明顯增加。與模型組比較，除膽胃方高劑量組外，其他給藥組陽性顆粒數(shù)、面積、密度及顏色強度減少。見圖1～2。

圖1 各組大鼠蛋白酶激活受體-2 免疫組化結(jié)果（400×）

圖2 各組大鼠E-鈣黏蛋白免疫組化結(jié)果（400×）

2.4 各組大鼠食管組織PAR-2、E-鈣黏蛋白平均光密度值比較

與正常組比較，模型組大鼠食管組織PAR-2、E-鈣黏蛋白平均光密度值升高，差異有統(tǒng)計學意義（P <0.05）；與模型組比較，西藥組、膽胃方低劑量組及膽胃方中劑量組大鼠食管組織PAR-2 平均光密度值降低，西藥組、膽胃方低劑量組大鼠食管組織E-鈣黏蛋白平均光密度值降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與膽胃方低劑量組比較，膽胃方中、高劑量組大鼠食管組織PAR-2、E-鈣黏蛋白平均光密度值升高，差異有統(tǒng)計學意義（P <0.05）。見表2。

表2 各組大鼠食管組織PAR-2、E-鈣黏蛋白平均光密度值比較（）

表2 各組大鼠食管組織PAR-2、E-鈣黏蛋白平均光密度值比較（）

注：與正常組比較，aP <0.05；與模型組比較，bP <0.05；與膽胃方低劑量組比較，cP <0.05。PAR-2：蛋白酶激活受體-2

3 討論

難治性GERD 目前仍是臨床亟待解決的難題，宋冰等[10]運用24 h 食管多通道腔阻抗-pH 監(jiān)測GERD患者，發(fā)現(xiàn)難治性GERD 患者反流以弱酸反流及堿反流為主，而GERD 以酸反流為主。難治性GERD 治療常用中和膽酸、促胃腸動力、保護黏膜等，雖有效果但常不理想，而中醫(yī)辨證治療常有意外療效。膽胃方由柴胡、郁金、香附、青皮、陳皮、黃連、吳茱萸、黃芩、海螵蛸、白芍、浙貝母、白及、枳殼、炒谷芽、炒麥芽、甘草等組成，具有疏肝和胃、清熱化瘀的功效，臨床主要用于堿性胃食管反流?。―GER、DER）、膽汁反流性胃炎[11-12]等證屬肝胃不和的治療。該方來源于江蘇省名中醫(yī)田耀洲教授，為南京中醫(yī)藥大學附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院院內(nèi)制劑，使用10 余年，療效確切。課題組前期用膽胃方治療DGER 效果較好，本研究是對其可能的作用機制進行探討。

PAR-2 是一種與G 蛋白相偶聯(lián)的蛋白受體，可促進炎癥因子釋放[13]。嚴滿等[14]研究顯示PAR-2 會使食管下括約肌壓力降低，增強食管下括約肌的松弛度，是GERD 發(fā)生的因素之一。多項研究結(jié)果顯示PAR-2 通過多種途徑參與GERD 的發(fā)病[15-16]。本研究顯示，DER 大鼠食管組織中PAR-2 表達高于正常組；與模型組比較，西藥組、膽胃方低劑量組及膽胃方中劑量組大鼠食管組織PAR-2 平均光密度值降低（P <0.05）。E-鈣黏蛋白是細胞間連接的重要組成部分，與緊密連接蛋白相連共同維持細胞功能[17]。Jovov 等[18-19]研究發(fā)現(xiàn)，缺乏E-鈣黏蛋白的白鼠模型中食管黏膜存在細胞間隙增寬，說明E-鈣黏蛋白與食管黏膜的細胞間隙增寬有一定關(guān)系；同時，E-鈣黏蛋白的裂解產(chǎn)物還可作為NERD 的生物標記。本研究顯示，DER大鼠食管組織中E-鈣黏蛋白表達高于正常組；與模型組比較，西藥組、膽胃方低劑量組大鼠食管組織E-鈣黏蛋白平均光密度值降低（P <0.05）。膽胃方能明顯降低DER 大鼠食管黏膜PAR-2、E-鈣黏蛋白的表達，這可能是膽胃方治療DER 的機制之一。

諸多研究發(fā)現(xiàn)，E-鈣黏蛋白表達的缺失與腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移有關(guān)[20-23]。然而本研究結(jié)果與上述并不一致，模型組大鼠E-鈣黏蛋白表達較正常組顯著升高，給藥干預(yù)后其表達降低。筆者查閱文獻后發(fā)現(xiàn)E-鈣黏蛋白與炎癥的關(guān)系觀察結(jié)果并不統(tǒng)一，如E-鈣黏蛋白與子宮內(nèi)膜異位癥呈正相關(guān)[24]；胃蘇顆粒治療慢性胃炎能有效降低胃黏膜E-鈣黏蛋白表達[25-26]。因此，闡釋這一現(xiàn)象為課題組今后深入研究提供了思路。

另外，本研究顯示，與膽胃方低劑量組比較，膽胃方中、高劑量組大鼠食管組織PAR-2、E-鈣黏蛋白平均光密度值升高（P <0.05）。提示膽胃方低劑量組（成人每天用藥等效量）效果最好，而膽胃方中劑量組、高劑量組效果一般，可能的原因是隨著給藥濃度增加，高濃度的藥物灌入食管也是個刺激因素，反而會造成食管黏膜的損傷，加重炎癥反應(yīng)。

綜上所述，膽胃方對DER 的治療作用可能是通過降低食管組織PAR-2 及E-鈣黏蛋白的表達從而改善食管黏膜炎癥及病理來實現(xiàn)的。膽胃方影響PAR-2 及E-鈣黏蛋白表達的具體機制有待于更深層次的研究。