李雅琳，李素艷，孫向陽(yáng)，郝 丹，蔡琳琳，常曉彤

（北京林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，北京 100083）

園林綠化廢棄物包括樹木、花草等植物在生長(zhǎng)過(guò)程中的自然凋落物或者人為修剪的植物殘?bào)w[1]，主要成分有木質(zhì)素、纖維素和多糖等[2]。其中，木質(zhì)素由于組分種類多樣，結(jié)構(gòu)復(fù)雜且無(wú)規(guī)則，降解比較困難[3-5]。堆肥是一種較好的降解園林綠化廢棄物的方式[6]，堆肥過(guò)程中多個(gè)微生物群體共同作用，分泌木質(zhì)素降解相關(guān)酶系而使園林綠化廢棄物中的木質(zhì)素降解[7]。因此，通過(guò)研制微生物菌劑，使分泌木質(zhì)素降解酶酶系的菌株迅速構(gòu)建優(yōu)勢(shì)群落，能有針對(duì)性地加快園林綠化廢棄物中木質(zhì)素的降解，提高堆肥效率和質(zhì)量[8-9]。但是，新菌劑的制備需要在選定目標(biāo)菌株的條件下，對(duì)菌劑制作涉及的培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化過(guò)程主要包括試驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)學(xué)建模和優(yōu)化設(shè)計(jì)3個(gè)部分[10]。合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)能用較少的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行建模，從而獲取各因素范圍內(nèi)的最優(yōu)解。用于發(fā)酵條件優(yōu)化的方法多為響應(yīng)面法[11-12]，但胡欣穎等[13]研究發(fā)現(xiàn)：人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法比響應(yīng)面法在預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果方面更準(zhǔn)確，誤差更小。目前，運(yùn)用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法對(duì)木質(zhì)素降解菌發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化的研究鮮有報(bào)道。因此，本研究擬從北京市植物園的腐葉土和朽木中篩選木質(zhì)素降解菌，對(duì)其進(jìn)行鑒定，并通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)菌株的培養(yǎng)時(shí)間、接種量和培養(yǎng)基配方(碳源和氮源)進(jìn)行優(yōu)化；采用均勻試驗(yàn)結(jié)合Python實(shí)現(xiàn)人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建模與優(yōu)化，尋找菌株最佳發(fā)酵條件，為園林綠化廢棄物中木質(zhì)素的降解提供高效菌劑。

1 材料與方法

1.1 材料

腐葉土和朽木采集于北京市植物園。PDA培養(yǎng)基：稱取200.00 g土豆，去皮去芽切成小塊后加蒸餾水微沸30 min，保留濾液并用蒸餾水補(bǔ)足1 L，制成馬鈴薯浸汁；葡萄糖 20.00 g，蛋白胨15.00 g，瓊脂20.00 g，pH自然[14]。PDA-苯胺藍(lán)培養(yǎng)基：稱取0.10 g苯胺藍(lán)溶于1 L PDA培養(yǎng)基中，pH自然。PDA-愈創(chuàng)木酚培養(yǎng)基：量取0.1 mL愈創(chuàng)木酚溶于1 L PDA培養(yǎng)基中，pH自然。PDB液體培養(yǎng)基：馬鈴薯浸汁(同PDA培養(yǎng)基)，葡萄糖 20.00 g，蛋白胨15.00 g，pH自然。基本發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10.00 g·L-1、蛋白胨 5.00 g·L-1，酵母粉 3.00 g·L-1、酒石酸銨 10.00 g·L-1、五水合硫酸銅 0.25 g·L-1、氯化鈉 1.00 g·L-1、pH自然[15]。所有培養(yǎng)基均121 ℃高壓蒸汽滅菌 20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離與篩選 將采集的樣品搗碎[16]，稱取10.00 g加入裝有90 mL無(wú)菌水的三角瓶中，在28 ℃、200 r·min-1下震蕩搖勻后靜置1 h。取上清液1.0 mL稀釋成不同質(zhì)量濃度梯度(10-3～10-7g·L-1)的溶液，取不同質(zhì)量濃度稀釋液0.1 mL，加入PDA培養(yǎng)基中涂布均勻，28 ℃下培養(yǎng)5～7 d，觀察菌落形態(tài)，用平板劃線分離法純化菌株。將得到的純菌株以點(diǎn)接法接到PDA-苯胺藍(lán)平板和PDA-愈創(chuàng)木酚平板中，用苯胺藍(lán)平板褪色圈法和愈創(chuàng)木酚平板變色圈法確定該菌株是否具有降解木質(zhì)素的能力。

1.2.2 菌株的鑒定 觀察PDA-苯胺藍(lán)平板上菌體形態(tài)特征，并挑取少量菌絲于顯微鏡下拍照記錄。菌株送往北京睿博興科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的真菌序列BLAST檢索對(duì)比，采用 Mega 5.0 軟件與相近種菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[17]。

1.2.3 種子液的制備 將菌株接種至裝有100.0 mL PDB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在IS-RDD3臺(tái)式恒溫振蕩器中以30 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)3 d，制得種子液。

1.2.4 測(cè)定指標(biāo) 木質(zhì)素過(guò)氧化物酶、錳過(guò)氧化物酶和漆酶活性的測(cè)定參照田林雙[18]的方法。3種木質(zhì)素降解相關(guān)酶酶活性總和標(biāo)記為總酶活。生物量的測(cè)定用稱干質(zhì)量法[19]。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007和SPSS 22.0進(jìn)行處理。發(fā)酵條件優(yōu)化用單因素方差分析法，平均值多重比較用LSD最小顯著性差異法(P＜0.05)。均勻試驗(yàn)利用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)[20]建模與優(yōu)化(基于深度學(xué)習(xí)框架Pytorch[21])。將本實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)建模為回歸任務(wù)，并采用SmoothL1損失函數(shù)[22]以平滑訓(xùn)練過(guò)程。訓(xùn)練過(guò)程中，采用k-折交叉驗(yàn)證(k-fold cross-validation)和自適應(yīng)矩估計(jì)(Adam)算法[23]優(yōu)化神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果與討論

2.1 木質(zhì)素降解菌的篩選

PDA-苯胺藍(lán)平板上褪色圈的出現(xiàn)表示該菌株具有分泌錳過(guò)氧化物酶和木質(zhì)素過(guò)氧化物酶的能力，PDA-愈創(chuàng)木酚平板上顯色圈的出現(xiàn)表示該菌株具有分泌漆酶的能力[24]。由表1可知：篩選得到的22株菌(分別命名為Q01～Q22)中，共有10株菌出現(xiàn)褪色圈或/和顯色圈。其中：Q01、Q02、Q09和Q11既能出現(xiàn)褪色圈又能出現(xiàn)顯色圈，說(shuō)明這些菌株具備分泌3種木質(zhì)素降解酶的能力。根據(jù)褪色圈和顯色圈的出現(xiàn)時(shí)間及直徑可知(表1)，Q01于48 h時(shí)在PDA-苯胺藍(lán)平板上出現(xiàn)褪色圈，12 h時(shí)在PDA-愈創(chuàng)木酚培養(yǎng)基上出現(xiàn)顯色圈，在72 h時(shí)顯色圈最大，因此，選定菌株Q01為目標(biāo)菌株。

表1 不同菌株選擇培養(yǎng)基的顯色和褪色結(jié)果Table 1 Coloring and decoloring results of different strains on selective mediums

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 菌株 Q01的形態(tài)特征及顯微觀察 菌株Q01在PDA-苯胺藍(lán)平板上的菌落形態(tài)為白色圓形，菌絲為致密的短絨狀，向四周擴(kuò)展，緊貼平板生長(zhǎng)(圖1A、圖1B)；前期生長(zhǎng)較慢，1～2 d有菌絲長(zhǎng)出，此后生長(zhǎng)較快，3～5 d鋪滿整個(gè)平板。顯微形態(tài)可見，菌絲較細(xì)長(zhǎng)，有分支(圖1C)，孢子呈球狀或柱狀(圖1D)，菌絲可觀察到隔膜和鎖狀聯(lián)合(圖1E，如箭頭所示)。

圖1 菌株Q01在選擇培養(yǎng)基中顯色和褪色表現(xiàn)及顯微鏡觀察Figure 1 Color development and fading performance of strain Q01 in selective medium and microscopic observation

2.2.2 菌株Q01的ITS序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹 構(gòu)建菌株Q01系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)可知：菌株Q01與栓菌屬Trametes真菌的同源性相似度最高，達(dá)到100%。結(jié)合形態(tài)特征可確定菌株Q01為栓菌屬真菌。

圖2 基于ITS 序列構(gòu)建的菌株Q01系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 2 Phylogenetic tree of strain Q01 constructed based on ITS sequence

2.3 液態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.3.1 培養(yǎng)時(shí)間的優(yōu)化 分別在12瓶100 mL基本發(fā)酵培養(yǎng)基中接種體積分?jǐn)?shù)為12.5%的菌株Q01種子液，于30 ℃、200 r·min-1下培養(yǎng)，每24 h取出1瓶，測(cè)量菌株木質(zhì)素降解相關(guān)酶活性和1 mL菌液中生物量的干質(zhì)量。由圖3可知：3種木質(zhì)素降解相關(guān)酶的酶活性達(dá)到最高值時(shí)間不同，其中漆酶活性在培養(yǎng)5 d時(shí)達(dá)最高(3 835.25×16.67 nkat·L-1)，錳過(guò)氧化物酶活性在培養(yǎng)2 d時(shí)達(dá)最高(1 690.60×16.67 nkat·L-1)，木質(zhì)素過(guò)氧化物酶活性在培養(yǎng)8 d時(shí)達(dá)到最高(1 096.88×16.67 nkat·L-1)。3種木質(zhì)素降解相關(guān)酶在木質(zhì)素降解中具有同樣重要的作用[25]，但不同木質(zhì)素降解酶活性最高值時(shí)間不同，因此以3種木質(zhì)素降解相關(guān)酶的總酶活性作為確定培養(yǎng)時(shí)間的依據(jù)。隨著木質(zhì)素降解，真菌生物量逐漸增多[26]。圖3可知：菌株Q01的總酶活性與生物量均在培養(yǎng)5 d時(shí)最高，因此選擇培養(yǎng)時(shí)間為5 d進(jìn)行后續(xù)研究。

圖3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)生木質(zhì)素降解相關(guān)酶及生物量的影響Figure 3 Changes in culture time to the enzymes and biomass related to lignin degradation produced by the strain

2.3.2 接種量的優(yōu)化 分別在100 mL 基本發(fā)酵培養(yǎng)基中接種體積分?jǐn)?shù)為5.0%、7.5%、10.0%、12.5%和15.0%的種子液，于30 ℃、200 r·min-1下培養(yǎng)5 d，測(cè)定菌株木質(zhì)素降解相關(guān)酶活性和菌株生物量。由圖4可知：總酶活性在菌液體積分?jǐn)?shù)為12.5%時(shí)最高，達(dá)到5 129.80×16.67 nkat·L-1。隨菌液體積分?jǐn)?shù)增加，菌株生物量呈先上升后下降趨勢(shì)，體積分?jǐn)?shù)為12.5%時(shí)達(dá)到最高。與繆曉磊[19]對(duì)竹林毛栓菌Trametessp. 接種量?jī)?yōu)化的結(jié)果一致?？梢娋甑姆敝乘俣仁芙臃N量影響，當(dāng)接種量較少時(shí)，菌株需要更多時(shí)間適應(yīng)環(huán)境后繁殖生長(zhǎng)；而接種量較多時(shí)，大量菌株接觸新環(huán)境，迅速繁殖，使液體培養(yǎng)基黏稠不透氣，溶解氧下降，影響菌株的后續(xù)生長(zhǎng)[19]。因此，綜合總酶活性和生物量的變化，選取體積分?jǐn)?shù)12.5%為最適接種量。

圖4 接種量對(duì)菌株產(chǎn)生木質(zhì)素降解相關(guān)酶及生物量的影響Figure 4 Changes in the amount of inoculum to produce lignin degradation related enzymes and biomass

2.3.3 培養(yǎng)基碳源的優(yōu)化 以基本發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照，分別用 10.00 g·L-1蔗糖、麥芽糖、木質(zhì)素磺酸鈉和可溶性淀粉替代對(duì)照中10.00 g·L-1的葡萄糖，接種體積分?jǐn)?shù)為12.5%，于30 ℃、200 r·min-1下培養(yǎng)5 d。由圖5可知：以葡萄糖為碳源時(shí)，菌株Q01漆酶活性達(dá)3 675.23×16.67 nkat·L-1，顯著高于其他碳源(P＜0.05)；認(rèn)為簡(jiǎn)單的糖有利于菌體生長(zhǎng)[27]，可以縮短漆酶的生產(chǎn)時(shí)間，與劉宇等[15]結(jié)果相似。但就總酶活性和生物量而言，以木質(zhì)素磺酸鈉為碳源對(duì)菌株Q01生長(zhǎng)和木質(zhì)素降解相關(guān)酶分泌效果最好，最顯著(P＜0.05)，其中總酶活性為6 474.16×16.67 nkat·L-1，總生物量為0.065 g?？赡茉蚴莵?lái)源于木質(zhì)素的木質(zhì)素磺酸鈉能刺激菌株Q01分泌木質(zhì)素過(guò)氧化物酶和錳過(guò)氧化物酶，并促進(jìn)細(xì)胞快速生長(zhǎng)，使生物量最高，與熊乙[28]研究結(jié)果相似。綜合考慮各碳源生產(chǎn)成本及對(duì)菌株Q01生長(zhǎng)的促進(jìn)效果，選擇木質(zhì)素磺酸鈉為菌株Q01的液體培養(yǎng)基碳源。

圖5 碳源對(duì)菌株產(chǎn)生木質(zhì)素降解相關(guān)酶及生物量的影響Figure 5 Effect of carbon source on lignin degradation related enzymes and biomass produced by the strain

2.3.4 培養(yǎng)基氮源的優(yōu)化 以基本發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照，有效含氮量按1.52 g·L-1進(jìn)行換算，分別用7.00 g·L-1的豆餅粉、6.50 g·L-1尿素、14.30 g·L-1硫酸銨、11.00 g·L-1硝酸鉀替代對(duì)照組中的酒石酸銨，發(fā)酵培養(yǎng)條件為30 ℃、200 r·min-1，培養(yǎng)5 d。由圖6可知：以豆餅粉為有機(jī)氮源發(fā)酵時(shí)，菌株Q01總酶活性最高、生物量最大，與其他無(wú)機(jī)氮源差異顯著(P＜0.05)。豆餅粉營(yíng)養(yǎng)豐富，含大量碳水化合物、蛋白質(zhì)及少量異黃酮類物質(zhì)和可溶性多糖，可作為發(fā)酵氮源及生長(zhǎng)因子。有研究表明[29]：在培養(yǎng)某些真菌時(shí)，培養(yǎng)基中添加豆餅粉有利于生物量的積累。綜合考慮各氮源生產(chǎn)成本及對(duì)菌株Q01生長(zhǎng)的促進(jìn)效果，選擇豆餅粉作為菌株Q01的液體培養(yǎng)基氮源。

圖6 氮源對(duì)菌株產(chǎn)生木質(zhì)素降解相關(guān)酶及生物量的影響Figure 6 Effect of nitrogen source on lignin degradation related enzymes produced by the strain and biomass

2.3.5 均勻試驗(yàn)結(jié)合Python實(shí)現(xiàn)人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建模與優(yōu)化 均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)6因素5水平的10組試驗(yàn)，獲取實(shí)測(cè)值，再通過(guò)基于SmoothL1損失函數(shù)的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的訓(xùn)練及自適應(yīng)矩估計(jì)(Adam)算法尋優(yōu)，得到仿真值。對(duì)比實(shí)測(cè)值和仿真值(表2)可知：3種酶活性誤差均小于10.0%，生物量的仿真值基本與觀察值相同，可知該模型預(yù)測(cè)值可信賴。

表2 均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Uniform test design and results

2.3.6 優(yōu)化后菌株木質(zhì)素降解相關(guān)酶活性及生物量 根據(jù)模型預(yù)測(cè)得到最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基組成并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。由表3可知：優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基酶活性和生物量，實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值誤差約為3.0%；結(jié)合圖3可知：優(yōu)化前錳過(guò)氧化物酶活性為357.29×16.67 nkat·L-1、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶活性為445.27×16.67 nkat·L-1、總酶活性為4 637.81×16.67 nkat·L-1、生物量為0.071 g；即在優(yōu)化培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌株Q01，其生物量比優(yōu)化前提高1.27倍，錳過(guò)氧化物酶活性提高31.71倍，木質(zhì)素過(guò)氧化物酶活性提高19.12倍，總木質(zhì)素酶酶活性提高4.38倍。

表3 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)尋優(yōu)結(jié)果Table 3 Optimization results of artificial neural network

3 結(jié)論

通過(guò)苯胺藍(lán)平板褪色圈法和愈創(chuàng)木酚平板變色圈法篩選出目標(biāo)菌株Q01。經(jīng)鑒定，菌株Q01為栓菌屬Trametes真菌。實(shí)驗(yàn)證明人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型預(yù)測(cè)結(jié)果可值得信賴。根據(jù)單因素試驗(yàn)和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法結(jié)果，確定菌株Q01的最優(yōu)發(fā)酵條件：培養(yǎng)時(shí)間5 d，溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速200 r·min-1，接種菌液體積分?jǐn)?shù)為12.5%，培養(yǎng)基配方為木質(zhì)素磺酸鈉14.00 g·L-1、蛋白胨12.30 g·L-1、酵母粉5.00 g·L-1、豆餅粉3.00 g·L-1、五水合硫酸銅 0.12 g·L-1、氯化鈉 0.53 g·L-1、pH 自然。

菌株Q01在優(yōu)化后的發(fā)酵條件下制得的液體菌劑具有高酶活性和高生物量的特點(diǎn)，可促進(jìn)園林綠化廢棄物堆體初始微生物的數(shù)量增長(zhǎng)，提高木質(zhì)素降解相關(guān)酶的酶活性，加快木質(zhì)素的降解。